吳堅平 楊立榮

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，杭州 310027）

生物催化技術(shù)在農(nóng)藥合成中的應(yīng)用

吳堅平 楊立榮

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，杭州 310027）

吳堅平，教授，研究方向為生物工程。

E-mail：wjp@zju.edu.cn

作者簡介

楊立榮，教授，研究方向為生物工程。

E-mail：lryang@zju.edu.cn

農(nóng)藥是最重要的農(nóng)業(yè)化學(xué)品之一，農(nóng)藥的加工和生產(chǎn)具有巨大的社會經(jīng)濟價值。農(nóng)藥的分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，現(xiàn)有農(nóng)藥制造過程普遍存在原料和能源消耗多、環(huán)境污染大等問題。利用生物技術(shù)實現(xiàn)農(nóng)藥的高效綠色制造，將成為解決上述問題的有效手段。主要介紹生物催化技術(shù)在除草劑、殺蟲劑、殺菌劑等農(nóng)藥制造中的研究、應(yīng)用情況及發(fā)展趨勢。

農(nóng)藥是最重要的農(nóng)業(yè)化學(xué)品之一，具有防治病蟲、調(diào)節(jié)植物生長和除草等作用，對現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展和世界糧食安全作出了巨大貢獻(xiàn)1～3。農(nóng)藥的加工和生產(chǎn)具有巨大的社會經(jīng)濟價值。據(jù)統(tǒng)計，2014年全球農(nóng)藥市場規(guī)模為566.55億美元，其中除草劑份額最大，其次為殺蟲劑和殺菌劑（表1）。

農(nóng)藥的分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，尤其在涉及一些選擇性要求較高的步驟時，合成難度大大增加，其制造過程普遍存在原料和能源消耗多、環(huán)境污染大等問題。生物制造技術(shù)具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、選擇性好等優(yōu)勢，是一種資源節(jié)約、環(huán)境友好的技術(shù)。利用生物制造技術(shù)實現(xiàn)農(nóng)藥的高效綠色制造，將成為解決上述問題的有效手段。文章主要介紹生物催化技術(shù)在除草劑、殺蟲劑、殺菌劑等農(nóng)藥制造中的研究及應(yīng)用情況，但不涉及生物農(nóng)藥的制造。

1 農(nóng)藥的生物制造方法

1.1 生物催化制造手性農(nóng)藥

表1 2014年全球各大類農(nóng)藥的銷售額及所占比例

手性是三維分子的基本屬性，如果一個分子不能與其鏡像重合，該分子就稱為手性分子?；瘜W(xué)品分子手性特征的不同往往表現(xiàn)出極不相同的生理和藥理效能。手性現(xiàn)象在農(nóng)藥分子中也是普遍存在的。世界上使用的2000多種農(nóng)藥中，約有25%是手性分子，但是它們中絕大多數(shù)以外消旋體形式出售和使用，制備成單一異構(gòu)體形式的只占7%4。農(nóng)藥以外消旋體形式銷售和使用時，會造成嚴(yán)重的對映體污染5。如除草劑異丙甲草胺，其（S）-異構(gòu)體具有非常高的除草性能，而（R）-異構(gòu)體不僅沒有除草作用，而且具有致突變作用。異丙甲草胺自1997年起以單一對映體形式上市，10年間減少向環(huán)境投放約1億噸化學(xué)廢物。只含有良好生物活性對映異構(gòu)體的光學(xué)純農(nóng)藥，具有藥效高、對作物與生態(tài)環(huán)境安全、市場競爭力強等特點，是2l世紀(jì)農(nóng)藥發(fā)展的主要方向之一46。

手性化學(xué)品的常用制造方法包括物理法、化學(xué)法和生物法。迄今為止，能完成最好的不對稱合成的，無疑應(yīng)首推自然界中的酶。生物制造因其無可比擬的選擇性為手性化學(xué)品制備提供了與眾不同的技術(shù)選擇和解決方案。在研的準(zhǔn)產(chǎn)業(yè)化規(guī)模的化學(xué)品生物制造過程中，至少有88%為手性化學(xué)品7。利用生物催化技術(shù)制備手性農(nóng)藥主要分為外消旋體拆分和不對稱合成兩種方法。外消旋體拆分法是利用酶催化外消旋體中不同對映體反應(yīng)速度的不同，實現(xiàn)對映體的分離。生物催化的動力學(xué)拆分是獲得對映體純手性化合物的重要手段之一，目前已經(jīng)通過生物催化拆分制備獲得了多種重要的手性農(nóng)藥或其中間體。和外消旋體拆分過程相比，生物催化的不對稱合成能夠?qū)⒌孜锶哭D(zhuǎn)化為所需要特定構(gòu)效的產(chǎn)物，效率高，使其成為合成手性化合物最具吸引力的研究領(lǐng)域。

