宋永周 劉會(huì)玲 馬 維 童九輝 李 飛 孫淑芹

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050000)

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抗骨增生膠囊含藥血清對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化的影響※

宋永周 劉會(huì)玲 馬 維△童九輝 李 飛1孫淑芹1

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050000)

目的 探討抗骨增生膠囊含藥血清對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化及骨保護(hù)蛋白(OPG)和核因子-кB受體活化子配體(RANKL)蛋白表達(dá)的影響。方法 采用中藥血清藥理學(xué)方法制備含抗骨增生膠囊大鼠血清。取乳鼠顱骨，利用復(fù)合膠原蛋白酶反復(fù)消化，離心，體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞。加入不同濃度的抗骨增生膠囊含藥血清進(jìn)行干預(yù)，噻唑藍(lán)(MTT)法檢測中藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響，測定堿性磷酸酶(ALP)活性，Western Blot檢測OPG和RANKL蛋白表達(dá)。結(jié)果 成骨細(xì)胞經(jīng)抗骨增生膠囊含藥血清作用后，細(xì)胞的生長呈現(xiàn)不同程度的增殖，中、高劑量中藥組在24、48、72 h均有明顯的促進(jìn)作用(P<0.01)，且呈劑量依賴性。低劑量中藥組在24、48 h時(shí)與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，72 h時(shí)作用較強(qiáng)(P<0.05 )。除低劑量組培養(yǎng)24 h外，低、中、高劑量中藥組培養(yǎng)24、48、72 h后，ALP分泌均呈不同程度增加，均有明顯的促進(jìn)作用(P<0.01)。成骨細(xì)胞經(jīng)過抗骨增生膠囊含藥血清低、中、高劑量作用72 h后，對(duì)比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與空白對(duì)照組比較，OPG表達(dá)明顯升高(P<0.01)，RANKL表達(dá)明顯降低(P<0.01)。結(jié)論 抗骨增生膠囊含藥血清可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增值、分化，從而促進(jìn)骨形成。

成骨細(xì)胞；堿性磷酸酶；細(xì)胞增殖；藥物作用；中藥療法

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少，骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加，易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病[1-2]。近年來，大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究證明，中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥具有良好的效果[3-8]。抗骨增生膠囊為江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的治療骨關(guān)節(jié)疾病的中成藥，由熟地黃、肉叢蓉、骨碎補(bǔ)、淫羊藿、雞血藤、牛膝、狗脊、女貞子、萊菔子等藥物組成的復(fù)方制劑。本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)和體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的方法來觀察抗骨增生膠囊含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖及骨保護(hù)蛋白(OPG)和核因子-κB受體活化子配體(RANKL)蛋白表達(dá)的影響，以探討其應(yīng)用于防治骨質(zhì)疏松癥的效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生24 h內(nèi)SD乳鼠10只，用于分離培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞。體質(zhì)量200 g左右SD大鼠40只，雌雄不拘，用于制備含藥血清。由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2 藥品及試劑 抗骨增生膠囊(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10980006)，堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(南京建成科技有限公司)，ALP測定試劑盒(南京建成科技有限公司)，復(fù)合膠原蛋白酶(Sigma公司)，胎牛血清(Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司)，兔抗鼠OPG抗體(美國SANTA Cruz)，兔抗鼠RANKL抗體(美國SANTA Cruz)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗體(美國Jackson Immuno Research公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 含藥血清的制備 取40只SD大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組及低、中、高劑量中藥組，每組10只灌胃給藥。低劑量按人日臨床劑量，經(jīng)人大鼠體表面積比值折算成相當(dāng)于人臨床等效用量1.16 g/100 g給藥，中、高劑量中藥組予低劑量的3倍和9倍給藥，空白對(duì)照組予同等容積的0.9%氯化鈉注射液[9]。連續(xù)給藥12 d，末次給藥后2 h戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心10 min，分離血清后于56 ℃烤箱中滅活30 min，0.22 μm濾膜抽濾除菌，分裝后-20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 成骨細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng) 取10只出生24 h內(nèi)SD乳鼠，無菌條件下取頭蓋骨，將頭蓋骨切碎至1 mm×1 mm大小，復(fù)合膠原蛋白酶37 ℃振蕩消化30 min，棄消化液，再次加入復(fù)合膠原蛋白酶37 ℃振蕩消化90 min，離心，棄上清液后加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，靜置10 min，輕輕吸取上清液至另一培養(yǎng)瓶中，再靜置10 min，將上清液計(jì)數(shù)后按2×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞增殖至占據(jù)瓶底約80%表面時(shí)，進(jìn)行傳代。倒置相差顯微鏡每天觀察細(xì)胞的形態(tài)特征及生長情況并攝片。

