李強(qiáng)坤，柳陳堅(jiān)，張園蓮，常林杰，羅義勇，李曉然*（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

植物乳桿菌對(duì)食源性病原菌作用的研究

李強(qiáng)坤，柳陳堅(jiān)，張園蓮，常林杰，羅義勇，李曉然*
（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

通過(guò)牛津杯法篩選得到幾株高抑菌活性的植物乳桿菌，使用蛋白酶K和NaOH對(duì)這幾株桿菌的發(fā)酵液上清進(jìn)行處理，以大腸桿菌O157:H7和金黃色葡萄球菌為指示菌，發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸為主要抑菌物質(zhì)，但是調(diào)節(jié)pH值至6.5后的發(fā)酵上清液可以對(duì)大腸桿菌有較好的抑菌效果。其中植物乳桿菌QB3-3具有長(zhǎng)達(dá)96 h的持續(xù)抑菌效果。電子顯微鏡觀察顯示，植物乳桿菌抗病原菌的主要機(jī)理為破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致病原菌菌體形態(tài)改變，內(nèi)容物流出，致使細(xì)胞死亡。

植物乳桿菌；有機(jī)酸；抑菌

食源性病原菌是指能在攝食過(guò)程中引起感染或中毒的一類微生物[1]，它廣泛存在于食物、環(huán)境以及人和動(dòng)物腸道內(nèi)，能引起食物腐敗、食源性腹瀉等一系列衛(wèi)生問(wèn)題[2-3]。使用抗生素與化學(xué)防腐劑可有效控制與殺滅食源性病原菌，然而，使用諸如苯甲酸（鈉）、丙酸鹽、對(duì)羥基苯甲酸酯類、硝酸鹽、山梨酸（鉀）等化學(xué)防腐劑不但會(huì)造成菌株的耐藥性不斷出現(xiàn)，同時(shí)也容易引起人的致畸與致癌等危害[4-5]，給人類健康造成嚴(yán)重威脅。隨著我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人民生活水平的不斷提高，食品安全受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注，食品污染造成的疾病已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，而食源性病原菌污染是引起食品安全問(wèn)題的主要原因[6]。生物防腐劑對(duì)人體健康造成的危害較小，并且具有對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)成分及感官性狀影響較小等優(yōu)勢(shì)[7-9]，同時(shí)還能減少防腐費(fèi)用及有效延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期。此外，生物防腐劑還可避免化學(xué)防腐中出現(xiàn)的食物鏈的抗生素耐藥性問(wèn)題[10]。因此，生物防腐不但受到研究者們的關(guān)注與重視，同時(shí)也深受普通百姓青睞。

乳酸菌是一類能將碳水化合物（主要指葡萄糖）發(fā)酵產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸的細(xì)菌。因其能產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素、環(huán)二肽、短鏈脂肪酸等多種抑菌活性物質(zhì)[11-12]，故能有效抑制各類病原菌的生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到維持機(jī)體微生態(tài)平衡，發(fā)揮相應(yīng)的益生功能[13]。乳酸菌是被公認(rèn)為安全（generally recognized as safe，GRAS）的食品級(jí)微生物（food-grade microorganisms）。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）屬于芽孢桿菌綱乳桿菌屬（Lactobacillus）[14]，通常存在于發(fā)酵蔬菜與果汁中，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其存在于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品與肉類中，其發(fā)酵的食品被公認(rèn)為功能性食品[15]。植物乳桿菌能通過(guò)胃并定殖于腸道，發(fā)揮其調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、免疫調(diào)節(jié)、降低血清膽固醇、降血壓和抗氧化等益生作用[15]。

地處西南低緯度地區(qū)的云南省因其多民族的文化背景，造就了獨(dú)特的飲食風(fēng)俗，從而富有多樣的傳統(tǒng)發(fā)酵食品資源，如乳餅、豆豉。前期研究表明，在云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉與乳餅中存在大量乳酸菌[16]，本實(shí)驗(yàn)從中篩選出3 株對(duì)食源性病原菌具有高效抑菌效果的植物乳桿菌，初步探究該乳酸菌的抗食源性致病菌的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

