周 菁 張 焱 張 倩

(上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200437)

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瓜蔞薤白半夏湯對心肌梗死大鼠Wnt信號通路中β-鏈蛋白表達的影響※

周 菁 張 焱1張 倩1

(上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200437)

目的 觀察瓜蔞薤白半夏湯對心肌梗死大鼠Wnt信號通路中β-鏈蛋白(β-catenin)表達的影響。方法 結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支建立大鼠心肌梗死模型，造模成功的大鼠隨機分為心肌梗死模型組和瓜蔞薤白半夏湯組，每批次每組10只。心肌梗死模型組大鼠給予0.9%氯化鈉注射液2 mL/次，每日1次灌胃，瓜蔞薤白半夏湯組大鼠給予濃煎中藥2 mL/次，每日1次灌胃。分別干預1、5、10、15 d共4個批次。另取健康清潔級雄性SD大鼠10只，未行手術治療，留為假手術組。免疫組化的方法檢測β-catenin，IPWIN軟件檢測β-catenin表達率。結(jié)果 心肌梗死模型組及瓜蔞薤白半夏湯組大鼠的β-catenin表達在心肌梗死后1、5、10、15 d均較假手術組升高，并且這2組大鼠在心肌梗死后分別干預5、10、15 d的β-catenin表達與假手術組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與心肌梗死模型組大鼠比較，心肌梗死后給予瓜蔞薤白半夏湯干預1、5、10、15 d 4批次大鼠的β-catenin表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 大鼠的Wnt /β-catenin信號通路可被心肌梗死激活。短期使用瓜蔞薤白半夏湯未見到顯著的促進心肌梗死大鼠心肌細胞β-catenin表達的作用。

疾病模型, 動物; 心肌梗死；中藥療法; 心血管藥物(中藥)；鈣黏著糖蛋白類

冠心病心肌梗死多屬中醫(yī)學胸痹心痛、真心痛范疇。近幾十年來，隨著人民生活水平的不斷提高，冠心病的發(fā)病率逐年上升。統(tǒng)計數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)多數(shù)冠心病心肌梗死患者合并有肥胖、血脂代謝紊亂、高血壓等危險因素[1-2]。通過中醫(yī)辨證，這類患者通常具有胸悶如窒、腹部肥滿松軟、苔膩、脈滑等痰濕痹阻癥狀，治療擬化痰開痹為主，臨床療效顯著[3-6]。然而有關化痰中藥促進梗死后心肌修復作用的實驗研究卻相對較少。本研究選用《金匱要略》記載之瓜蔞薤白半夏湯為代表方，觀察大鼠急性心肌梗死造模成功后給予瓜蔞薤白半夏湯治療1、5、10、15 d的Wnt信號通路中β-鏈蛋白(β-catenin)表達情況，以分析化痰中藥是否具有促進梗死后心肌修復的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑、儀器

1.1.1 藥物 瓜蔞薤白半夏湯按《金匱要略》記載之原方瓜蔞12 g、薤白9 g、半夏9 g配方。自動煎藥機統(tǒng)一煎藥，控制時間及加水量，濃煎至生藥含量為1 g/mL。

1.1.2 試劑 山羊抗大鼠β-catenin一抗、二抗均由圣克魯斯生物技術(上海)有限公司提供。

1.1.3 實驗儀器 光學顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.2 動物、造模與分組

1.2.1 動物 SD大鼠90只，雄性，清潔級，體質(zhì)量(250±20) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：11400700038123。

1.2.2 造模 參照文獻[7-8]中的造模方法，取健康清潔級雄性SD大鼠80只，適應性飼養(yǎng)觀察1周，以3%水合氯醛腹腔麻醉(10 mL/kg)，插入氣管，連接微型呼吸機行正壓呼吸，前胸消毒后，在第3～4肋間打開胸腔，暴露心臟，結(jié)扎左冠狀動脈前降支。結(jié)扎前后記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以結(jié)扎部位以下心肌變蒼白、搏動減弱且出現(xiàn)J點明顯抬高為造模成功。逐層縫合胸壁，待動物恢復自主呼吸后，停止輔助呼吸，縫合皮膚。

1.2.3 分組 術后將存活大鼠80只隨機分為心肌梗死模型組和瓜蔞薤白半夏湯組。每批次每組各10只。分別進行0.9%氯化鈉注射液或瓜蔞薤白半夏湯灌胃干預1、5、10、15 d 4批次實驗。另取健康清潔級雄性SD大鼠10只，進行常規(guī)飼養(yǎng)，未行手術治療，留為假手術組。

1.3 方法與步驟

1.3.1 藥物干預 心肌梗死模型組大鼠給予0.9%氯化鈉注射液2 mL/次，每日1次灌胃；瓜蔞薤白半夏湯組大鼠給予濃煎中藥2 mL/次，每日1次灌胃。分別完成干預1、5、10、15 d共4批次實驗，每批次大鼠均在干預結(jié)束后第2 d處死。

