陳傳紅　吳　洪　尹順吉　馬建源　李　青

（ 新奧科技發(fā)展有限公司，煤基低碳能源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廊坊 065001）

一株葡萄藻的分離、鑒定及產(chǎn)烴性能評(píng)價(jià)

陳傳紅吳洪尹順吉馬建源李青

（ 新奧科技發(fā)展有限公司，煤基低碳能源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廊坊 065001）

研究從我國(guó)海南博鰲海邊的淡水池塘水樣分離獲得一株綠藻ENN41。顯微形態(tài)觀察表明，ENN41的形態(tài)特征屬于葡萄藻。進(jìn)一步克隆ENN41的核糖體小亞基18S rRNA片段，利用分子生物學(xué)軟件進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明ENN41的18S rRNA基因序列與布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）同源性最高，說(shuō)明ENN41為一株布朗葡萄藻（B. braunii）。ENN41在柱式反應(yīng)器中培養(yǎng)16d，單位體積產(chǎn)率為0.483 g/（L·d），粗烴占干重的含量為56.6%； 主要脂肪酸為油酸（C18：1）、十八碳四烯酸（C18：4）和棕櫚酸（C16：0），三者之和占總脂肪酸的72.6%； 利用尼羅紅染色，清晰可見(jiàn)大量的油脂分布在細(xì)胞內(nèi)和胞外基質(zhì)中。ENN41在板式反應(yīng)器中培養(yǎng)16d，單位體積產(chǎn)率為0.234 g/（L·d），粗烴占干重的含量為20.0%。上述研究表明，ENN41是具有較高的生長(zhǎng)速度和粗烴積累能力的布朗葡萄藻（B. braunii）藻株，具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用潛力。

ENN41；18S rRNA；布朗葡萄藻；單位體積產(chǎn)率；粗烴含量

隨著全球化石能源的短缺和化石能源使用帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題，尋找新型可替代能源勢(shì)在必行，微藻具有生物量大、生長(zhǎng)周期短及含油脂類(lèi)物質(zhì)高等特點(diǎn)，在CO2減排和生物燃料利用上都有廣闊的開(kāi)發(fā)前景［1—3］。

目前利用微藻生產(chǎn)生物柴油主要有兩種研發(fā)思路，一種是利用微藻合成的脂肪酸酯化來(lái)生產(chǎn)生物柴油，大多數(shù)的微藻通過(guò)脂肪酸合成途徑能夠積累大量油脂，目前大多數(shù)從事微藻能源研究的團(tuán)體均采用此類(lèi)研發(fā)思路來(lái)開(kāi)發(fā)微藻生物柴油［4，5］； 另一種是利用微藻合成的烴類(lèi)物質(zhì)來(lái)生產(chǎn)生物柴油，因烴類(lèi)物質(zhì)與石油性質(zhì)相似，故可代替石油成為新的可再生能源。迄今所發(fā)現(xiàn)的具有產(chǎn)烴能力的藻類(lèi)有葡萄藻（B. braunii）［6—8］、鹽藻（Dunaliena salina）［9］、小球藻（Chlorella vugaris）［10］、網(wǎng)翼藻（Dictyopteris aerostichoides）［11］等，但葡萄藻因其含烴量高、烴類(lèi)的組成和結(jié)構(gòu)與石油極為相似之故，對(duì)葡萄藻的研究受到世界的廣泛關(guān)注。

葡萄藻又名叢粒藻，屬綠藻門(mén)（Chlorophyta）、四胞藻綱（Trebouxiophyceae）、葡萄藻科（Botryo coccaceae）、葡萄藻屬（Botryococcus），是一種世界性分布的淡水或微咸水綠藻［12］。葡萄藻烴含量為細(xì)胞干重的25%—86%，烴的性質(zhì)因藻株有所區(qū)別［13］。葡萄藻的含烴量明顯高于其它微生物，但葡萄藻生長(zhǎng)緩慢，室外養(yǎng)殖容易污染，很難得到大規(guī)模的推廣應(yīng)用，因此，優(yōu)良葡萄藻藻種是實(shí)現(xiàn)葡萄藻推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。

