王超，劉文靜，郭德軍，徐婉蒙，王成玉，李丹丹，阮長(zhǎng)青

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶　163319）

藍(lán)莓酒渣花色苷提取工藝的研究

王超，劉文靜，郭德軍，徐婉蒙，王成玉，李丹丹，阮長(zhǎng)青

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319）

為探究大興安嶺野生藍(lán)莓酒渣中的生物活性成分，以乙醇為提取劑，考察了乙醇濃度、鹽酸濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)藍(lán)莓酒渣花色苷提取量的影響，并通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取條件。結(jié)果表明：在乙醇濃度為40%，鹽酸濃度為0.1%，提取溫度為30℃，提取時(shí)間為1 h，料液比為1∶40時(shí)為最佳提取條件，此條件下藍(lán)莓酒渣中花色苷含量為3.03 mg·g-1，粗提物經(jīng)濃縮凍干后為黑色粉末，得率為22.1%，花色苷純度為1.37%。通過實(shí)驗(yàn)可知野生藍(lán)莓酒渣中含有大量花色苷等活性物質(zhì)，對(duì)藍(lán)莓酒渣進(jìn)行萃取可減少?gòu)U物排放，提高藍(lán)莓鮮果資源的綜合利用率，并為工業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

野生藍(lán)莓；酒渣；花色苷；提取

藍(lán)莓（blueberry）是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的越橘類漿果，其中除含有常規(guī)的糖、蛋白質(zhì)、膳食纖維外，還富含各種維生素以及鐵、錳、鋅等微量元素［1-2］。同時(shí)，其還含有大量的抗氧化活性物質(zhì)（如黃酮類、花色苷、多酚類化合物），具有促進(jìn)視紅素再合成、提高免疫力、抗衰老、抗癌等多種生理功效，因此被國(guó)際糧農(nóng)組織列為人類5大健康食品之一［3-6］。

藍(lán)莓已廣泛應(yīng)用于飲料、釀酒等食品行業(yè)，但其殘?jiān)院写罅坑行С煞治幢焕?，特別是其中花色苷等多酚物質(zhì)的開發(fā)和利用尚未引起關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓加工果酒后的殘留物，最多可占鮮果重量的20%［7］。其中，花色苷是藍(lán)莓酒渣中主要的活性成分，含量豐富，釀酒過程對(duì)花色苷的抗氧化和清除自由基活性影響很小，如果將這一資源加以綜合利用，就會(huì)大大提高藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益［8］。

目前，藍(lán)莓中花色苷的提取方法常見的有溶劑提取法［9］、超聲提取法［12］、微波提取法［10］、酶解法［11］、超臨界流體萃取法［14］等。其中溶劑提取法中水提法成本低，但提取率很低；超臨界流體萃取法對(duì)設(shè)備要求較高，生產(chǎn)成本高；超聲提取法不適合大規(guī)模生產(chǎn)［12-14］。針對(duì)國(guó)內(nèi)藍(lán)莓酒渣廢棄物未得到有效利用這一問題，探究大興安嶺野生藍(lán)莓酒渣中花色苷的提取方法，并優(yōu)化提取工藝條件，為藍(lán)莓酒渣中生物活性成分的基礎(chǔ)研究以及產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

野生藍(lán)莓酒渣：藍(lán)莓酒發(fā)酵后廢棄的酒渣，經(jīng)40℃干燥粉碎過60目篩后4℃冷藏備用。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所。甲醇，無水乙醇，丙酮，濃鹽酸，檸檬酸，乙酸，氯化鉀，三水合醋酸鈉，以上試劑均為分析純。

1.2試驗(yàn)主要儀器和設(shè)備

722s可見光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司制造；SHZ-C水浴恒溫振蕩器，金壇市榮華儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；ALPHA1-2 LD plus冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司。

2　試驗(yàn)條件和方法

2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

2.1.1提取工藝流程

藍(lán)莓酒渣→40℃烘干至恒重→粉碎過60目篩→提取液提取→過濾→濾液定量測(cè)定。

取一定量的藍(lán)莓酒渣粉在不同條件下提取，提取液過濾后定容到一定體積，稀釋一定倍數(shù)后，用pH示差法測(cè)量花色苷吸光值，計(jì)算其提取量。