1.3.2 免疫組化檢測 摘取大鼠心臟，應用4%多聚甲醛將大鼠心肌梗死區(qū)心肌組織固定，固定24～48 h后行石蠟包埋、切片。免疫組化實驗步驟：①將石蠟切片放入二甲苯中浸泡脫蠟；②分別用無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇浸泡，自來水沖洗，純水浸泡脫二甲苯；③放入H2O2中加蓋避光浸泡前后，予磷酸鹽緩沖液(PBS)加Tween-20(PBST)清洗，滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性；④抗原修復30 min；⑤PBST清洗數(shù)次后滴加10%山羊血清，孵育60 min，滴加一抗β-catenin，置入4 °C冰箱過夜；⑥PBST清洗后滴加二抗，置37 °C室內(nèi)孵育30 min；⑦PBST清洗后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色；⑧蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。封片后1～2 h即可讀片。

1.3.3 圖像分析系統(tǒng) 光鏡檢測β-catenin的表達情況。運用IPWIN軟件分析系統(tǒng)讀取β-catenin表達率。選取圖片中β-catenin表達出的棕色區(qū)域，獲得表達數(shù)值，再除以整張圖片中心肌組織的表達數(shù)值，獲得β-catenin的表達率。

2 結(jié) 果

各組大鼠心肌梗死后干預1、5、10、15 d β-catenin表達率比較 見表1。

組 別n1d5d10d15d假手術組100.01814±0.005860.01814±0.005860.01814±0.005860.01814±0.00586心肌梗死模型組100.02106±0.017430.05332±0.01715*0.07093±0.03313*0.04902±0.02152*瓜蔞薤白半夏湯組100.02132±0.01452△0.05479±0.02244*△0.07497±0.02260*△0.05672±0.03477*△

與假手術組同期比較，*P<0.01；與心肌梗死模型組同期比較，△P>0.05

由表1可見，心肌梗死造模成功后，心肌梗死模型組、瓜蔞薤白半夏湯組β-catenin表達率在心肌梗死后干預5、10、15 d均較假手術組升高(P<0.01)。瓜蔞薤白半夏湯組干預1、5、10、15 d β-catenin表達率與心肌梗死模型組同期比較均稍有增高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。大鼠心肌梗死后其β-catenin的表達呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，峰值在干預10 d時出現(xiàn)。

3 討 論

以往人們普遍認為心臟是不可再生的器官。心肌梗死后損傷和變性的心肌細胞經(jīng)巨噬細胞吞噬后被瘢痕組織取代，失去相應的功能。近年來，有關心肌梗死區(qū)本身的修復過程及心肌細胞再生的實驗研究已引起學者的普遍關注，促進梗死區(qū)的愈合以提高心肌梗死患者存活質(zhì)量，是心肌梗死治療的新思路。臨床上，針對痰濕痹阻型的心肌梗死患者，聯(lián)合以瓜蔞薤白半夏湯為基礎方的中藥湯劑化痰通痹治療，往往恢復較快?！端貑枴け哉摗吩唬骸靶谋哉撸}不通。” 《景岳全書》曰：“痰涎本皆血氣，若化失其正，則臟腑損，津液敗，而血氣即成痰涎?！币虼耍绻霰宰杩蓪е隆罢嫘耐础毙拿}不通，那么，“痰涎本皆血氣”，痰濁痹阻也可導致“真心痛”心脈不通。心脈不通，心失所養(yǎng)，胸悶如窒，氣短乏力，心悸喘促，究其病機乃心臟受損，痰瘀氣虛，只有化痰通痹，祛瘀生新，才能心血再生，氣助行血。因此，針對痰濕痹阻型的心肌梗死患者，聯(lián)合中藥化痰通痹、祛瘀生新十分重要。研究出其作用機制則更加有利于臨床推廣應用。