本研究以作者分離自海南的綠藻ENN41為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)顯微形態(tài)觀察，并結(jié)合18S rRNA序列特征，對(duì)ENN41進(jìn)行了形態(tài)分類(lèi)和分子鑒定。同時(shí)利用不同光反應(yīng)器研究了ENN41的生長(zhǎng)及烴積累情況，為藻株的下一步開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

藻株的分離本研究于2010年12月在海南博鰲海邊淡水池塘采集水樣，取無(wú)菌水稀釋水樣后，吸取一定量的樣品滴在載玻片上，用40倍或100倍顯微鏡觀察，將藻體移入視野中間，用毛細(xì)管直接吸取藻細(xì)胞，接種于48孔裝有BG11培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，在25℃、光照強(qiáng)度為50 μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)2—3周，后期進(jìn)行顯微鏡觀察，選擇只有單藻株的孔，鋪平板及平板劃線進(jìn)一步分離純化目的藻株，得到純?cè)宸N。經(jīng)顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察初步鑒定為葡萄藻屬的種類(lèi)，命名為ENN41。

1.2方法

藻種培養(yǎng)藻種的培養(yǎng)采用BG11培養(yǎng)基，反應(yīng)器為內(nèi)徑50 mm、長(zhǎng)度600 mm的柱式反應(yīng)器，光照強(qiáng)度100 μmol/（m2·s），24h光照，培養(yǎng)溫度25—28℃，在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)向培養(yǎng)液中通入1%—2%的二氧化碳和空氣的混合氣體，將培養(yǎng)基的pH控制在7—9。

藻種分子鑒定基因組的提?。翰捎靡旱心ズ驮噭┨崛〉姆椒ǐ@得，DNA溶于試劑盒所帶Elution Buffer。具體如下：將ENN41藻株用350目濾網(wǎng)先將藻液濃縮，然后再離心收集，盡量除去細(xì)胞沉淀中的多余水分，凍存于-20℃。用液氮研磨凍存的藻細(xì)胞，研磨的同時(shí)，加入適量玻璃砂。使用Biospin Genomic DNA Extraction Kit試劑盒提取待鑒定的ENN41藻株的基因組DNA，使用試劑盒附帶的Elution Buffer洗脫，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和純度。

18S rRNA 序列的擴(kuò)增：采用真核生物18S擴(kuò)增通用引物（引物合成由上海生工生物工程公司合成）擴(kuò)增微藻基因組18S基因片段。（上游引物18SF：5′-CCTGGTTGATCCTGCCAG-3′； 下游引物18SR：5′-TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3′）。取1 μL總DNA為模板，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，然后94℃變性50s，56℃退火50s，72℃延伸90s，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物，回收純化目標(biāo)DNA片段，并將目標(biāo)片段連接到pMD18-T載體上（TAKARA，Japan） ，轉(zhuǎn)入E. coli感受態(tài)細(xì)胞，使用引物對(duì)18SF/R檢驗(yàn)出陽(yáng)性克隆送至上海生工公司測(cè)序。

序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建用BLAST軟件對(duì)編輯后的基因序列的同源性進(jìn)行分析。采用Clustal W軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，MEGA6.0進(jìn)行Clustal W同源比對(duì)，然后采用Neighbor-Joining算法，Bootstrap值為1000，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，所用藻株信息如表1所示。

實(shí)驗(yàn)方法將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻細(xì)胞接種到實(shí)驗(yàn)用的光生物反應(yīng)器中（分別為內(nèi)徑30 mm、長(zhǎng)度600 mm的柱式反應(yīng)器和50 cm×5 cm×50 cm板式反應(yīng)器），光強(qiáng)約為200 μmol/（m2·s），24h光照，溫度28—30℃，通入含1%—2%CO2的壓縮空氣將pH值控制在7—9，定時(shí)取適量藻液，進(jìn)行相應(yīng)的指標(biāo)檢測(cè)。

分析方法生物量的測(cè)定：將Ф47 mm的Whatman（GF/C）濾膜于105℃烘干至恒重后稱(chēng)重（W1），于設(shè)定的取樣時(shí)間移取一定體積（V）的藻液真空抽濾，在105℃的烘箱中烘干過(guò)夜，于干燥器中冷卻后稱(chēng)重（W2）。生物量濃度用單位體積藻體的干重（Dry cell weight，DCW）表示。