從云南傳統(tǒng)發(fā)酵食品（乳餅、豆豉）分離得到3株具有高效抑菌功能的植物乳桿菌AY01、YM4-3、QB3-3菌株、食源性大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌，保存于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室。

瓊脂 BIOSHARP公司；蛋白酶K 德國(guó)MERCK公司；其他試劑均為分析純。

MRS培養(yǎng)基（g）：蛋白胨10.0、Lab-lemco poweder 8.0、酵母提取物4.0、葡萄糖20.0、磷酸氫二鉀2.0、醋酸鈉5.0、檸檬酸三銨2.0、七水硫酸鎂0.2、四水硫酸錳0.05、Tween-80 1 mL。加蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌15 min，冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

腦心浸液肉湯（brian heart infusion，BHI）培養(yǎng)基（g）：蛋白胨 10.0、牛肉浸粉3.0、氯化鈉5.0、葡萄糖1.0，調(diào)pH值至7.4±0.1（25 ℃），加蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌15 min，冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

肉湯（LB）培養(yǎng)基（g）：蛋白胨 10.0、酵母粉 5.0、氯化鈉 5.0、葡萄糖1.0，調(diào)pH值至7.1±0.1（25 ℃），加蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌15 min，冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器 中國(guó)上海智城公司；ABI 7200 PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；UV-4802H紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；電鏡、FD-5-12真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)SIM公司；SX-500高壓滅菌鍋 日本TOMY公司；K3-18高速離心機(jī) 德國(guó)Sartorius公司；DYCP-31DN電泳儀美國(guó)BIO-RAD公司；SYIGLHR/1206凝膠成像系統(tǒng)英國(guó)Ingenius公司；BX-51研究級(jí)生物顯微鏡 日本Olympus公司；GHP-9160恒溫培養(yǎng)箱 中國(guó)恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌DNA的分離純化

將冷凍保存的菌株解凍后按體積分?jǐn)?shù)4‰接種量接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃靜置培養(yǎng)24 h，吸取1.5 mL菌液置于1.5 mL離心管中，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄去上清。然后加入567 μL TE緩沖液、3 μL蛋白酶K（20 mg/mL）、30 μL 10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate, sodium salt，SDS），充分混勻后，置于37 ℃金屬浴孵育1 h。孵育結(jié)束后，加入80 μL十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）裂解液與100 μL 5 mol/L NaCl溶液，充分混勻后放入60 ℃金屬浴孵育15 min。隨后加入780 μL Tris-飽和酚充分振蕩混勻，4 ℃、15 000 r/min離心10 min，取上清液，加入與上清液等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），充分振蕩混勻，4℃、15 000 r/min離心10 min后取上清液，加入0.6倍上清液體積的冷異丙醇，充分混勻后靜置于－80 ℃條件下3 h。隨后取出低溫解凍，4 ℃、18 000 r/min離心15 min，棄去上清液，收集DNA沉淀，加入500 μL 70%的乙醇洗液洗脫2 次，4 ℃、18 000 r/min離心15 min后棄去上清液，置于室溫使DNA沉淀充分干燥后，加入40 μL TE緩沖液。取5 μL DNA提取液與Loading Buffer混合進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)基因組DNA，并選擇檢測(cè)到基因組DNA條帶的樣品，－80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 dnaK基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)及序列分析