針對心臟新生的研究，國外研究發(fā)現(xiàn)Wnt廣泛分布于心臟，調(diào)節(jié)心臟的發(fā)育與生長。Wnt信號通路中β-catenin參與心臟內(nèi)細胞增殖、分化和凋亡過程，也參與心肌梗死后一系列的病理生理變化[9-13]。β-catenin是一種多功能的蛋白質(zhì)，功能主要為介導細胞間黏附，參與細胞增殖、遷移及相關基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生心肌梗死后1周，無β-catenin表達的小鼠的梗死區(qū)發(fā)生破裂，而對于非梗死區(qū)破裂的野生型小鼠來說，β-catenin卻極易檢測[14]，提示β-catenin對梗死區(qū)細胞黏附起重要作用[15]，缺乏β-catenin，梗死心臟就難以維持心室壁的完整性。此外，趙琦峰等[16]研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后肌纖維母細胞、血管內(nèi)皮細胞等細胞增殖、遷移至梗死區(qū)。肌纖維母細胞樣細胞分泌細胞外基質(zhì)，并具有一定的收縮能力，在梗死區(qū)內(nèi)規(guī)則排列，與心內(nèi)外膜相連接，能防治梗死區(qū)的膨脹和擴張，有助于心功能的維持。并且研究發(fā)現(xiàn)，肌纖維母細胞在發(fā)生梗死的大鼠心臟中增殖和遷移過程中伴隨著β-catenin的高表達，β-catenin表達在肌纖維母細胞的遷移階段，說明Wnt-1 /β-catenin通路可能參與了心肌梗死后梗死區(qū)愈合過程中肌纖維母細胞的排列過程。同時該研究還發(fā)現(xiàn)，在梗死區(qū)新生血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞胞質(zhì)內(nèi)有Wnt-1、β-catenin高表達，7、10 d時表達最明顯，說明Wnt-1、β-catenin可能參與了梗死區(qū)新生血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞的增殖和遷移。

本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后5 d時 β-catenin的表達已開始增加；10 d時，其表達水平達高峰；15 d后表達減弱，與趙琦峰[16]及陳麗君[17]研究報道相符。陳麗君[17]的研究發(fā)現(xiàn)大鼠急性心肌梗死后β-catenin的表達變化進程正好符合急性心肌梗死后顆粒組織形成的時間進程，也提示該信號分子可能參與調(diào)控了心肌梗死后心肌組織愈合過程中肌纖維母細胞以及血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移等細胞修復活動。因此，大鼠心肌梗死后β-catenin表達的增加可增強細胞間的黏附作用，維持梗死后心室壁的完整性，同時有助于促進梗死區(qū)肌纖維母細胞及血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移，從而發(fā)揮促進心肌修復再生的作用，驗證了Wnt /β-catenin信號通路在發(fā)生心肌梗死后被激活的表現(xiàn)。另一方面，給予瓜蔞薤白半夏湯干預治療后大鼠β-catenin的表達雖然符合心肌梗死后的變化規(guī)律，但與心肌梗死模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示短期應用瓜蔞薤白半夏湯沒有看到顯著的加強梗死后心肌細胞黏附及促進相關細胞增殖、遷移的作用。下一步或許可以通過適當延長大鼠灌服中藥的時間，或聯(lián)合觀察Wnt信號通路其他上下游因子來探討化痰中藥發(fā)揮促進梗死后心肌修復的作用機制。

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(本文編輯：董軍杰)

Study on the expression of Beta-catenin after using Gualou-Xiebai-Banxia decoction in rats Wnt signaling pathway after myocardial infarction

ZhouJing*,ZhangYan,ZhangQian.

*DepartmentofCardiology,YueyangHospitalofIntegrativeChineseandWesternMedicineAffiliatedtoShanghaiUniversityofTCM,shanghai200437

Objective To explore the expression of beta-catenin after using Gualou-Xiebai-Banxia decoction in rats Wnt signaling pathway after myocardial infarction. Methods The left anterior descending coronary arteries of SD rats were ligated to establish myocardial infarction models. All rats with myocardial infarction were divided into model group (n=10) and Gualou-Xiebai-Banxia decoction group (n=10). The rats in control group were treated with 2 mL of 0.9% NaCl per day. The rats in Gualou-Xiebai-Banxia decoction group were treated with 2mL of concentrated decoction per day. There were four different duration of treatments specifically 1 d, 5 d, 10 d and 15 d. Another 10 healthy male SD rats were used as sham group. Beta-catenin was detected by immunohistochemical method. IPWIN software was used to detect the expression of beta-catenin. Results The expressions of beta-catenin 1 d, 5 d, 10 d and 15 d after myocardial infarction were increased in model and Gualou-Xiebai-Banxia decoction groups were higher than those in sham group, and the statistical differences existed in the durations of 5 d, 10 d and 15 d after myocardial infarction (P<0.01). There were no statistical differences on the expressions of beta-catenin 1 d, 5 d, 10 d and 15 d after myocardial infarction between model and Gualou-Xiebai-Banxia decoction groups (P>0.05). Conclusion The Wnt/β-catenin signaling pathway in the rats may be activated by myocardial infarction. The short-term use of Gualou-Xiebai-Banxia decoction did not significantly increase the expression of beta-catenin in rats after myocardial infarction.

Disease model; Animal; Myocardial infarction; Traditional Chinese herbs therapy; Cardiovascular drugs; Cadherins

※ 項目來源：國家自然科學基金資助項目(編號：81202668)

1 上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)科，上海 200437

周菁(1979—)，女，主治醫(yī)師，博士。從事中西醫(yī)結(jié)合防治冠心病的研究。

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.08.018

R-332;R289.5;R542.220.531；R341.3

A

1002-2619(2016)08-1191-04

2015-11-27)