生物量（DCW，g/L）=（W2-W1）/V

尼羅紅染色：取培養(yǎng)16d的藻液0.5 mL于4000 r/ min離心5min，去上清，并用去離子水洗滌2次，后用20% DMSO水溶液重新懸浮至0.5 mL，加入尼羅紅使其濃度為1 μg/L，35℃水浴10min，后用去離子水洗滌一次，此時(shí)將染色的藻細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察。

粗烴的測(cè)定：將培養(yǎng)16d的藻液于4000 r/min離心5min，藻泥經(jīng)真空冷凍干燥獲得凍干藻粉。取5.00 g凍干藻粉放置在圓底燒瓶中，加入200 mL氯仿，45℃水浴抽提8h，期間定時(shí)搖動(dòng)燒瓶，使其充分混勻，抽提完后用定性濾紙過(guò)濾去除藻渣，用氯仿溶劑洗滌藻渣2次以上。收集氯仿相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃水浴中去除氯仿，剩余物即為粗烴。

表1　構(gòu)建18S系統(tǒng)樹(shù)所用藻株信息Tab. 1　Strain information for construction of 18S phylogenetic tree

脂肪酸組成及含量的測(cè)定：（1）脂肪酸提?。喝?00 mg凍干藻粉放置在具Telfnon螺口瓶蓋的體積為15—20 mL的小玻璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2—4 mL 10% DMSO-Methanol 溶液，40℃砂?。ㄊ⑸暗臒胖煤銣丶訜岽帕嚢杵魃希?min； 然后在4℃下磁力攪拌抽提30min，3500 r/min離心，轉(zhuǎn)移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1 ：1的乙醚、正己烷4—8 mL 4℃下磁力攪拌抽提1h，3500 r/min離心，轉(zhuǎn)移上清液到上述一小瓶中?？芍貜?fù)上述過(guò)程直到藻渣變白。在上述合并抽提液中加入純水使四者（水、DMSO-Methanol、乙醚、正己烷）體積比例為 1 ：1 ：1 ：1，震蕩分相，移取有機(jī)相轉(zhuǎn)移到另一小玻璃瓶中，在通風(fēng)櫥中用氮?dú)獯抵脸蓾饪s液，然后轉(zhuǎn)移到事先稱(chēng)重過(guò)的1.5 mL塑料離心管中，再用氮?dú)獯蹈芍梁阒?。?）脂肪酸分析：照上面方法進(jìn)行提取后，用正己烷溶解，使用Agilent 6820氣相色譜儀進(jìn)行氣相色譜分析（色譜條件為載氣：氮?dú)饬髁? mL/min、氫氣流量30 mL/ min、空氣流量300 mL/min，進(jìn)樣口溫度：280℃，檢測(cè)器溫度：280℃，檢測(cè)器類(lèi)型：Agilent FID，色譜柱：Agilent DB-5毛細(xì)管色譜柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm），分流比：4 ：1。分析方法：內(nèi)標(biāo)法GB/T 17377-1998（氣相色譜用氮?dú)庾鬏d氣，相當(dāng)于液相色譜的流動(dòng)相）。

2　結(jié)果

2.1ENN41的形態(tài)學(xué)特征

在顯微鏡下觀察到ENN41的藻細(xì)胞形狀為橢圓形或楔形（圖1），幾個(gè)或上百個(gè)細(xì)胞通過(guò)不規(guī)則且長(zhǎng)短不同的繩索狀透明膠質(zhì)相連，組成大小不一的集結(jié)體； 細(xì)胞大?。洪L(zhǎng)6—8 μm，寬5—7 μm，聚集群體一般在50 μm以上，大的可達(dá)數(shù)百μm至肉眼可見(jiàn)； 細(xì)胞顏色為深綠色或黃褐色，穩(wěn)定期的細(xì)胞呈黃褐色； 細(xì)胞包被在不規(guī)則分枝或分葉的、半透明的膠群體膠被里，細(xì)胞頂部通常裸露在外； 穩(wěn)定期的群體細(xì)胞經(jīng)在擠壓后有明顯的油滴從膠被里滲出； 有時(shí)觀察可見(jiàn)細(xì)胞分裂，以似親孢子生殖，大的群體比較易于斷裂為小群體。

