崔煥忠，張 輝，楊雨江，尹 劍，蘭海楠，鄭 鑫（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

葉黃素對(duì)母鼠乳腺分泌IgA的促進(jìn)作用

崔煥忠，張 輝，楊雨江，尹 劍，蘭海楠，鄭 鑫*
（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

為明確葉黃素對(duì)母鼠乳腺分泌IgA能力的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)妊娠母鼠添加飼喂葉黃素，檢測(cè)母鼠血清中IgG、IgA和IgM含量變化，母鼠乳腺組織中IgA mRNA表達(dá)量和IgA抗體分泌細(xì)胞數(shù)量變化，以及仔鼠胃內(nèi)容物中IgA濃度變化。結(jié)果表明：在妊娠21 d和分娩后7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組血清中IgG和IgA濃度顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），IgM含量雖有升高，與正常對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；乳腺組織中IgA mRNA表達(dá)量無(wú)顯著變化（P＞0.05）；分娩后14 d IgA抗體分泌細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.05）；仔鼠胃內(nèi)容物中IgA含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。說(shuō)明給妊娠母鼠添加飼喂葉黃素可以增強(qiáng)乳腺分泌IgA的能力。

母鼠；葉黃素；乳腺；IgA

葉黃素（lutein）屬于類胡蘿卜素（carotenoid），在蔬菜、水果、花卉和某些藻類生物中廣泛存在[1]。天然葉黃素具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，目前對(duì)葉黃素的研究主要集中在抗氧化作用[2-3]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[4-7]、預(yù)防心血管與老年性疾病[8-10]以及對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)[11-13]。鑒于葉黃素安全無(wú)毒，已被作為食品補(bǔ)充劑在食品、飲料、化妝品、保健食品，甚至嬰幼兒食品中添加，研究開發(fā)以葉黃素為功能因子的功能性食品和膳食補(bǔ)充劑已成為食品產(chǎn)業(yè)中的研究熱點(diǎn)[6]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，妊娠母鼠飼喂葉黃素，可以增強(qiáng)仔鼠被動(dòng)免疫能力。被動(dòng)免疫是新生兒能夠存活和健康生長(zhǎng)的關(guān)鍵，而初乳和常乳是新生兒營(yíng)養(yǎng)和免疫組成的來(lái)源，其中乳汁中IgA是提供新生兒消化道黏膜免疫主要免疫球蛋白。母鼠免疫水平高低直接影響新生仔鼠免疫水平，且乳腺分泌IgA能力的高低與仔鼠被動(dòng)免疫密切相關(guān)，妊娠母鼠添加葉黃素提高仔鼠被動(dòng)免疫水平是否是通過(guò)提高母鼠乳腺生成與分泌IgA能力來(lái)實(shí)現(xiàn)尚未見報(bào)道。本研究對(duì)妊娠母鼠添加飼喂葉黃素，檢測(cè)母鼠血清中免疫球蛋白及乳腺生成與分泌IgA水平，明確添加葉黃素對(duì)妊娠母鼠乳腺分泌IgA能力的影響，為富含葉黃素食品開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康7～8 周齡雌性昆明鼠50 只、雄性昆明鼠25 只，體質(zhì)量24～28 g，購(gòu)自于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2003-0001。

1.1.2 材料與試劑

葉黃素（純度為95%） 西安瑞林生物科技有限公司。

Mouse IgA、IgG及IgM酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）定量試劑盒 美國(guó)Bethyl公司；SABC three-step試劑盒 杭州博士德生物有限公司；RNAiso Plus Kit、PrimeScript RT?Reagent Kit with gDNA Eeaser（Perfect Real Time）、SYBR?Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus） 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及添加飼喂