2.1.2藍(lán)莓酒渣粗提物得率計(jì)算公式

公式（1）式中：a：藍(lán)莓酒渣粗提物得率；m1：粗提物質(zhì)量，g；m2：藍(lán)莓渣質(zhì)量，g。

2.1.3藍(lán)莓酒渣中花色苷純度計(jì)算公式

公式（2）式中：b：藍(lán)莓酒渣粗提物中花色苷純度；m1：粗提物質(zhì)量，g；m3：粗提物中花色苷含量，mg。

2.1.4花色苷的測(cè)定

研究采用的檢測(cè)方法是分光光度法，由于植物提取物在520 nm處除了花色苷外還有許多物質(zhì)都在下存在吸收，所以本實(shí)驗(yàn)采用pH示差法來消除其他物質(zhì)的干擾［15］，并根據(jù)李安文［16］的方法進(jìn)行改進(jìn)，分別各量取樣品1 mL 2份，分別加入pH 1.0和pH 1.5的緩沖液至10 mL，在520 nm和700 nm的條件下，檢測(cè)得到pH值為1.0和4.5時(shí)的兩組4個(gè)吸光度值A(chǔ)1、A2、A3、A4。

式中：A1、A2分別為pH 1.0和pH 4.5下520 nm的吸光度；

A3、A4分別為pH 1.0和pH 4.5下700 nm的吸光度。

通過公式（3）計(jì)算得到花色苷的吸光值A(chǔ)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=11.284x+0.008（R2=0.999 5）計(jì)算花色苷的提取量。

2.1.5花色苷的提取量

花色苷提取量（mg/g）=（C×Df×V）/m（4）

公式（4）式中：C：粗提液花色苷濃度，mg·ml-1；Df：稀釋倍數(shù)；V：提取液的總體積，mL；m：藍(lán)莓酒渣質(zhì)量，g。

2.1.6提取工藝單因素試驗(yàn)

（1）提取劑種類對(duì)提取花色苷的影響

分別選擇水、甲醇、乙醇、丙酮作為提取劑，加入0.2%的鹽酸進(jìn)行酸化，在30℃，料液比1∶20，轉(zhuǎn)速200 r·min-1的條件下提取l h，過濾后測(cè)定花色苷含量，選擇最佳提取溶劑。

（2）提取劑濃度對(duì)提取花色苷的影響

用0.2%鹽酸酸化的0%、20%、40%、60%、80%、100%的最佳溶劑，在30℃，料液比1∶20，轉(zhuǎn)速200 r·min-1的條件下提取1 h，過濾后測(cè)定花色苷含量，選擇最佳提取劑濃度。

（3）酸種類對(duì)提取花色苷的影響

選擇最佳濃度的提取劑，分別選擇0.2%檸檬酸、乙酸、鹽酸作為酸性添加劑，在30℃，料液比1∶20，轉(zhuǎn)速200 r·min-1的條件下提取l h，過濾后測(cè)定花色苷含量，選擇最佳酸性添加劑。

（4）酸的濃度對(duì)提取花色苷的影響

提取劑中分別加入0.00%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%適宜的酸，在30℃，料液比1∶20，轉(zhuǎn)速200 r·min-1的條件下提取l h，過濾后測(cè)定花色苷含量，選擇添加酸的最佳濃度。

（5）料液比對(duì)提取花色苷的影響

以上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件，分別設(shè)定料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（w·v-1），在30℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1的條件下提取1 h，過濾后測(cè)定花色苷含量，選擇最佳料液比。

（6）提取時(shí)間對(duì)提取花色苷的影響

在上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件，在30℃、適宜的料液比，轉(zhuǎn)速200 r·min-1的條件下，分別提取1、2、3、4、5、6 h，過濾后測(cè)定花色苷含量，確定最佳的提取時(shí)間。

（7）提取溫度對(duì)提取花色苷的影響

在上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件，在30、40、50、60、70、80、90℃條件下提取，過濾后測(cè)定花色苷含量，確定最佳的提取溫度。

2.1.7提取正交試驗(yàn)

根據(jù)正交設(shè)計(jì)助手II v3.1設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，由于正交試驗(yàn)表不存在空列，所以設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)以進(jìn)行方差分析。

2.1.8藍(lán)莓酒渣粗提物得率和純度的計(jì)算

根據(jù)實(shí)驗(yàn)最佳的提取條件對(duì)藍(lán)莓酒渣進(jìn)行提取，之后把提取液濃縮凍干，計(jì)算藍(lán)莓酒渣粗提物得率及花色苷的純度。

3　結(jié)果與分析

3.1提取溶劑種類和提取劑濃度對(duì)花色苷提取量的影響

圖1　提取溶劑種類對(duì)花色苷提取量的影響Fig.1Effects of extraction solvent type on extracted anthocyanin