圖1　ENN41在正常生長(zhǎng)下顯微照片F(xiàn)ig. 1　Micrograph of ENN41 under normal growth condition

2.2ENN41 18S rRNA基因序列分析

用真核生物18S rRNA擴(kuò)增通用引物對(duì)18SF/R獲得的ENN41的18S rRNA序列，登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示與索引號(hào)為KC438297.1的布朗葡萄藻B. braunii strain 3005 的18S rRNA基因序列最為相似，匹配度為99%，覆蓋率為100%。

根據(jù)上述18S rRNA序列Blast結(jié)果，選取葡萄藻和其他綠藻相關(guān)基因序列信息繪制了ENN41的18S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。從圖2中可以看出，ENN41與布朗葡萄藻B. braunii strain 3005和B. braunii strain AGB-Bb02較近，與B. braunii isolate Songkla Nakarin和B. terribilis strain AICB 418較遠(yuǎn)。

圖2　根據(jù)18S Blast基因序列構(gòu)建布朗葡萄藻ENN41系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 2　Phylogenetic tree of Botryococcus braunii ENN41 based on the results of 18S Blast

2.3光反應(yīng)器中ENN41的生長(zhǎng)特性

柱式反應(yīng)器ENN41在柱式反應(yīng)器中持續(xù)培養(yǎng)16d，分別于4、7、10、13和16d取樣測(cè)定OD值和生物量。ENN41在16d的培養(yǎng)中一直呈現(xiàn)快速生長(zhǎng)趨勢(shì)，OD750從接種時(shí)的0.300增加到2.705，平均每天增加0.150（圖3a）； 生物量終濃度為8.710 g/L，單位體積產(chǎn)率為0.483 g/（L·d）（圖3b）。

圖3　ENN41在柱式反應(yīng)器中OD值（a）和生物質(zhì)濃度（b）的變化Fig. 3　The OD750（a） and biomass concentration（b） of ENN41 in the column reactor

如表2所示，ENN41的粗烴占干重的含量在16d時(shí)為56.6%。從表觀上看，粗烴提取前藻粉呈褐綠色，提取后變?yōu)榫G色，而提取出的粗烴在正己烷溶劑中呈褐色，說(shuō)明在培養(yǎng)后期藻粉中積累了一定量的類(lèi)胡蘿卜素，使后期藻粉和粗烴溶液帶有一定的褐色。

表2　ENN41在柱式反應(yīng)器中培養(yǎng)16d時(shí)的粗烴含量Tab. 2　The crude hydrocarbon of ENN41 at the end of the 16d culture in column reactor

如表3所示，培養(yǎng)16d時(shí)ENN41的脂肪酸占干重的含量?jī)H為5%，其中主要脂肪酸為油酸（C18：1）、十八碳四烯酸（C18：4）和棕櫚酸（C16：0），三者之和占總脂肪酸組成的72.6%。

圖4　粗烴提取前（a）、后（b）的ENN41藻粉及正己烷溶解的粗烴（c）Fig. 4　The extraction of crude hydrocarbon of ENN41. Algal power before（a） and after（b） extraction of ENN41，crude hydrocarbons dissolved in hexane（c）

表3　ENN41在柱式反應(yīng)器中培養(yǎng)16 d時(shí)的脂肪酸組成及含量Tab. 3　Fatty acid composition and content of ENN41 at day 16

收集在柱式反應(yīng)器中培養(yǎng)了16d的ENN41藻體，用尼羅紅染色。如圖5所示，可以清楚的看見(jiàn)大量的油脂分布在胞外基質(zhì)中，少部分分布在細(xì)胞內(nèi)。