1.4 檢測方法

1.4.1 成骨細(xì)胞的鑒定 取第3代細(xì)胞稀釋成2×105/mL ，接種于孔底鋪有無菌玻片的6孔板，待細(xì)胞長滿后，采用重氮鹽法進(jìn)行ALP染色，對(duì)所培養(yǎng)的成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.4.2 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測中藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響 取第3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按1×104/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄上清液，分別加入10%空白血清，低、中、高劑量中藥血清培養(yǎng)基各200 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，分別每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，各孔加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，490 nm波長處測定吸光度值。重復(fù)3次。

1.4.3 ALP檢測 取第3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按1×104/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄上清液，分別加入10%空白血清，低、中、高劑量中藥血清培養(yǎng)基各200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，每孔加入100 μL 0．1%Triton X-100，超聲裂解細(xì)胞，按ALP檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，分光光度計(jì)測定490 nm 波長的吸光光度值，計(jì)算ALP含量。

1.4.4 免疫印跡(Western blot)測定OPG及RANKL蛋白表達(dá) 取第3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按1×104/mL密度接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入10%空白血清，低、中、高劑量中藥血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，棄上清，加入4 ℃裂解緩沖液中，超聲裂解細(xì)胞，在4 ℃的冰凍環(huán)境下14 000 r/min離心5 min。取上清液，二喹啉甲酸法(BCA)測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，同時(shí)上Marker，電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和封膜。分別采用封閉一抗(兔抗鼠OPG抗體、兔抗鼠RANKL抗體)和熒光二抗(FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體)，掃描并且記錄各個(gè)條帶的積分光密度值(IOD)。使用其與內(nèi)參蛋白IOD的比值來反映目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)成骨細(xì)胞增殖情況比較 見表1。

組 別n培養(yǎng)時(shí)間24h48h72h空白對(duì)照組60.103±0.0110.233±0.0350.406±0.025低劑量中藥組60.195±0.0210.323±0.0390.598±0.040△中劑量中藥組60.423±0.014*0.599±0.042*0.812±0.022*高劑量中藥組60.639±0.036*0.828±0.030*0.960±0.035*

與空白對(duì)照組比較，*P<0.01，△P<0.05

由表1可見，成骨細(xì)胞經(jīng)抗骨增生膠囊含藥血清作用后，細(xì)胞的生長呈現(xiàn)不同程度的增殖，中、高劑量中藥組在24、48、72 h均有明顯的促進(jìn)作用(P<0.01)，且呈劑量依賴性。低劑量中藥組在24、48 h時(shí)與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，72 h時(shí)作用較強(qiáng)(P<0.05)。