圖2　提取劑濃度對(duì)花色苷提取量的影響Fig.2Effects of extracting agent on extracted anthocyanin

由圖1可知，丙酮的提取效果明顯好于甲醇、乙醇和水，甲醇和乙醇的提取效果相近，丙酮的成本較高，不宜大批量使用，甲醇的沸點(diǎn)偏低、導(dǎo)致提取過程中溫度不能較高，而且具有毒性，在大規(guī)模生產(chǎn)中對(duì)設(shè)備的密閉性要求較高，所以實(shí)驗(yàn)選擇提取效果較好并較為安全的乙醇作為提取溶劑。

由圖2可知，0.2%鹽酸酸化的0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液提取時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，花色苷含量呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%的時(shí)候，花色苷提取量最高，因?yàn)楫?dāng)乙醇濃度過大時(shí)，會(huì)抑制花色苷的提取。這是由于水也是花色苷類化合物的良好溶劑，自然界中的花色苷能與提取原料中的蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)以氫健等作用力形成復(fù)合物［17］。因此，提取溶劑不僅要是良好的花色苷溶劑，還需要水來斷裂氫健，因而在水中加入一定量的乙醇形成復(fù)合體系更適宜花色苷的提取［18］。綜合考慮，選擇60%的乙醇作為提取溶劑。

3.2酸的種類和濃度對(duì)花色苷提取量的影響

圖3　酸的種類對(duì)花色苷提取量的影響Fig.3Effects of acid type on extracted anthocyanin

圖4　鹽酸濃度對(duì)花色苷提取量的影響Fig.4Effects of hydrochloric acid concentration on extracted anthocyanin

由圖3可知，以60%乙醇作為提取溶劑時(shí)，冰乙酸、鹽酸和檸檬酸對(duì)花色苷提取效果差別不大。因?yàn)辂}酸中的氯離子有利于花色苷烊離子結(jié)構(gòu)，同時(shí)考慮經(jīng)濟(jì)問題所以選擇鹽酸作為酸化劑［19］。

由圖4可知，以不同濃度的鹽酸乙醇溶液為提取劑時(shí)，鹽酸濃度的變化對(duì)花色苷提取量的影響較小，變化規(guī)律不明顯，但由于在提取劑中加入少量的鹽酸氯離子有利于花色苷烊離子結(jié)構(gòu)形成，增加花色苷的穩(wěn)定性，所以選擇濃度為0.1%的鹽酸作為酸化劑。

3.3料液比和提取時(shí)間對(duì)花色苷提取量的影響

圖5　料液比對(duì)花色苷提取量的影響Fig.5Effects of solid-liquid ratio on extracted anthocyanin

圖6　提取時(shí)間對(duì)花色苷提取量的影響Fig.6Effects of extracting time on extracted anthocyanin

由圖5可知，花色苷的提取量隨料液比的增加而提高。其中花色苷在料液比1∶30時(shí)達(dá)到較高值，之后增大料液比花色苷的含量有所增加但差異不顯著（P＞0.05）。這是由于料液比的增加能提高分子擴(kuò)散速率、縮短濃度平衡時(shí)間，因而使溶解在提取劑中的花色苷增多，增加了提取量，但料液比過大時(shí)，會(huì)使提取溶劑中的花色苷濃度降低，低濃度的花色苷溶液不利于花色苷的穩(wěn)定，花色苷反而會(huì)有一定的降解與損失［20］。而且料液比過高會(huì)使成本升高，所以選擇料液比為1∶30。

由圖6可知，選擇料液比l∶30（w·v-1），提取時(shí)間為1 h時(shí)，花色苷含量達(dá)到最大值。理論上提取時(shí)間越長(zhǎng)，原料與提取劑的接觸越充分，提取量應(yīng)該越大，但是因?yàn)榛ㄉ盏榷喾宇愇镔|(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定，隨著提取時(shí)間的增加會(huì)使已經(jīng)提取出的花色苷等發(fā)生氧化分解而損失，使花色苷含量降低，所以選擇1 h為最佳提取時(shí)間。

3.4提取溫度對(duì)花色苷提取量的影響

圖7　提取溫度花色苷提取量的影響Fig.7Effects of temperature on extracted anthocyanin

由圖7可知，隨著提取溫度的增加，花色苷呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，花色苷提取量在30～60℃之間變化不大，60℃之后下降明顯。升高溫度能提高花色苷的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)，此外較高的溫度有利于細(xì)胞的破碎、提高細(xì)胞膜的通透性，因此升溫有助于提取率的提高。但是由于花色苷對(duì)熱敏感，當(dāng)溫度超過某一臨界溫度時(shí)會(huì)加速本身的氧化、降解，而且乙醇的沸點(diǎn)較低，升溫容易造成提取劑的揮發(fā)，反而使提取率下降。另外，花色苷對(duì)于溫度是十分敏感的，雖然40℃條件下花色苷的穩(wěn)定性不會(huì)急劇下降，但也會(huì)一定程度上造成花色苷的降解和損失［21］，所以選擇30℃作為提取花色苷的提取溫度?；ㄉ仗崛×繛?.6 mg·g-1。