板式反應(yīng)器ENN41在光徑5 cm的板式反應(yīng)器中持續(xù)培養(yǎng)16d，每隔1天取樣測(cè)定生物量濃度，于培養(yǎng)結(jié)束時(shí)測(cè)定粗烴含量。ENN41在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中生物量一直呈逐漸增加趨勢(shì)，16d時(shí)的生物量為4.584 g/L，單位體積產(chǎn)率為0.234 g/（L·d），粗烴占干重的含量為20%。ENN41在放大的光生物反應(yīng)器中，雖然與窄光徑、小體積的柱式反應(yīng)器相比，產(chǎn)量降低了許多，但仍然保持了相對(duì)較快的生長(zhǎng)速度。這說(shuō)明ENN41在放大的培養(yǎng)體系中，仍然保持了較好的生長(zhǎng)性能，另外，本次放大實(shí)驗(yàn)未使用營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫誘導(dǎo)條件，仍然獲得了較高的烴含量。

圖5　布朗葡萄藻ENN41的尼羅紅染色圖Fig. 5　The Nile red staining of Botryococcus braunii ENN41

3　討論

微藻形態(tài)分類(lèi)需要較長(zhǎng)周期的觀察，并要求研究者有豐富的藻類(lèi)學(xué)知識(shí)，部分微藻常因培養(yǎng)條件的改變而發(fā)生形態(tài)的變化，從而影響微藻的形態(tài)學(xué)分類(lèi)。利用基因序列分析可克服在形態(tài)上變化和形態(tài)難以區(qū)別的藻株，對(duì)微藻的分類(lèi)提供依據(jù)，結(jié)果的準(zhǔn)確性也更高，同時(shí)有利于厘清同源性較高的藻株間的進(jìn)化距離。本研究使用的ENN41在培養(yǎng)過(guò)程中也會(huì)發(fā)生細(xì)胞大小和集落大小的改變，但總體生物學(xué)形態(tài)特征與剛分離時(shí)相差不大。本研究利用18S rRNA基因序列對(duì)ENN41分類(lèi)作了進(jìn)一步的鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)證明分離自海南的藻株ENN41與布朗葡萄藻B. braunii strain 3005和云南撫仙湖的AGB-Bb02進(jìn)化距離最短，與另外幾株葡萄藻藻株之間的進(jìn)化距離要遠(yuǎn)一些，說(shuō)明相似生境來(lái)源的藻株的同源性也會(huì)較高，而不同生境來(lái)源的藻株之間存在遺傳多樣性。這與王朋云等［14］報(bào)道的不同地理來(lái)源的葡萄藻藻株的形態(tài)和遺傳多樣性結(jié)果一致。

圖6　ENN41在板式反應(yīng)器中的生長(zhǎng)曲線和16d時(shí)的粗烴含量Fig. 6　The growth curve of ENN41 in plate reactor and the crude hydrocarbon content over 16 days