2.2 各組不同時(shí)間點(diǎn)ALP活性水平比較 見表2。

與空白對(duì)照組比較，*P<0.01

由表2可見，除低劑量組培養(yǎng)24 h外，低、中、高劑量中藥組培養(yǎng)24、48、72 h后，ALP分泌均呈不同程度增加，均有明顯的促進(jìn)作用(P<0.01)。2.3 成骨細(xì)胞的鑒定 剛接種的成骨細(xì)胞成球形,懸浮于培養(yǎng)液中并逐漸沉降貼壁展開，24 h后,大量細(xì)胞貼壁生長,呈長梭形、三角形或不規(guī)則多邊形,并且有2～3個(gè)突起,胞質(zhì)透亮、飽滿，數(shù)量無明顯增多。單核成卵圓形，1～3個(gè)核仁,胞質(zhì)豐富、清晰。4 d后,細(xì)胞數(shù)明顯增加,細(xì)胞周圍有半透明光暈,胞漿內(nèi)可見許多大小不一的深色顆粒散布核周,胞核橢圓居中,輪廓清晰；7～8 d后細(xì)胞融合成單層,細(xì)胞突起細(xì)長,細(xì)胞體積較前明顯增大, 細(xì)胞鋪滿整個(gè)平皿底面, 細(xì)胞為梭形或立方塊狀，部分區(qū)域出現(xiàn)重疊生長(見圖1)。ALP染色的細(xì)胞，細(xì)胞核呈深紫黑色或灰黑色圓形或橢圓形，染色較胞漿深，胞漿呈淺紫黑色，高倍鏡下胞漿中見黑色顆粒,部分胞膜呈紫黑色線狀染色，成骨細(xì)胞密集區(qū)有大量的棕黑色顆粒(見圖2)。

圖1 接種7 d的成骨細(xì)胞(×40)

圖2 成骨細(xì)胞的ALP染色(×200)

2.4 各組OPG、RANKL蛋白的表達(dá) 見表3、圖3。

組 別OPG/β-actinRANKL/β-actin空白對(duì)照組0.149±0.0370.428±0.041低劑量中藥組0.223±0.030*0.327±0.028*中劑量中藥組0.259±0.030*0.301±0.018*高劑量中藥組0.403±0.036*0.252±0.025*

與空白對(duì)照組比較，*P<0.01

圖3 各組別OPG、RANKL蛋白表達(dá)

由表3可見，成骨細(xì)胞經(jīng)過抗骨增生膠囊含藥血清低、中、高劑量作用72 h后，對(duì)比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與空白對(duì)照組比較，OPG表達(dá)明顯升高(P<0.01)，RANKL表達(dá)明顯降低(P<0.01)。

3 討 論

目前研究認(rèn)為,骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制主要是由于骨吸收和骨形成之間的平衡失調(diào)所致,其中成骨細(xì)胞在骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中起重要作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“ 腎主骨生髓”，腎虛則髓減骨枯。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究證明補(bǔ)腎壯骨中藥防治骨質(zhì)疏松具有良好的效果[3-8]?？构窃錾z囊由熟地黃、肉叢蓉、骨碎補(bǔ)、淫羊藿、雞血藤、牛膝、狗脊、女貞子、萊菔子等藥物組成。文獻(xiàn)報(bào)道淫羊藿、地黃、骨碎補(bǔ)、肉叢蓉等對(duì)成骨細(xì)胞增殖及分化有促進(jìn)作用，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化也有促進(jìn)作用，為中藥防治骨質(zhì)疏松提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[9-12]。課題組在前期的研究成果中發(fā)現(xiàn)抗骨增生膠囊對(duì)骨折愈合的各個(gè)階段均有促進(jìn)作用，能夠抑制白細(xì)胞介素lβ誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，降低基質(zhì)金屬蛋白酶13水平[13-15]。對(duì)于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖及分化，尚未見相關(guān)報(bào)道。

體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞具有與體內(nèi)成骨細(xì)胞基本相同的生物學(xué)特性，能很好地反映成骨細(xì)胞的功能活動(dòng)特點(diǎn)。ALP是成骨細(xì)胞分化和功能成熟的前期標(biāo)志，是最常見的評(píng)價(jià)骨形成的指標(biāo)。本研究采用復(fù)合膠原酶消化法分離培養(yǎng)乳鼠顱骨細(xì)胞，ALP染色呈陽性反應(yīng)，說明本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)的就是成骨細(xì)胞，且具有典型的成骨細(xì)胞生物學(xué)特征。在本研究中，通過體外實(shí)驗(yàn)觀察了各組含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖、ALP活性的影響。研究結(jié)果表明，抗骨增生膠囊含藥血清具有明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞生長的分化增殖及ALP的分泌，且具有時(shí)間、濃度依賴性，對(duì)骨形成有促進(jìn)作用。