1.2 生物催化制造非手性農(nóng)藥

在非手性農(nóng)藥制造中，主要是利用生物催化技術(shù)對已知農(nóng)藥進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，從而開發(fā)獲得新農(nóng)藥。這一過程目前主要還是采用化學(xué)修飾的方法，但隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，包括合成生物學(xué)、代謝工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程等技術(shù)，研究人員已經(jīng)能夠成功地采用生物催化方法來代替其中一些要求苛刻且產(chǎn)率低的步驟，如區(qū)域選擇性的氧化還原、羥基化和水解反應(yīng)等。

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2 生物制造技術(shù)在典型農(nóng)藥品種中的應(yīng)用

2.1 除草劑的生物制造

常用的除草劑根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，主要分為有機磷類、酰胺類、均三氮苯類、二苯醚類、脲類、磺酰脲類、氨基甲酸酯類、吡啶類、二硝基苯胺類、三氮苯酮類和芳氧丙酸類等數(shù)十種。目前有關(guān)生物催化技術(shù)在芳氧丙酸類和有機磷類除草劑合成中的應(yīng)用均有大量研究報道。

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2.1.1 芳氧丙酸類

芳氧丙酸類除草劑具有高效、低毒、除草譜廣、選擇性高、施用期長、對后茬作物安全等特點，是迄今為止性能最好的除草劑之一。S-2-氯丙酸（S-2-CPA）是芳氧丙酸類除草劑的重要組成部分，如茅草枯（dalapon）、2，4-滴丙酸（dichlorprop）、涕丙酸（fenoprop）、二甲四氯丙酸（mecoprop）、禾草枯（fluzaifop）、麥草伏（flamprop）、新燕靈（fenoxaprop）、草萘胺（napropamide）等。Klibanov等利用柱狀假絲酵母脂肪酶（candida cylindracea lipase，CCL）拆分外消旋體2-CPA，得到R-2-CPA丁酯及光學(xué)純的S-2-CPA，轉(zhuǎn)化率為42%時，對映體過量值（ee值）大于95%8。Dahod等利用CCL拆分2-氯丙酸甲酯，得到S-2-氯丙酸甲酯和R-2-氯丙酸，反應(yīng)產(chǎn)率為30%時，ee值為95%9。Taylor等采用R-2-鹵代酸脫鹵酶法生產(chǎn)S-2-CPA，將R-2-CPA轉(zhuǎn)化為S-乳酸，而S-2-CPA保留下來10。由于乳酸和2-CPA只需通過離子交換柱即可實現(xiàn)快速分離，可方便獲得光學(xué)活性S-2-CPA（圖1）。水解脫鹵酶法反應(yīng)不需要輔酶參與，產(chǎn)物ee值可達(dá)99%，是制備S-2-CPA的較佳方法，這一過程已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。通過對S-或R-2-鹵代酸脫鹵酶進(jìn)行克隆表達(dá)、構(gòu)效關(guān)系研究和分子改造，顯著提高了催化效率11～13。

2.1.2 草銨膦

草銨膦（phosphinothricin，PPT）化學(xué)名稱為2-氨基-4-［羥基（甲基）膦?；荻∷徜@，屬膦酸類、廣譜觸殺型除草劑，在土壤中易分解，對人類和動物的毒性較小，對環(huán)境的破壞力小。PPT有兩種光學(xué)異構(gòu)體，分別為L-PPT和D-PPT。但只有L-PPT具有植物毒性，除草活性為外消旋混合物的2倍。

早在研究草銨膦在土壤微生物體內(nèi)的代謝途徑時就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，L-PPT在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用被分解成一種α-酮酸——2-羰基-4-［羥基（甲基）膦?；荻∷幔ê喎QPPO）。轉(zhuǎn)氨作用是一個可逆反應(yīng)，PPO可在轉(zhuǎn)氨酶的催化下通過逆反應(yīng)生成L-PPT。Schulz等早在20世紀(jì)90年代就利用從E.coli K-12中分離到的轉(zhuǎn)氨酶，以PPO為底物，L-谷氨酸作為氨基供體，催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生產(chǎn)L-PPT（圖2），產(chǎn)物濃度可達(dá)76.1g/L，最高產(chǎn)率為50g（/L·h），L-PPT的ee值超過99.9%，轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%左右1415。