關(guān)于葡萄藻培養(yǎng)方面，各國(guó)研究者已經(jīng)開(kāi)展了許多工作，主要集中在培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)元素及環(huán)境條件的研究上?？捎糜谂囵B(yǎng)葡萄藻的培養(yǎng)基主要有：Chu10、Chu13、Prat、BBM、BG11等，這些培養(yǎng)基主要在大量元素含量上差別較大，本文采用了營(yíng)養(yǎng)成分較充分且淡水藻常用的BG11培養(yǎng)基。另外，在葡萄藻培養(yǎng)中，光照、溫度、鹽度、pH等環(huán)境因子對(duì)其生長(zhǎng)和產(chǎn)烴量有很大影響。光強(qiáng)大小不僅影響微藻的色素比例，而且影響了葡萄藻的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)烴量。Zhang等［15］在較高光強(qiáng)［約140 μmol/（m2·s）］下培養(yǎng)布朗葡萄藻，生物量和產(chǎn)烴量均高于低光強(qiáng)下的數(shù)值，Oyama等［16］在中等光強(qiáng)［140—400 μmol/（m2·s）］下更有利于布朗葡萄藻的生長(zhǎng)和產(chǎn)烴。溫度對(duì)布朗葡萄藻的影響具有種屬特異性［17］，通常最適生長(zhǎng)溫度是23—25℃。pH是對(duì)微藻生具有重要影響的因素之一，pH主要影響無(wú)機(jī)碳在水中的溶解形式，而影響藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究培養(yǎng)布朗葡萄藻所用的培養(yǎng)條件為光強(qiáng)200 μmol/（m2·s），溫度25℃左右，pH控制在7—9，與上述文獻(xiàn)描述的布朗葡萄藻生長(zhǎng)條件基本吻合，有效提高了ENN41藻株的生長(zhǎng)和產(chǎn)烴量。一直以來(lái)，許多研究者認(rèn)為葡萄藻生長(zhǎng)速度較慢，是限制其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的主要原因。其中Banerjee等［18］認(rèn)為，葡萄藻生長(zhǎng)速度慢的主要原因是因?yàn)樵寮?xì)胞合成高熱值的碳?xì)浠衔?，而不是由于營(yíng)養(yǎng)物的缺乏。本研究利用柱式反應(yīng)器培養(yǎng)ENN41藻株，16d時(shí)生物量達(dá)到了8.710 g/L，單位體積產(chǎn)率達(dá)到0.483 g/（L·d），同時(shí)，粗烴占干重的含量也達(dá)到了56.6%，表明合成高熱值碳?xì)浠衔锏腅NN41同時(shí)具有較高的生長(zhǎng)速度。布朗葡萄藻ENN41具有的高生長(zhǎng)速度、生物量積累能力和產(chǎn)烴能力在國(guó)內(nèi)布朗葡萄藻的研究中還是首次報(bào)道，并且，這樣的結(jié)果與利用相似培養(yǎng)條件和柱式反應(yīng)器的王元麗等［19］，高保燕等［20］報(bào)道的真眼點(diǎn)藻、柵藻產(chǎn)量相似，也就是說(shuō)，布朗葡萄藻ENN41的生長(zhǎng)速度和生物量積累能力能夠趕上以生長(zhǎng)快速、生物量積累能力高著稱(chēng)的真眼點(diǎn)藻和柵藻了。日本的研究者Kojima等［21］報(bào)道利用柱式光反應(yīng)器（內(nèi)徑為7 cm，8.5 cm高的圓錐形底部）培養(yǎng)布朗葡萄藻，在反應(yīng)器內(nèi)壁光強(qiáng)約為140 μmol/（m2·s），培養(yǎng)25d，其生物量達(dá)到了7 g/L，烴含量為干重的50%。另有文獻(xiàn)報(bào)道在鼓泡塔反應(yīng)器中用豬舍廢水培養(yǎng)布朗葡萄藻，可以有效的去除水中的氮磷，且藻細(xì)胞的干重達(dá)到了8.5 g/L，產(chǎn)烴量為0.95 g/L［22］。上述國(guó)外報(bào)道和作者關(guān)于布朗葡萄藻ENN41的研究結(jié)果表明，優(yōu)良的布朗葡萄藻藻株在合適的培養(yǎng)條件下，也具有高速生長(zhǎng)、積累高生物量的潛力和高產(chǎn)烴能力。

徐玲等［23］報(bào)道不同培養(yǎng)基對(duì)布朗葡萄藻脂肪酸組成沒(méi)有影響，其主要脂肪酸組成為棕櫚酸（C18：1）、油酸（C18：1）和亞麻酸（C18：3）。而Rao等［24］報(bào)道在Chu13培養(yǎng)基中主要脂肪酸為硬脂酸（C18：0）和亞油酸（C18：2），在培養(yǎng)基中添加一定濃度的NaCl后主要脂肪酸變?yōu)樽貦八幔–16：0）和油酸（C18：1）。而本研究中布朗葡萄藻ENN41培養(yǎng)后期主要脂肪酸為油酸（C18：1）、十八碳四烯酸（C18：4）和棕櫚酸（C16：0）。由此可見(jiàn)，不同株系的布朗葡萄藻其主要脂肪酸可能不同，且同一株布朗葡萄藻在不同培養(yǎng)條件或不同培養(yǎng)基下，主要脂肪酸可發(fā)生改變，但布朗葡萄藻的主要脂肪酸都是由C18和C16組成。