采用細(xì)菌dnaK基因通用引物，用所提取的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。dnaK通用引物核苷酸序列為：Lpdnak-500F3（5’-CCGTTCTTRTCRATRTCRAA-3’）；Lpdnak-1710R5（5’-GAAAYYCAAGTYGGHGAAGT-3’）。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR反應(yīng)完成后，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 g/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳后將凝膠浸泡于含有20 μg/mL EB的TAE緩沖液中10 min，之后于紫外燈216 nm波長(zhǎng)下照射，觀察條帶是否呈現(xiàn)橙色。將PCR產(chǎn)物純化后，由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行核苷酸序列分析，提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），用BLAST分析工具（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST）將核苷酸序列與GenBank中已知核苷酸序列進(jìn)行同源性對(duì)比。若被檢菌株與參考菌株核苷酸序列同源性大于97%，將被認(rèn)為是同一個(gè)菌種。最后用MEGA6.05軟件的Neighbor-Joining法進(jìn)行比對(duì)分析和建立系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap重復(fù)1 000 次。

1.3.3 植物乳桿菌發(fā)酵上清液的制備

解凍保存的植物乳桿菌AY01、YM4-3、QB3-3，將濃度為1×109CFU/mL的植物乳桿菌菌液按體積分?jǐn)?shù)4‰的接種量分別接種至滅菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜止培養(yǎng)24 h后，再將其按體積分?jǐn)?shù)4‰的接種量接種至300 mL錐形瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)72 h，隨后4 ℃、12 000 r/min離心10 min后吸取上清液，分別將各菌株150 mL培養(yǎng)上清液分成3 等份，每種菌的3等份發(fā)酵上清液分別進(jìn)行以下處理：1 份加入50 mg的蛋白酶K，終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，45 ℃水浴3 h；1 份加入NaOH溶液調(diào)pH值至6.5；1 份不做任何處理。將經(jīng)上述處理的上清液用真空冷凍干燥法進(jìn)行濃縮，濃縮后用0.9%生理鹽水將粉末溶解為終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液，最后用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后，備用。

1.3.4 病原指示菌的制備

將－80 ℃冷凍保存的大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌取出并迅速解凍，按體積分?jǐn)?shù)4‰的接種量分別將其接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基和BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)15 h，同時(shí)控制光密度值（optical density，OD）在0.2～0.8范圍內(nèi)。將培養(yǎng)好的菌液稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。大腸桿菌的菌落濃度為1.95×109CFU/mL，金黃色葡萄球菌的菌落濃度為2.83×109CFU/mL，再將活化好的病原菌菌液進(jìn)行梯度稀釋，用于抑菌實(shí)驗(yàn)。

采用牛津杯法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，在底層平板中倒入10 mL 2%普通瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，按等邊三角形放置3 個(gè)牛津杯。待上層培養(yǎng)基（大腸桿菌為L(zhǎng)B瓊脂培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌為BHI瓊脂培養(yǎng)基）冷卻至50 ℃左右時(shí)，取20 μL病原指示菌稀釋液倒入25 mL 1%的上層瓊脂培養(yǎng)基中，使大腸桿菌的終菌落總數(shù)為1.56×105CFU/mL，金黃色葡萄球菌的終菌落總數(shù)為2.26×105CFU/mL，搖勻后倒板。上層培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯，在3 個(gè)孔中分別加入50、100、150 μL的抑菌物質(zhì)（即植物乳桿菌發(fā)酵上清液），再用0.9%生理鹽水定容至每孔150 μL，置于4 ℃直至抑菌液體完全擴(kuò)散至瓊脂培養(yǎng)基中，再置于37 ℃培養(yǎng)16 h，觀察并測(cè)定抑菌圈的直徑，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3 組平行。

病原指示菌敏感度的判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑＞20 mm為極度敏感；抑菌圈直徑15～20 mm為高度敏感；抑菌圈直徑l0～15 mm為中度敏感；抑菌圈直徑＜10 mm為低度敏感；無(wú)抑菌圈為不敏感[17]。

