梁小月，張東杰，王穎，2，王月

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶　163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心）

雙水相法萃取植物乳桿菌M1-UVs29細(xì)菌素條件的優(yōu)化

梁小月1，張東杰1，王穎1，2，王月1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心）

為優(yōu)化植物乳桿菌M1-UVs29細(xì)菌素的萃取條件，選擇合適的成相物質(zhì)后，通過單因素試驗(yàn)考察不同PEG濃度、硫酸銨濃度、pH、離子強(qiáng)度等對細(xì)菌素效價(jià)及萃取率的影響。在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：最佳萃取條件是20% PEG4000，18%硫酸銨，1.3%氯化鈉，體系pH4.0，效價(jià)1 258.01±14.23 IU·mL-1，萃取率達(dá)到83.7%。說明雙水相法可以較好地純化植物乳桿菌M1-UVs29細(xì)菌素。

植物乳桿菌；細(xì)菌素；雙水相；響應(yīng)面

乳酸菌在自然界中廣泛分布，常見于蔬菜、谷物以及人體腸道中，不僅作為食品發(fā)酵的主要微生物，還在食物保藏中扮演著重要角色［1-2］。由于抗生素的副作用和病原體耐藥性的不斷增強(qiáng)，尋找抗菌能力強(qiáng)且毒副作用小的替代品極為重要，乳酸菌因其較強(qiáng)的抗菌活性而備受關(guān)注［3］。

細(xì)菌素是細(xì)菌（乳酸菌）代謝過程中，通過核糖體合成作用而產(chǎn)生的對近緣菌株具有抑制作用的多肽或蛋白質(zhì)［4］。乳酸菌細(xì)菌素以其無毒副作用，機(jī)體內(nèi)易降解、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，逐漸作為一種天然食品添加劑被應(yīng)用到食品生產(chǎn)中。目前，常規(guī)的細(xì)菌素粗提方法有鹽析法［5］、細(xì)胞吸附法［6］、有機(jī)溶劑提取法［7］和pH吸附法［8］等，鹽析法一般不是特異針對細(xì)菌素的提取方法，且鹽析過程中所需鹽濃度較高，可能會對后續(xù)純化及性質(zhì)分析會產(chǎn)生一定影響；細(xì)胞吸附法和pH吸附法一般應(yīng)用于有相應(yīng)吸附效果的特定種類細(xì)菌素，有機(jī)溶劑浸提時(shí)有機(jī)溶劑用量較大且毒性較大；雙水相萃取技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種新型分離技術(shù)，目前該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于核酸［9］、酶［10］、多酚［11］、黃酮［12］、氨基酸［13］、蛋白質(zhì)［14］以及各種植物有效成分的提純，具有分離條件溫和，操作簡單，易于工程放大和連續(xù)操作，成本低且不存在有機(jī)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)［15］。

李孱等［16］在2000年曾直接應(yīng)用雙水相體系進(jìn)行乳鏈球菌發(fā)酵，提高了乳鏈球菌素的產(chǎn)量，之后又進(jìn)一步研究用雙水相體系在乳鏈球菌發(fā)酵液中提取細(xì)菌素。目前，采用雙水相法純化細(xì)菌素的研究相對較少，研究的實(shí)驗(yàn)菌種是一株具有降膽固醇并兼具高效抑菌作用的植物乳桿菌M1-UVs29，而不同種類的乳酸菌，所產(chǎn)細(xì)菌素的最適萃取方法也有一定差異，在前人研究的基礎(chǔ)上，對該植物乳桿菌M1-UVs29所產(chǎn)細(xì)菌素的雙水相萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為該菌株的后期應(yīng)用奠定一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

植物乳桿菌M1-UVs29，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室選育和保藏。

培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

試劑：硫酸銨（分析純）；PEG（聚乙二醇，化學(xué)純），其他均為試劑純。

1.2儀器與設(shè)備

臺式低速離心機(jī)TD5A-WS（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9272（上海一恒科技有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-75KBS（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種活化

將保藏的菌種接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，即得活化菌種。

1.3.2發(fā)酵上清液的制備

將活化后的待測菌18 h菌齡種液以5%的接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基，30℃靜置培養(yǎng)36 h，4 000 r·min-1離心20 min，收集上清液。上清液用0.22 μm濾膜過濾，除去菌體及其他雜質(zhì)，放入4℃冰箱中備用。

1.3.3雙水相萃取方法

固定體系總質(zhì)量為20.0 g，加入PEG和硫酸銨，室溫條件下萃取。靜置30 min，4 000 r·min-1離心15 min，體系分為上下兩相，測定效價(jià)和萃取率［17］。