本研究中的布朗葡萄藻ENN41利用尼羅紅染色發(fā)現(xiàn)，大量的油脂分布在胞外基質(zhì)中，少部分分布在細(xì)胞內(nèi)。有文獻(xiàn)報(bào)道利用尼羅紅對(duì)烴類(lèi)進(jìn)行染色觀察，發(fā)現(xiàn)有大量油滴主要分布在胞外基質(zhì)中，細(xì)胞內(nèi)也清晰可見(jiàn)少量油滴的分布［25，26］。這與本研究染色基本結(jié)果一致，說(shuō)明胞外基質(zhì)是布朗葡萄藻ENN41儲(chǔ)藏?zé)N類(lèi)物質(zhì)的主要場(chǎng)所。Largeau C等［27］通過(guò)電子顯微鏡觀察進(jìn)一步表明，烴類(lèi)在胞外基質(zhì)中積累量可達(dá)到95%，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)積累的烴類(lèi)僅為5%左右。

4　結(jié)論

從海南博鰲海邊的淡水池塘中分離獲得的ENN41是一株布朗葡萄藻藻株。顯微形態(tài)觀察表明，ENN41的形態(tài)特征屬于葡萄藻； ENN41的18S rRNA基因序列與布朗葡萄藻的18S rRNA基因序列同源性最高。ENN41在柱式反應(yīng)器中培養(yǎng)16d，生物量為8.710 g/L，單位體積產(chǎn)率為0.483 g/（L·d），粗烴占干重的含量為56.6%； 主要脂肪酸為油酸（C18：1）、十八碳四烯酸（C18：4）和棕櫚酸（C16：0），三者只和占總脂肪酸組成的72.6%； 利用尼羅紅染色，可以清晰看見(jiàn)大量的油脂分布在細(xì)胞內(nèi)和胞外基質(zhì)中。ENN41在放大的板式反應(yīng)器中培養(yǎng)16d的單位體積產(chǎn)率、生物量和粗烴含量也達(dá)到了較高水平。本研究結(jié)果表明，ENN41是具有較高的生長(zhǎng)速度和粗烴積累能力的布朗葡萄藻藻株，具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用潛力。

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ISOLATION，IDENTIFICATION AND EVALUATION OF HYDROCARBON PRODUCING PERFORMANCE OF ONE BOTRYOCOCCUS STRAIN

CHEN Chuan-Hong，WU Hong，YIN Shun-Ji，MA Jian-Yuan and LI Qing
（State Key Laboratory of Coal-Based Low-Carbon Energy，Xinao Scientific & Technological Developmental Co.，Ltd.，Langfang 065001，China）

ENN41 is a freshwater strain isolated from Bo'Ao coast of Hainan Province. Microscopic observation showed that ENN41 has the unique morphological character of genus Botryococcus. The 18S rRNA gene of ENN41 was cloned for further species confirmation at molecular level. The homologous analysis showed that the 18S rDNA gene of ENN41 was highly homologous to the species of Botryococcus braunii in GenBank. ENN41 achieved a biomass productivity of 0.483 g/（L·d） and crude hydrocarbon content of 56.6% for 16 days culture in column reactor. The main fatty acids were oleic acid（C18：1），octadecatetraenoic acid（C18：4） and palmitic aid（C16：0），accounting for 72.6% of the total fatty acid. Large amount of lipid stained with Nile red in the extracellular matrix. ENN41 reached a high productivity after 16 days culture in plate bioreactor ［0.234 g/（L·d）］ with 20% crude hydrocarbon. All the results showed that ENN41 is a natural Botryococcus braunii strain with high productivity of biomass and lipids and high potential for industrial application.

ENN41； 18S rRNA； Botryococcus braunii； Biomass productivity； Crude hydrocarbon

Q949.2

A

1000-3207（2016）05-1012-08

10.7541/2016.131

2015-08-21；

2016-01-05

國(guó)家“973”項(xiàng)目（2012CB723606）； 國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(xiàng)（2012YQ15008715）資助 ［Supported by the National Basic Research Program of China（973 Program）（2012CB723606）； the National Key Scientific Instrument and Equipment Development Project（2012YQ15008715）］

陳傳紅（1982—），女，山東人； 碩士； 研究方向?yàn)樵孱?lèi)生物技術(shù)及應(yīng)用。E-mail：chench@enn.cn

吳洪，博士； E-mail：wuhong@enn.cn