OPG、RANKL和RANK 均為腫瘤壞死因子(TNF) 超家族成員[16]。成骨細(xì)胞可表達(dá)OPG與RANKL，二者嚴(yán)格控制著破骨細(xì)胞的分化，從而影響破骨細(xì)胞的形成和骨吸收。OPG是成骨細(xì)胞分化過程中產(chǎn)生的破骨細(xì)胞抑制因子，可作為餌受體與RANKL結(jié)合，從而阻斷RANKL與破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，從而阻斷骨吸收信號(hào)的傳遞，抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡。在本研究中，通過體外實(shí)驗(yàn)觀察了各組含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞OPG、RANKL蛋白表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明，不同濃度的抗骨增生膠囊含藥血清均可增強(qiáng)OPG的表達(dá)，對(duì)RANKL的表達(dá)則有不同程度的抑制作用，與空白血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗骨增生膠囊含藥血清能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化增殖，促進(jìn)ALP的分泌，促進(jìn)成骨細(xì)胞OPG的表達(dá)，抑制RANKL的表達(dá)。因此，抗骨增生膠囊含藥血清有可能通過促進(jìn)成骨細(xì)胞OPG的表達(dá)，抑制RANKL的表達(dá)，進(jìn)而通過阻斷骨吸收信號(hào)的傳遞，阻止破骨細(xì)胞的激活、分化，從而達(dá)到抑制破骨細(xì)胞活性，并促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的目的，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究和探討。本實(shí)驗(yàn)對(duì)于拓展其治療范疇提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(本文編輯：董軍杰)

Effects of medicated serum of Kanggu-zengsheng capsules on proliferation and differentiation of osteoblasts in rats

SongYongzhou*,LiuHuiling,MaWei,etal.

*DepartmentofOrthopedics,SecondHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Hebei,Shijiazhuang050000

Objective To study the effects of medicated serum of Kanggu-zengsheng capsules on proliferation and differentiation of osteoblasts, and the expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of NF-кB ligand (RANKL). Methods The serum of rats administered Kanggu-zengsheng capsules was obtained by the method of serum pharmacology. The cranium of the rats were collected, then digested with compound collagenase repeatedly, and then centrifuged, in order to extract osteoblasts, which were fed with serum from Kanggu-zengsheng capsules at different doses. The proliferation of osteohlasts and the activity of alkaline phosphatase (ALP) were detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. The expressions of osteoprotegrin (OPG) and RANKL were detected by Western Blot. Results There were different proliferation effects on the growth of osteoblasts after intervention. There were significant promoting effects at the time points of 24, 48 and 72 h in middle and high dose groups (P<0.01), with dose-dependent. There were no statistical differences on the effects at the time points of 24 and 48 h in low-dose group as compared with those in blank control group (P>0.05), and there were better effects at the time of 72 h (P<0.05). The secretions of ALP at 24, 48 and 72 h were enhanced at different degrees in low, middle and high dose groups (P<0.01), except the 24 h of low dose group. The expressions of OPG 72 h after intervention in low, middle and high dose groups were significantly increased as compared with those in blank control group (P<0.01), and the expressions of RANKL were lower (P<0.01). Conclusion The serum containing of Kanggu-zengsheng capsules can stimulate proliferation and differentiation of osteoblasts, then promote the bone formation.

Osteoblast; Alkaline phosphatase; Proliferation; Pharmacological action; Traditional Chinese herbs therapy

※ 項(xiàng)目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號(hào)：20150666)

△ 通訊作者：河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050000

1 河北省定州市人民醫(yī)院CT核磁科，河北 定州 073000

宋永周(1973—)，男，副教授，博士。研究方向：骨關(guān)節(jié)退行性疾病。

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.08.017

R-332;R285.5;R329.24;R329.28;R681.053.1

A

1002-2619(2016)08-1187-05

2016-05-17)