圖1 脫鹵酶催化拆分制備S-2-CPA

圖2 酶促不對稱合成L-PPT

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Bartsch等在上述單酶反應(yīng)體系下，增加一個草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶，組成雙轉(zhuǎn)氨酶偶聯(lián)反應(yīng)體系（圖3），利用L-天冬氨酸代替L-谷氨酸，L-天冬氨酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用后生成草酰乙酸，草酰乙酸在水溶液中不穩(wěn)定、易分解為丙酮酸，從而打破了轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的平衡，以提高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率16。隨后，Bartsch等在中國申請的專利中又提出了一條新工藝，他們篩選得到了能夠特異性地轉(zhuǎn)化2-羰基-4-（羥基甲基膦?；┒∷岬牟蒗Ｒ宜徂D(zhuǎn)氨酶，直接利用L-天冬氨酸為氨基供體，但是此工藝原料PPO反應(yīng)轉(zhuǎn)化率只有52%17。也有文獻(xiàn)報道利用谷氨酸脫氫酶催化PPO還原胺化生成L-PPT，反應(yīng)需要輔酶NADH參與，葡萄糖作為輔酶再生底物，但反應(yīng)效率不高18。鄭裕國等對生物法合成L-草銨膦的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述19。

圖3 雙轉(zhuǎn)氨酶偶聯(lián)反應(yīng)體系制備L-PPT

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2.2 殺蟲劑的生物制造

常用的殺蟲劑根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，主要分為有機磷類、有機氯類、氨基甲酸酯類、沙蠶毒素類、擬除蟲菊酯類、煙堿類和苯甲酰脲類等。目前關(guān)于生物催化制備擬除蟲菊酯類關(guān)鍵手性中間體的研究報道較多，且已經(jīng)實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。煙堿類殺蟲劑中間體的生物制造技術(shù)初見端倪，但要實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還需要在技術(shù)上取得更大的突破。

2.2.1 擬除蟲菊酯類

烯丙醇酮和炔丙醇酮是合成擬除蟲菊酯類殺蟲劑的重要手性中間體。目前已有大量有關(guān)酶催化拆分制備S-烯丙醇酮或S-炔丙醇酮的研究報道。利用脂肪酶選擇性轉(zhuǎn)酯化拆分外消旋乙烯丙醇酮和炔丙醇酮，或利用脂肪酶選擇性水解拆分對應(yīng)的外消旋乙酸酯，均可制備獲得所需S-構(gòu)型產(chǎn)物20～23。如程詠梅等在有機相中利用脂肪酶催化醇解反應(yīng)拆分外消旋炔丙醇酮乙酸酯，底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物ee值分別達(dá)到49.5%和99.5%24。浙江大學(xué)在全有機溶劑體系中利用化學(xué)-酶法高效制備S-烯丙醇酮并實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)25～27。

用脂肪酶催化的不對稱轉(zhuǎn)酯化和醇解反應(yīng)拆分制備S-α-氰基-3-苯氧基芐醇（S-CPBA），用于合成擬除蟲菊酯類殺蟲劑，國內(nèi)外均有成功的報道，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到49%，S-CPBA的對映體過剩值大于98%28。Inagaki等報道了一個將酶催化的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)與外消旋化作用結(jié)合起來的“酶催化的二級不對稱轉(zhuǎn)化”合成S-CPBA的好方法29。在堿性樹脂催化下，芳香醛與作為氫氰酸供體的丙酮氰醇進(jìn)行可逆氰基交換反應(yīng)，生成外消旋氰醇。在同一反應(yīng)容器中，S-CPBA被洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）脂肪酶?；Ｏ碌腞-CPBA為維護(hù)上述的可逆平衡便迅速發(fā)生外消旋化，不斷轉(zhuǎn)化為S構(gòu)型。這樣循環(huán)往復(fù)，外消旋氰醇就逐漸完全轉(zhuǎn)化為單一構(gòu)型的氰醇乙酸酯。產(chǎn)物的ee值高達(dá)94%，產(chǎn)率最高為96%。浙江大學(xué)針對這一反應(yīng)進(jìn)行了動力學(xué)研究和過程優(yōu)化，也取得了很好的效果3031。反應(yīng)歷程如圖4所示。

