張爾力（湖南警察學(xué)院，湖南　長(zhǎng)沙　410138）

EDC/NHS法制備免疫磁珠及其效果驗(yàn)證

張爾力（湖南警察學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410138）

免疫磁珠又叫免疫磁性微球，是免疫學(xué)和磁性微球結(jié)合而發(fā)展的一類新型材料，一般用于物質(zhì)的提取和分離，由于其高效、低毒等特性，目前在生物化學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)藥領(lǐng)域、食品檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。本文主要應(yīng)用EDC/NHS法活化羧基磁珠，再將人類精子特異性抗體與之偶聯(lián)，最后制備成免疫磁珠，進(jìn)行細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)，分別捕獲人類的上皮細(xì)胞和精子，提取DNA，進(jìn)行PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），進(jìn)行電泳，根據(jù)STR（短串聯(lián)重復(fù)）圖譜的對(duì)比驗(yàn)證了這種方法制備的免疫磁珠的偶聯(lián)效果。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用EDC/NHS法活化制備的免疫磁珠能選擇性地捕獲到精子而不能捕獲到上皮細(xì)胞，該方法制備磁珠效果良好。

新型材料；免疫磁珠；細(xì)胞分離與提純；PCR；STR

磁性分離技術(shù)在工業(yè)上的應(yīng)用已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史，1979年John Ugelstad［1］等制備了具有超順磁性聚苯乙烯微球，并將其磁化與抗體連接成分離細(xì)胞效果很好的免疫磁珠，使這一技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域開始得到應(yīng)用。近年來，免疫磁珠分選細(xì)胞技術(shù)憑借其高效快速、簡(jiǎn)便易行、無毒無害、低成本、分離純度高、保留細(xì)胞活性等特點(diǎn)，已被應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)診斷，分離和檢測(cè)各種腫瘤細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、血細(xì)胞、細(xì)菌及其他微生物等方面。

抗體與磁性微球的偶聯(lián)是將單克隆抗體與帶有功能基團(tuán)的磁珠偶聯(lián)，抗體與磁珠連接的方式有兩種：共價(jià)偶聯(lián)（covalent coupling）和物理吸附（physicalabsorption）。物理吸附非常不穩(wěn)定，在一定的條件下很容易脫落，而共價(jià)偶聯(lián)是抗體與磁珠表面的基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使抗體穩(wěn)固地結(jié)合在磁珠上。磁珠上的醛基、環(huán)氧基等基團(tuán)可以直接和目標(biāo)分子上的氨基結(jié)合，而含其他基團(tuán)的磁珠則需要進(jìn)行活化才能與目標(biāo)分子連接。常用的活化方法有：碳二亞胺法、重氮法、烴化法、溴化氰法、戊二醛法、伍德沃德試劑K法等［2］。Molday等［3］把含有羧基的磁性聚合物微球用熒光染料作上標(biāo)記，經(jīng)碳二亞胺活化，在微球表面偶聯(lián)抗體或外源凝集素，對(duì)人紅血細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞進(jìn)行了成功分離。國(guó)內(nèi)劉輝榮等［4］用EDC和NHS活化磁珠表面羧基，再和抗體的氨基反應(yīng)，這樣將抗體與磁珠偶聯(lián)，并用了多種方法檢驗(yàn)磁珠與抗體的結(jié)合率。精子特異性抗體的特性是只能與精子膜特異性抗原反應(yīng)而不能與上皮細(xì)胞膜蛋白反應(yīng)。本文采用EDC/NHS法表面抗體修飾羧基磁珠來制備精子特異性抗體免疫磁珠，用細(xì)胞捕獲的方法來驗(yàn)證磁珠的制備效果。

1　方法原理

EDC/NHS法表面抗體修飾羧基磁珠的原理：基磁珠表面所含的羧基（-COOH）先與現(xiàn)配的EDC溶液反應(yīng)，生成不穩(wěn)定的氨基活性O(shè)-?；逯虚g體，該中間體可以有三種轉(zhuǎn)化途徑：第一種是與溶液中的水反應(yīng)，還原成羧基磁珠；第二種是與抗體的氨基（-NH2）反應(yīng)，直接生成免疫磁珠；第三種是不穩(wěn)定的氨基活性O(shè)-?；逯虚g體與NHS反應(yīng)，生成半穩(wěn)定的氨基反應(yīng)活性NHS酯，該產(chǎn)物再與抗體上的氨基反應(yīng)，生成免疫磁珠。本實(shí)驗(yàn)偶聯(lián)抗體是通過第三種轉(zhuǎn)化途徑。

2　主要儀器和試劑

EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺），北京中生瑞泰有限公司；NHS（N-羥基琥珀酰亞胺），北京中生瑞泰有限公司；MES（2-嗎啉乙磺酸），北京中生瑞泰有限公司；EDC溶液：將EDC溶解在冷的25mmol/LMES，pH=5中，EDC終濃度50mg/mL；NHS溶液：將NHS溶解在冷的25mmol/LMES，pH=5中，NHS終濃度50mg/mL；含有0.1%BSA和0.1%Tween-20的PBS溶液：在PBS中加入BSA和Tween-20，使BSA和Tween-20分別占總?cè)芤嘿|(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.1%；含有0.1%BSA的PBS溶液：在PBS中加入的BSA，使BSA占總?cè)芤嘿|(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.1%；0.05mol/ L pH=7.4 Tris溶液：將0.79g TrisHcl加入到90mL蒸餾水中，調(diào)pH值為7.4；100mmol/L pH=5MES溶液：將2.13gMES加入90mL蒸餾水中，pH值為5；AmpFlSTR?Identifiler plus PCR擴(kuò)增試劑盒包含，美國(guó)Applied Biosystems公司；QIAamp DNAM48提取試劑盒；②磁性分離架，美國(guó)Promega公司；Dynabeads?M-270CarboxylicAcid羧基磁珠，美國(guó)Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒，中國(guó)Solarbio公司；Nanodrop_2000c超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo公司；③Anti-JLP抗體，英國(guó)abcam公司；④采集健康成年女性的口腔上皮細(xì)胞和健康成年男性的精子，分別制備成細(xì)胞數(shù)約104的細(xì)胞懸液。