小鼠購(gòu)買后，給予1 周的時(shí)間適應(yīng)環(huán)境，飼養(yǎng)環(huán)境為無(wú)致病菌，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為21～24 ℃，相對(duì)濕度為48%～65%。1 周后開始實(shí)驗(yàn)，將2 只雌鼠和1 只雄鼠于20：00放于同一籠中飼養(yǎng)，第二天8：00檢查陰道栓，選取陰道栓陽(yáng)性的雌鼠32 只，隨機(jī)分為4 組，每組8 只，兩組為葉黃素添加實(shí)驗(yàn)組，兩組為正常對(duì)照組。其中實(shí)驗(yàn)一組用于母鼠妊娠7、14、21 d的血液樣品、母鼠分娩后7 d的血液樣品和乳腺組織樣品以及仔鼠出生7 d胃內(nèi)容樣品的采集；實(shí)驗(yàn)二組用于母鼠分娩后14 d血液樣品和乳腺組織樣品以及仔鼠出生14 d胃內(nèi)容樣品的采集。所有實(shí)驗(yàn)小鼠單籠飼養(yǎng)，參照張靜等[12]飼喂小鼠葉黃素的劑量1.2 mg/（kg·d）（以體質(zhì)量計(jì)，下同）以及Kim等[14]飼喂犬的劑量，從妊娠開始實(shí)驗(yàn)一組和實(shí)驗(yàn)二組小鼠按每千克日糧添加50 mg葉黃素進(jìn)行添加飼喂實(shí)驗(yàn)，正常對(duì)照組小鼠飼喂正常日糧（含有葉黃素），添加時(shí)間為從母鼠妊娠開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.2 樣品采集及處理

1.2.2.1 母鼠血液樣品的采集

分別于母鼠妊娠7、14、21 d、分娩后7 d和14 d時(shí)，乙醚麻醉實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組各8 只母鼠，斷尾采集母鼠的血液樣品，樣品室溫放置1 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，分裝后，置于－20 ℃保存，用于免疫球蛋白含量的測(cè)定。

1.2.2.2 母鼠乳腺組織樣品的采集

分別于母鼠分娩后7 d和14 d時(shí)，乙醚麻醉實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組各8 只母鼠，在完成上述血液樣品采集后，處死母鼠，采集乳腺組織，一部分乳腺組織樣品迅速用液氮凍存，用于IgA mRNA表達(dá)量的分析；另一部分乳腺組織樣品用10%福爾馬林中性固定液進(jìn)行固定，用于免疫組化分析IgA抗體分泌細(xì)胞（IgA antibody-secreting cell，IgA ASC）數(shù)量。

1.2.2.3 仔鼠胃內(nèi)容物樣品的采集

分別在仔鼠出生7 d和14 d時(shí)，每窩各取5 只仔鼠，實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組各取40 只仔鼠，乙醚麻醉后處死仔鼠，采集胃內(nèi)容樣品，分裝后，置于－20 ℃保存，用于IgA含量的測(cè)定。

1.2.3 母鼠血清中免疫球蛋白含量的測(cè)定

將血清樣品于室溫解凍，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋2 000 倍，按照Mouse IgA、IgG及IgM ELISA定量試劑盒說(shuō)明書操作步驟，測(cè)定血清樣品中IgG、IgA及IgM的含量，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)，計(jì)算樣品中IgG、IgA及IgM的含量，分析妊娠7、14、21 d、分娩后7 d和分娩后14 d血清中免疫球蛋白含量的變化[14-15]。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)乳腺組織 IgA mRNA表達(dá)量[16]

液氮研磨乳腺組織樣品，利用RNAiso Plus Kit提取樣品中總RNA，利用PrimeScript RT?Reagent Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR?Premix Ex Taq? II說(shuō)明書步驟進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），引物序列如下：IgA C段恒定區(qū)：正向引物5’-TGCACAGTTACCCATCCTGA-3’，反向引物5’-GCACCAGCACTTCTTTAGGG-3’；β-actin：正向引物5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAA-3’，反向引物5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’。以β-actin為內(nèi)參基因，采用ΔΔCt方法分析IgA mRNA表達(dá)變化。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)乳腺IgA ASC數(shù)量

乳腺組織樣品用10%福爾馬林中性固定液固定24 h后，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟處理，包埋于石蠟中，制成6 μm厚度的切片，切片經(jīng)烘片、脫蠟、復(fù)水后，利用SABC three-step試劑盒進(jìn)行免疫反應(yīng)，顯色結(jié)束后，再進(jìn)行脫水透明和封片。每只母鼠隨機(jī)選取5 個(gè)不同400×電鏡下視野，利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6 仔鼠胃內(nèi)容物中IgA含量的測(cè)定