圖4 一鍋化法制備S-氰醇乙酸酯

2.2.2 煙堿類

新型煙堿類農(nóng)藥因其高效、作用范圍廣和對環(huán)境友好的優(yōu)勢，成為當(dāng)下農(nóng)藥開發(fā)的熱點，以取代活性日益下降的煙堿類農(nóng)藥。6-羥基煙酸和6-羥基-3-氰基吡啶分別是煙酸和3-氰基吡啶的衍生物，是合成新型煙堿類農(nóng)藥吡蟲啉、啶蟲脒等的重要中間體。在化學(xué)合成過程中存在著反應(yīng)條件復(fù)雜、產(chǎn)率低以及環(huán)境污染等一系列問題，極大限制了該類農(nóng)藥的規(guī)模化應(yīng)用。利用生物催化制備6-羥基煙酸和6-羥基-3-氰基吡啶逐漸成為研究熱點。Yasuda等從土壤中篩選到一株Comamonas testosteroni MCI2848，在5L的發(fā)酵罐中通入氧氣進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)40h得到57.2g/L的6-羥基-3-氰基吡啶32。以S.matcescensIFO 12648對煙酸進(jìn)行反應(yīng)，最終可以獲得301g/L的6-羥基煙酸33。而楊瑤等從土壤里篩選到一株Comamonas testosterone JA1，可以同時催化煙酸和3-氰基吡啶6-C的羥基化反應(yīng)，并首次報道了催化羥基化反應(yīng)發(fā)生的煙酸脫氫酶的基因序列，得到50.38g/L的6-羥基煙酸和5.77g/L的6-羥基-3-氰基吡啶34。

2.3 殺菌劑的生物制造

對植物病原物有殺死或抑制作用，但又不妨礙植物正常生長的藥劑稱為殺菌劑。根據(jù)殺菌劑的結(jié)構(gòu)不同，可以分為無機類、有機硫類、有機磷類、砷類、取代苯類、唑類、抗菌素類等。目前基本沒有關(guān)于生物催化制備殺菌劑的研究報道。從分子結(jié)構(gòu)來看，三唑醇類殺菌劑具有手性特征，都具有一個l，2，4-三唑環(huán)的結(jié)構(gòu)，其中1-N通過一個亞甲基與手性碳原子相連，與手性碳相連的其他兩個基團分別為2，4-鹵代苯環(huán)和烷基或一個不相同的取代苯環(huán)，如烯唑醇、烯效唑、戊唑醇、多效唑和三唑醇等。這些三唑醇類殺菌劑的不同異構(gòu)體間殺菌活性差異很大。以戊唑醇為例，化學(xué)名稱為（R，S）-1-（4-氯苯基）-4， 4-二甲基-3-（1H-1， 2， 4-三唑-1-基甲基）戊醇，分子中含有一個手性中心，含一對對映異構(gòu)體。楊麗萍等報道其對映體的抗菌活性存在明顯差異，尤其是對于油萊菌核病菌，（-）-戊唑醇的抗菌活性是（+）-戊唑醇的20倍35。利用生物催化制備手性烯唑醇、戊唑醇、烯效唑和三唑醇具有極大的開發(fā)潛力，如不對稱還原潛手性酮制備獲得相應(yīng)手性醇。

3 農(nóng)藥生物制造技術(shù)的主要發(fā)展趨勢和展望

生物制造的核心在于高效的生物催化劑。與生物催化劑種類的有限增加不同，生物催化劑的獲得方式因重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)發(fā)生了革命性的變化。雖然傳統(tǒng)的菌種篩選仍然重要，誘變育種也并未完全退出歷史舞臺，但新興的基因工程、代謝工程、定向進(jìn)化、合成生物學(xué)等重組DNA技術(shù)，為酶的制備、改造和微生物育種提供了更加高效便捷的手段，大幅度縮短了工業(yè)生物催化劑的開發(fā)周期，同時也大幅度提高了生物制造過程的技術(shù)水平和競爭力。生物催化劑發(fā)揮效率的關(guān)鍵在于有效的生物反應(yīng)過程調(diào)控。過程控制、流加發(fā)酵、有機相酶催化反應(yīng)、多酶耦合反應(yīng)、化學(xué)-酶耦合反應(yīng)、反應(yīng)-分離耦合等技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，大大提高了生物制造過程的生產(chǎn)效率。生物技術(shù)的快速發(fā)展為其應(yīng)用于農(nóng)藥生產(chǎn)提供了堅實的技術(shù)支撐。目前新農(nóng)藥的開發(fā)難度越來越大，在現(xiàn)有農(nóng)藥品種的基礎(chǔ)上，開發(fā)對映體純的手性農(nóng)藥已經(jīng)成為研究熱點。我國農(nóng)藥行業(yè)與歐美日等發(fā)達(dá)國家差距較遠(yuǎn)，應(yīng)結(jié)合生物催化在其他行業(yè)應(yīng)用中的經(jīng)驗 ，大力發(fā)展其在農(nóng)藥，特別是手性農(nóng)藥合成中的應(yīng)用，為農(nóng)藥合成工業(yè)注入新的活力。

［本研究獲國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（“973計劃”）（2011CB710800）國家自然科學(xué)基金（21476199）支持。］

10.3969/j.issn.1674-0319.2016.05.003