3　實(shí)驗(yàn)方法

免疫磁珠制備有兩個(gè)主要步驟，第一步是未偶聯(lián)抗體的磁性微球的制備，第二步是抗體與磁性微球的偶聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)采用美國(guó)Invitrogen公司的商品化磁珠Dynabeads?M-270CarboxylicAcid羧基磁珠偶聯(lián)抗體，減少了磁性微球的制備這一過程，直接使用已經(jīng)制備成功的穩(wěn)定的羧基功能化磁珠與所選抗體偶聯(lián)。

表1　免疫磁珠捕獲兩種細(xì)胞成功次數(shù)對(duì)比

3.1EDC/NHS活化羧基磁珠

將EP管置于磁力架上4min，待磁珠和溶液固液分離，在剩下裝有磁珠的EP管中加入50μL 25mmol/LPH=5的MES溶液，充分振蕩混合10min，固液分離，重復(fù)一次；在洗滌過的磁珠中加入25μL現(xiàn)配的EDC溶液和25μLNHS溶液，充分混合均勻，25℃孵育30min；固液分離，向EP管中加入50μL 25mmol/L PH=5的MES溶液，充分混合，固液分離，重復(fù)洗滌磁珠一次。

3.2已活化磁珠偶聯(lián)抗體反應(yīng)基本步驟

將30μL抗體（濃度1mg/mL）加入到30μL 25mmol/L MES，PH=5中，加入已活化的磁珠中，振蕩混勻，加入40μL 25mmol/LPH=5的MES溶液后置于渦旋振蕩器上振蕩確保充分混合?；旌衔镌?5℃孵育1h，將EP管放在磁力架上4min。磁珠中加入100μL 50mmol/L PH=7.4的Tris溶液，將EP管置于25℃孵育15min，期間緩慢旋轉(zhuǎn)振蕩，避免磁珠沉淀。15min后固液分離，移除液體成分。加入100μL含0.1%BSA和0.1% Tween-20的PBS溶液，將EP管置于渦旋振蕩儀上，充分振蕩搖勻，后將EP管置于磁力架上4min，固液分離，移除液體成分，如此重復(fù)4次。之后，將磁珠懸浮在50μL含有0.1%BSA的PBS緩沖液中。

3.3細(xì)胞捕獲驗(yàn)證

首先按照上文中的方法制備104數(shù)量級(jí)的人精子懸液和人上皮細(xì)胞懸液，取1μL（上皮細(xì)胞懸液取100μL）加入EP管中，計(jì)數(shù)兩種細(xì)胞數(shù)量大致相同，再向EP管中加入10μL免疫磁珠，25℃孵育60min后，固液分離，將余下磁珠盡量完全吸出轉(zhuǎn)移至一新管，用500μL含有0.1%BSA的PBS緩沖液洗滌三次，余下的磁珠進(jìn)行捕獲到的細(xì)胞的DNA提取。每種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次。

3.4DNA的擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測(cè)

用AmpFlSTR?Identifiler Plus PCR擴(kuò)增試劑盒10μL體系擴(kuò)增提取出的DNA樣本。然后再將整個(gè)體系放入熱循環(huán)儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性11min；94℃變性20s，59℃退火3min，循環(huán)29次；60℃終延伸30min，15℃保持。每組均設(shè)置陽性（9947A）和陰性（空白）對(duì)照。在3130XL型遺傳分析儀上根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

4　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用GenMapper IDv3.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將所得的分型與樣本提供者進(jìn)行比對(duì)（表1），將有13個(gè)以上基因座分型與精子供者一致，并且各等位基因峰高大于50RFUs定為分型正確的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果用SPSS20統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P＜0.05，制備出的免疫磁珠對(duì)兩種細(xì)胞的捕獲結(jié)果的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Anti-JLP抗體免疫磁珠捕獲精子的成功率為100%，而成功捕獲上皮細(xì)胞的成功率為0。

5　結(jié)語

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用EDC/NHS法活化制備的免疫磁珠能選擇性地捕獲到精子而不能捕獲到上皮細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了預(yù)期效果，該方法制備磁珠效果良好。

［1］Ugelstad A.Process for preparing an aqueouse emulsion or dispersion of a party water-solublematerial and use of polymer particles prerared according to thisprocessasa toner in xerography［P］.EP0003905.1979-09-05.

［2］趙永芳.生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用［M］：第二版.武漢：武漢大學(xué)出版社，1994.238-241.

［3］Molday RS.Nature，1977，268:437-438.

［4］劉輝榮，徐宏，古宏晨.簡(jiǎn)便高效分離細(xì)胞新型免疫磁珠制備［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2008.24（11）：1349-1351.