1.3.4分析方法

采用牛津杯雙層平板法測定抑菌圈直徑［18］。底層為10 mL素瓊脂，插入牛津杯，凝固后加入混入指示菌（金黃色葡萄球菌）的營養(yǎng)瓊脂做上層，凝固后取出牛津杯，在孔中加入上清液（100 μL），37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑（mm），計(jì)算效價(jià)［19］。萃取率計(jì)算公式［20］：

1.3.5單因素試驗(yàn)

以細(xì)菌素效價(jià)為指標(biāo)，分別考察不同PEG分子量及濃度、不同無機(jī)鹽及濃度對效價(jià)的影響，選出最適PEG分子量和無機(jī)鹽之后，以細(xì)菌素效價(jià)和萃取率為指標(biāo)，分別考察所選PEG濃度（14%、16%、18%、20%、22%、24%、26%）、無機(jī)鹽濃度（10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%）、氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、體系pH（3.0、3.3、3.6、3.9、4.2）對提取效果的影響。

1.3.6響應(yīng)面曲面法優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過BoX-Behnken進(jìn)行響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)［21］。

2　結(jié)果與討論

2.1成相物質(zhì)的選擇

2.1.1PEG相對分子量及濃度對抑菌效果的影響

圖1為在發(fā)酵上清液中加入不同相對分子質(zhì)量及濃度的PEG之后的效價(jià)值。

由圖1可以看出，除PEG1000外，其余幾種不同分子量的PEG對細(xì)菌素效價(jià)的影響不顯著，說明PEG體系相對溫和，可以用來分離分子量小具有活性的細(xì)菌素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEG400和PEG4000作用下的細(xì)菌素效價(jià)較高，由于PEG相對分子質(zhì)量越大，疏水作用越強(qiáng)，同一聚合物的疏水性隨著分子量的增加而增大，因此，欲在上相獲得較高的細(xì)菌素得率，實(shí)驗(yàn)中選擇PEG4000作為成相物質(zhì)。

圖1　PEG相對分子量及濃度對效價(jià)的影響Fig.1Effects of relative molecular mass and concentration of PEG on titer

2.1.2無機(jī)鹽種類及濃度對抑菌效果的影響

在上清液中分別加入不同種類的無機(jī)鹽，測定效價(jià)值，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，將三種不同無機(jī)鹽分別加入到上清液之后，硫酸鎂對細(xì)菌素效價(jià)的影響比較大，硫酸鈉和硫酸銨對效價(jià)的影響不顯著，可用作萃取該植物乳桿菌細(xì)菌素的成相物質(zhì)。無機(jī)鹽的種類和濃度，主要通過影響相間點(diǎn)位和蛋白質(zhì)的疏水相來影響分配系數(shù)，不同電解質(zhì)的正負(fù)離子分配系數(shù)不同，會產(chǎn)生不同的相間點(diǎn)位，進(jìn)而影響細(xì)菌素的分配系數(shù)。

圖2　無機(jī)鹽種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)對效價(jià)的影響Fig.2Effects of type and concentration of salt on titer

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1PEG濃度對細(xì)菌素萃取效果的影響

圖3為在雙水相萃取過程中，不同PEG4000濃度對細(xì)菌素效價(jià)和萃取率的影響。

在PEG/硫酸銨體系中，PEG的濃度不同，分配系數(shù)也不相同，由圖3可以看出，PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，細(xì)菌素效價(jià)和萃取率均較好。PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于20%后，細(xì)菌素效價(jià)隨著PEG4000濃度的增大而下降，可能是由于PEG4000的粘度增大，過高的粘度阻礙了細(xì)菌素進(jìn)入上相，導(dǎo)致萃取率顯著降低。

圖3　PEG4000濃度對萃取效果的影響Fig.3Effects of concentration of PEG4000 on extraction efficiency

2.2.2硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對細(xì)菌素萃取效果的影響

圖4為在雙水相萃取過程中，不同硫酸銨濃度對細(xì)菌素萃取效果的影響。

結(jié)果顯示，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)菌素效價(jià)呈上升趨勢，但硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大，效價(jià)和萃取率均會下降，可能是由于硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響兩相對水分子的爭奪能力，進(jìn)而影響細(xì)菌素在兩相中的分配。當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時(shí)，效價(jià)和萃取率均達(dá)到最大值。