將胃內(nèi)容物樣品于室溫解凍，用含有蛋白酶抑制劑的PBS進(jìn)行200 倍稀釋，利用ELISA定量試劑盒測(cè)定樣品中IgA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 母鼠血清中免疫球蛋白的含量

圖1 母鼠血清中IgG（a）和IgA（b）含量（n==88）Fig. 1 Serum IgG (a) and IgA (b) concentrations in maternal mice (n = 8)

從妊娠開始至分娩后14 d，每隔7 d采血一次，利用ELISA定量試劑盒測(cè)定血清中IgG、IgA和IgM的含量，結(jié)果如圖1所示，從妊娠第7天開始，IgG和IgA含量開始升高，妊娠21 d時(shí)達(dá)到最高，妊娠21 d和分娩后7 d時(shí)均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），表明添加飼喂葉黃素可以增加母鼠血清中IgG和IgA水平；血清中IgM的含量與正常對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異（圖中未顯示）。

2.2 母鼠乳腺組織中IgA mRNA表達(dá)量

圖2 母鼠乳腺中IgA mRNA表達(dá)量（n==88）Fig. 2 IgA mRNA expression in maternal mammary glands (n = 8)

根據(jù)IgA C區(qū)恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)1 對(duì)引物，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IgA mRNA表達(dá)量，結(jié)果如圖2所示，在分娩后7 d和14 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組母鼠乳腺中IgA mRNA表達(dá)量與正常對(duì)照組相比均沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）（圖中未顯示）。

2.3 母鼠乳腺組織中IgA ASC數(shù)量檢測(cè)結(jié)果

表1 母鼠乳腺中IgA ASC數(shù)（x =8）Table 1 Number of IgA ASC in maternal mammary glands (s, = 8)

表1 母鼠乳腺中IgA ASC數(shù)（x =8）Table 1 Number of IgA ASC in maternal mammary glands (s, = 8)

注：*. 與正常對(duì)照組相比，差異顯著（P＜0.05）。

組別IgA ASC數(shù)量/（個(gè)/10 000 μm2）分娩后7 d 分娩后14 d正常對(duì)照組 6.3±0.48.8±0.6實(shí)驗(yàn)組 6.7±0.511.9±0.9*

免疫組化方法檢測(cè)IgA ASC數(shù)量，由表1可知，實(shí)驗(yàn)組母鼠分娩后7 d和14 d IgA ASC數(shù)量均增加，并于分娩后14 d顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。

2.4 仔鼠胃內(nèi)容物中的IgA含量

表2 仔鼠胃內(nèi)容物中IgA含量測(cè)定結(jié)果（±s，n==4400）Table 2 IgA content in stomach contents of neonatal mice (, n = 40)

表2 仔鼠胃內(nèi)容物中IgA含量測(cè)定結(jié)果（±s，n==4400）Table 2 IgA content in stomach contents of neonatal mice (, n = 40)

注：**. 與正常對(duì)照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。

組別IgA含量/（μg/g）分娩后7 d分娩后14 d正常對(duì)照組14.1±3.141.9±4.5實(shí)驗(yàn)組26.8±3.7**71.2±8.6**

檢測(cè)出生仔鼠胃內(nèi)容物IgA含量，結(jié)果如表2所示，實(shí)驗(yàn)組仔鼠在分娩后7 d和14 d胃內(nèi)容物中IgA含量均極顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。

3 結(jié)論與討論

在化妝品、飲料和食品行業(yè)中作為食品添加劑和保健食品原料被廣泛使用的葉黃素，其在提高機(jī)體免疫能力方面的作用越來(lái)越被重視。研究表明，給禽類添加飼喂葉黃素，不僅可以有效阻止自由基對(duì)胚胎的過(guò)氧化損傷[17-18]，還可提高幼雛血清抗氧化水平[19]。種蛋中葉黃素含量高，孵化后其子代具有良好的淋巴細(xì)胞合成能力和細(xì)胞免疫能力。給雌鵪鶉及子代鵪鶉飼料中添加葉黃素，可以顯著提高卵黃中IgG水平，子代鵪鶉血清IgG的含量與葉黃素的添加量成正比，高劑量葉黃素可顯著提高1 日齡子鵪鶉血清中IgG水平[20]。