1.3.5 植物乳桿菌QB3-3菌株抑菌效果的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

將50 μL活化的大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌菌液添加至450 μL生理鹽水中，吸取20 μL病原菌稀釋液添加至5 mL相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，分別向病原菌液體培養(yǎng)基中添加200、400、600 μL植物乳桿菌QB3-3發(fā)酵上清液，另外，將未添加任何抑菌溶液的病原菌菌液做為空白對(duì)照，在150 r/min，37 ℃的條件下振蕩培養(yǎng)，前12h每隔1 h測(cè)定其在600nm波長(zhǎng)處的OD值，之后每隔12 h測(cè)一次。

1.3.6 植物乳桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)指示菌抑菌作用的電子顯微鏡觀察

吸取200 μL植物乳桿菌QB3-3菌株發(fā)酵上清液至經(jīng)過(guò)培養(yǎng)3 h且初始大腸桿菌濃度為1×109CFU/mL、5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)15 h；將200 μL 0.9%生理鹽水添加至相同條件的LB液體培養(yǎng)基中作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃，3 000 r/min離心10 min取沉淀，用0.75%生理鹽水洗脫菌體2 次，用1.5 mL固定液將菌體固定。用掃描電鏡與透射電鏡觀察病原菌形態(tài)變化，探討植物乳桿菌源抑菌物質(zhì)的抑菌機(jī)理。

采用同樣方法分析植物乳桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 株植物乳桿菌亞種的鑒定

植物乳桿菌群包括Lb. paraplantarum、Lb. pentosus 2個(gè)種和Lb. plantarum ssp. plantarum、Lb. plantarum ssp. argentoratensis 2 個(gè)亞種，由于16S rRNA基因同源性較高，不能將植物乳桿菌鑒定到種或亞種的水平，而乳酸菌含有的編碼適應(yīng)酸環(huán)境的伴侶蛋白DnaK的dnaK基因常用于亞種的鑒定[18]。通過(guò)對(duì)植物乳桿菌AY01、YM4-3、QB3-3的dnaK基因的核苷酸序列進(jìn)行分析和同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，從云南省石林縣傳統(tǒng)發(fā)酵乳餅的發(fā)酵酸水中分離得到的植物乳桿菌AY01菌株屬于Lb. paraplantarum（序列同源性為99%），而分別從云南省丘北縣與易門縣傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉分離得到的菌株QB3-3與YM4-3和Lb. plantarum與Lb. plantarum ssp. plantarum的同源性均高于99%，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可以將這2 株植物乳桿菌鑒定為植物乳桿菌植物乳桿亞種。

圖1 dnaKdnaK基因序列比對(duì)的植物乳桿菌亞種的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree for L. plantarum subspecies based on dnaK gene sequence alignment

2.2 植物乳桿菌發(fā)酵上清液的抑菌活性

3 株植物乳桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)表明，發(fā)酵上清原液與經(jīng)蛋白酶K處理上清液對(duì)2 株病原菌均有抑菌作用（表1），對(duì)大腸桿菌的抑菌效果明顯優(yōu)于金黃色葡萄球菌。經(jīng)NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.5后，除添加高劑量（150 μL）植物乳桿菌YM4-3時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)微弱抑菌活性外，其余2 株植物乳桿菌對(duì)上述2 株食源性致病菌均未呈現(xiàn)抑菌效果。綜合分析抑菌效果，植物乳桿菌QB3-3抑菌效果最好，其次是植物乳桿菌YM4-3。3 株植物乳桿菌的發(fā)酵上清液均顯示較佳的抑菌效果，但對(duì)2 株病原菌產(chǎn)生抑菌效果所需的發(fā)酵上清液體積不同，100 μL的培養(yǎng)上清液即對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生較好的抑菌效果，而150 μL的培養(yǎng)上清液才對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生較好的抑菌效果。

表1 植物乳桿菌發(fā)酵上清液對(duì)食源性病原菌的抑菌效果Table 1 Antimicrobial effect ofL. plantaarruumm against foodborne pathogennss