3.5提取工藝的正交試驗(yàn)

由上述的單因素實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)花色苷提取率影響較大的4個(gè)因素，即乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和料液比，采用4因素3水平進(jìn)行9次實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化藍(lán)莓酒渣中花色苷的提取工藝。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1Design of orthogonal experiment

表2　正交試驗(yàn)直觀分析Table 2Intuitive analysis of orthogonal experiment

表3　正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3Variance analysis of orthogonal experiment

由極差分析可知，最佳提取工藝為A1B1C2D3，即乙醇濃度為40%，提取溫度為30℃，提取時(shí)間為1 h，料液比為1∶40，在此設(shè)計(jì)下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，花色苷含量為3.03 mg·g-1。由方差分析得出，料液比和提取時(shí)間對(duì)正交試驗(yàn)影響顯著，乙醇濃度和提取溫度影響不顯著。

3.6藍(lán)莓酒渣粗提物得率和花色苷純度

根據(jù)公式1計(jì)算出提取液粗提物得率為22.1%，根據(jù)公式2計(jì)算出花色苷純度為1.37%。

4　結(jié)論與討論

試驗(yàn)以野生藍(lán)莓酒渣為原料，40%乙醇為提取溶劑，0.1%的鹽酸酸化，按1 g干燥的酒渣加40 mL溶劑的比例，于30℃提取1 h，提取液中花色苷含量為3.03 mg·g-1，粗提物得率為22.1%，花色苷純度為1.37%。

藍(lán)莓花色苷在醇溶液中溶解性比較好，在酸性條件下穩(wěn)定。原料量一定的情況下，溶劑使用量越大花色苷的提取率也越高，但在干燥濃縮時(shí)所消耗的能量也越多，所以確定合適的料液比，對(duì)降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率非常重要。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時(shí)間和浸提溫度的增加，花色苷的提取率也相應(yīng)的提高，但增加乙醇體積和提取時(shí)間在一定程度上會(huì)增加生產(chǎn)成本，且溫度過高會(huì)造成花色苷的部分降解，不利于其穩(wěn)定性［22-23］。

在野生藍(lán)莓酒渣中提取花色苷可拓展藍(lán)莓鮮果資源的綜合利用，減少?gòu)U物排放，降低生產(chǎn)成本，為后續(xù)藍(lán)莓花色苷的純化提供數(shù)據(jù)支持，且為藍(lán)莓酒渣中生物活性成分的基礎(chǔ)研究以及產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

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Extraction Research on Anthocyanins of Blueberry Wine Pomace

Wang Chao，Liu Wenjing，Guo Dejun，Xu Wanmeng，Wang Chengyu，Li Dandan，Ruan Changqing
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

To explore the biological active ingredient in blueberry wine pomace of Da Hinggan Mountains，the effects of the ethanol solution concentration，hydrochloric acid concentration，solid-liquid ratio，time，temperature of the anthocyanins content were investigated in orthogonal experiments.The results showed that the optimal conditions was follows：alcohol 40%，hydrochloric acid concentration 0.1%，the extraction temperature 30℃，extracting time 1 h，and solid-liquid ratio 1∶40.Under the condition of anthocyanins content in slag for 3.03 mg·g-1，the crude extract was black powder after enrichment freeze-drying，and the rate was 22.1%，and anthocyanins purity was 1.37%.This experiment illustrated that residue contains of the wild blueberry wine pomace had lots of anthocyanins.Extracting the biological active components from blueberry wine pomace could reduce waste，improve the comprehensive utilization of blueberry fruit resources，and provide guidance for industrialized production.

wild blueberry；pomace；anthocyanins；extraction optimization

TS261.9

A

1002-2090（2016）02-0064-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.02.013

2015-02-15

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（YJSCX2014-Y49）；黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410223012）；黑龍江省農(nóng)墾總局科技局技術(shù)開發(fā)項(xiàng)目（HNK13KF-15-01）。

王超（1988-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2012級(jí)碩士研究生。

阮長(zhǎng)青，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：cqruan@163.com。