高品質(zhì)乳汁對(duì)新生兒獲得最佳營(yíng)養(yǎng)和被動(dòng)免疫至關(guān)重要，IgA是乳汁中最主要的一種免疫球蛋白，可為新生兒提供保護(hù)對(duì)抗致病微生物抗原[21-22]。本研究開展了對(duì)妊娠母鼠添加飼喂葉黃素，檢測(cè)乳腺分泌IgA的能力，結(jié)果表明，添加飼喂葉黃素可以顯著增加母鼠血清中IgG和IgA含量，乳汁中和黏膜分泌物中的IgA可能來(lái)自于血清中IgA[23]，因此血清中IgA含量的增加有助于向乳汁中轉(zhuǎn)移。母鼠添加飼喂葉黃素，雖然乳腺組織中的IgA mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著變化，但乳腺中IgA ASC數(shù)量顯著增 加，表明乳腺分泌IgA的能力增強(qiáng)。分娩后14 d，仔鼠胃內(nèi)容物中IgA含量升高極顯著，也反映出添加葉黃素可有效增加母鼠乳汁中IgA的含量，這與β-胡蘿卜素營(yíng)養(yǎng)作用類似[24-25]。綜上，妊娠母鼠添加飼喂葉黃素，可有效增加乳腺分泌IgA的能力，有助于增強(qiáng)仔鼠被動(dòng)免疫能力。因此，葉黃素作為保健食品原料或食品添加劑，可能提高母體乳汁中IgA的含量，提高新生兒被動(dòng)免疫能力，促進(jìn)人類健康。

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Promoting Effect of Lutein on the IgA Secretion Capacity of Mammary Glands in Maternal Mice

CUI Huanzhong, ZHANG Hui, YANG Yujiang, YIN Jian, LAN Hainan, ZHENG Xin*
(College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

The present experiment was conducted to explore the effect of supplemental lutein on the serum concentrations of IgG, IgA and IgM, the mRNA expression of IgA C-region and the number of IgA antibody-secreting cells (ASC) in breast of maternal mice as well as IgA concentration in stomach contents of neonatal mice. Maternal mice were fed rodent feed or 50 mg/kg lutein-supplemented rodent feed during pregnancy and after parturition. The serum concentrations of IgG and IgA increased signifi cantly at 21 days of pregnancy and at 7 days after parturition (P < 0.05), but IgM concentration and the mRNA expression of IgA C-region were not signifi cantly affected by lutein supplementation (P > 0.05). The number of IgA ASC at 14 days after parturition (P < 0.05) and the IgA concentration in stomach contents of neonatal mice at 7 and 14 days after parturition were enhanced markedly (P < 0.01) in response to lutein supplemention. These results indicated that supplemental lutein for maternal mice is effective in enhancing the secretion of IgA in mammary glands.

maternal mouse; lutein; mammary glands; IgA

10.7506/spkx1002-6630-201611037

R392.9

A

1002-6630（2016）11-0214-04

崔煥忠, 張輝, 楊雨江, 等. 葉黃素對(duì)母鼠乳腺分泌IgA的促進(jìn)作用[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 214-217. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611037. http://www.spkx.net.cn

CUI Huanzhong, ZHANG Hui, YANG Yujiang, et al. Promoting effect of lutein on the IgA secretion capacity of mammary glands in maternal mice[J]. Food Science, 2016, 37(11): 214-217. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611037. http://www.spkx.net.cn

2015-08-23

吉林省科技廳國(guó)際科技合作項(xiàng)目（20130413037GH）；吉林省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20140101028JC）

崔煥忠（1973—），男，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)免疫調(diào)控。E-mail：huanzhongcui@163.com

*通信作者：鄭鑫（1965—），女，教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控。E-mail：zhengxinjilin@126.com