植物乳桿菌的抑菌物質(zhì)主要分為蛋白類和非蛋白類物質(zhì)，蛋白類抑菌物質(zhì)主要為細(xì)菌素，是一種核糖體合成的抗菌肽，這些化合物可以作為安全的天然食品生物防腐劑[19]。但細(xì)菌素并不是這3 株植物乳桿菌的主要抑菌物質(zhì)[20-21]。乳酸菌產(chǎn)生的非蛋白類物質(zhì)主要為有機(jī)酸，大多數(shù)乳酸菌發(fā)酵碳水化合物生成乳酸、乙酸和蘋果酸等有機(jī)酸，使環(huán)境pH值降低，抑制病原菌的生長(zhǎng)，同時(shí)確保自身生長(zhǎng)繁殖不受影響[22]。植物乳桿菌的抑菌效果主要依賴其代謝產(chǎn)物，其中，有機(jī)酸就是其中的主要抑菌物質(zhì)。

2.3 植物乳桿菌QB3-3抑菌效果的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

根據(jù)3 株植物乳桿菌抑菌實(shí)驗(yàn)，選擇抑菌效果最好的QB3-3進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間抑菌實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)通過(guò)軟件Prism 6作圖分析得圖2、3。植物乳桿菌QB3-3在對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌長(zhǎng)達(dá)96 h的抑菌過(guò)程中，發(fā)酵原液的抑菌效果最佳，經(jīng)蛋白酶K處理的上清液抑菌效果次之，調(diào)節(jié)pH值至6.5的上清液抑菌效果最差。

圖3 植物乳桿菌QB3-3對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)Fig. 3 Real-time monitoring of the antimicrobial effect of L. plantarum QB3-3 against S. aureus

值得注意的是，當(dāng)發(fā)酵上清液為600 μL時(shí)，即使pH值調(diào)至6.5，也對(duì)大腸桿菌有很好的抑菌效果。在Tulini等[23]的研究中，植物乳桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌不產(chǎn)生抑菌作用，而在本實(shí)驗(yàn)中，調(diào)節(jié)pH值后的發(fā)酵上清液主要的抑菌成分應(yīng)為細(xì)菌素等蛋白質(zhì)類抑菌物質(zhì)，在較高添加量時(shí)表現(xiàn)出對(duì)大腸桿菌很好的抑制作用，說(shuō)明研究細(xì)菌素的抑菌效果時(shí)，需對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行濃縮。并且，應(yīng)對(duì)植物乳桿菌QB3-3所產(chǎn)的細(xì)菌素做更進(jìn)一步的研究。

2.4 植物乳桿菌抑制致病菌的電子顯微鏡觀察

圖4 抑菌物質(zhì)處理后的食源性病原菌電子顯微鏡圖Fig. 4 Photomicrographs of three L. plantarum strains with antibiotic susceptibility to E. coli O157:H7 and S. aureus

植物乳桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最好，并能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，推測(cè)與革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁不同有關(guān)。由圖4可知，抑菌物質(zhì)處理后的實(shí)驗(yàn)組和未經(jīng)處理的對(duì)照組中，大腸桿菌菌體表面存在明顯差異：1）正常生長(zhǎng)狀態(tài)的大腸桿菌菌體表面光滑、無(wú)空洞現(xiàn)象；經(jīng)抑菌物質(zhì)處理后的大腸桿菌菌體表面有黏絲狀物質(zhì)出現(xiàn)，菌體表面有褶皺并伴隨有空洞。2）正常生長(zhǎng)的金黃色葡萄球菌表面均勻光滑，無(wú)缺口；抑菌物質(zhì)處理后的金黃色葡萄球菌細(xì)胞的內(nèi)壁和外壁空間距離拉大，內(nèi)壁濃縮并擠壓細(xì)胞內(nèi)容物，致使細(xì)胞壁出現(xiàn)裂口，內(nèi)容物流出致死。在以前的研究中，Dieuleveux等[24]用掃描電鏡觀察經(jīng)苯乳酸作用前后的Listeria monocytogenes的超微結(jié)構(gòu)后推測(cè)，苯乳酸的作用位點(diǎn)為細(xì)胞壁，與溶菌酶的抗菌機(jī)理相似，不同于Nisin等細(xì)菌素作用于細(xì)胞膜。袁景環(huán)等[25]研究表明，苯乳酸具有殺菌作用，同時(shí)有一定的溶菌作用。通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡觀察顯示，經(jīng)苯乳酸作用后的致病菌的菌體形態(tài)發(fā)生明顯改變，部分菌體破裂，細(xì)胞質(zhì)流出。這些研究與本研究結(jié)果相似，因此，可以推測(cè)有機(jī)酸對(duì)細(xì)菌的作用靶點(diǎn)主要為細(xì)胞壁，而其具體的作用位點(diǎn)和抗菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)dnaK基因序列比對(duì)分析，確定植物乳桿菌AY01為L(zhǎng)b. paraplantarum（序列同源性為99%），YM4-3和QB3-3均為L(zhǎng)b. plantarum ssp. plantarum。

實(shí)驗(yàn)分別使用植物乳桿菌AY01、YM4-3、QB3-3的發(fā)酵上清液，NaOH處理后的發(fā)酵上清液、蛋白酶K處理后的發(fā)酵上清液，進(jìn)行對(duì)病原微生物大腸桿菌O157:H7和金黃色葡萄球菌的抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，這3 株菌的主要抑菌物質(zhì)為有機(jī)酸，其中菌株YM4-3和QB3-3具有微弱的非酸類抑菌物質(zhì)。電子顯微鏡結(jié)果顯示，經(jīng)發(fā)酵液處理后的病原菌菌體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，內(nèi)容物流出，可見(jiàn)這3 株植物乳桿菌抗菌主要機(jī)理為破壞病原菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出，致使細(xì)胞死亡。這些植物乳酸菌可作為優(yōu)良的菌株，經(jīng)改造后用于食品的防腐，具有良好的應(yīng)用前景。

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Antagonistic Mechanism of Lactobacillus plantarum against Foodborne Pathogenic Bacteria

LI Qiangkun, LIU Chenjian, ZHANG Yuanlian, CHANG Linjie, LUO Yiyong, LI Xiaoran*
(Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)

In this study, Oxford cup method was used to screen Lactobacillus plantarum strains with antibacterial effect. The fermentation supernatants from these strains were either treated with protease or adjusted for pH using NaOH before being tested for their ability to inhibit the foodborne pathogenic bacteria Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureu. Results showed that organic acid was the major antibacterial compound, yet when adjusted to pH 6.5 the fermentation supernatants had better inhibition ability against E. coli O157:H7. L. plantarum strain QB3-3 showed antibacterial effect for up to 96 h. In addition, the antagonistic mechanism of L. plantarum against foodborne pathogens was due to destruction of the cell structure resulting in morphological changes, leakage of cell contents and fi nally apoptosis as observed via electron microscopy.

Lactobacillus plantarum; organic acid; antibacterial activity

10.7506/spkx1002-6630-201611004

Q939.9

A

1002-6630（2016）11-0018-06

李強(qiáng)坤, 柳陳堅(jiān), 張園蓮, 等. 植物乳桿菌對(duì)食源性病原菌作用的研究[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 18-23. DOI:10.7506/

spkx1002-6630-201611004. http://www.spkx.net.cn LI Qiangkun, LIU Chenjian, ZHANG Yuanlian, et al. Antagonistic mechanism of Lactobacillus plantarum against foodborne pathogenic bacteria[J]. Food Science, 2016, 37(11): 18-23. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611004. http://www.spkx.net.cn

2015-07-08

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31160309）

李強(qiáng)坤（1992—），男，本科，研究方向?yàn)樯锕こ獭?E-mail：1764761547@qq.com

*通信作者：李曉然（1984—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锓肿由鷳B(tài)學(xué)。E-mail：starkeyran@163.com