圖4　硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對細(xì)菌素萃取效果的影響Fig.4Effects of concentration of ammonium sulfate on extraction efficiency

2.2.3氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對細(xì)菌素效價(jià)的影響

圖5為在雙水相萃取過程中，氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對細(xì)菌素萃取效果的影響。

在雙水相系統(tǒng)中加入電解質(zhì)，其陰陽離子在兩相會有不同的分配，同時(shí)由于電中性的約束，存在穿過相界面的電勢差，影響細(xì)菌素在兩相中的分配，由圖5可看出，氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)，萃取效果較好。

圖5　氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對細(xì)菌素效價(jià)的影響Fig.5Effects of concentration of sodium chloride on extraction efficiency

2.2.4體系pH對細(xì)菌素萃取效果的影響

圖6　pH對細(xì)菌素萃取效果的影響Fig.6Effects of pH on extraction efficiency

圖6為在雙水相萃取過程中，不同體系pH對細(xì)菌素萃取效果的影響。如圖所示，體系pH對細(xì)菌素的效價(jià)有很大影響，這可能是由于體系的pH值變化能明顯地改變兩相的電位差。如體系pH值與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）相差越大，則蛋白質(zhì)在兩相中分配越不均勻。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH效價(jià)值隨pH呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，pH取3.6時(shí)，得到效價(jià)最大值。

2.3響應(yīng)面結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，通過BoX-Behnken進(jìn)行響應(yīng)曲面法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。以效價(jià)為響應(yīng)值，對PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X2）、氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）和體系pH（X4）設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，因素及水平見表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1　響應(yīng)面因素水平表Table 1Factors and levels of response surface methodology

表2　響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2Experimental design and results of response surface methodology

續(xù)表2　響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continued table 2Experimental design and results of response surface methodology

2.3.1回歸方程的建立與方差分析

利用Design expert 8.0.6軟件對表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到的二次回歸模型為：Y=184.43-0.61 X1-0.19 X2-1.91 X3+3.16 X4-8.60 X1X2-0.89 X1X3-1.25 X1X4+6.57 X2X3-0.24 X2X4+0.025 X3X4-11.97-9.34-8.33-5.36。對該模型及其系數(shù)急性顯著性分析，結(jié)果見3。

對該模型及系數(shù)進(jìn)行顯著性分析，其結(jié)果見表3。從該表可知，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值間的關(guān)系時(shí)，因變量與各自變量間的線性關(guān)系顯著，回歸方程模型極顯著（P＜0.01），且方程失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明未控制因素對試驗(yàn)結(jié)果影響很小，表明該方程對實(shí)驗(yàn)的擬合情況良好。預(yù)測值和真實(shí)值之間有較好的相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)誤差小，因此可用該方程對細(xì)菌素效價(jià)進(jìn)行預(yù)測。

表3　回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3Significance test of regression model

由表2知，PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對效價(jià)影響不明顯，體系pH對效價(jià)影響明顯，四因素影響大小先后順序?yàn)椋篨4（體系pH）＞X3（氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)）＞X1（硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)）＞X2（PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)）?？紤]兩兩因素之間的交互作用，PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的

圖7　效價(jià)=f（X2，X3）響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.7Response surface and contour plots for cross action of concentration of ammonium sulfate and sodium chloride on titer

結(jié)合回歸模型和響應(yīng)曲面圖分析得出雙水相法萃取植物乳桿菌M1-UVs29細(xì)菌素條件的最佳條件是：PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)19.95%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.92%，氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.33%，體系pH為3.99，在此條件下預(yù)測細(xì)菌素效價(jià)可達(dá)1268.00 IU· mL-1。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，并考慮實(shí)際操作條件，將萃取條件定為：PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.3%，體系pH4.0，5次平行實(shí)驗(yàn)后最終得到植物乳桿菌M1-UVs29細(xì)菌素的效價(jià)為1258.01±14.23 IU·mL-1。與預(yù)測值相比較可得出，響應(yīng)曲面分析所得的回歸模型是可靠的。

3　結(jié)論

以雙水相萃取法分離植物乳桿菌M1-UVs29細(xì)菌素，該方法操作簡單，試驗(yàn)周期短，并能有效地將細(xì)菌素富集到疏水相中，體系pH對萃取效果的影響最顯著。在單因素基礎(chǔ)上，對各因素通過響應(yīng)面進(jìn)行分析，優(yōu)化后的最佳萃取條件為PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.3%，體系pH為4.0，在此條件下，分離得到的植物乳桿菌M1-UVs29細(xì)菌素效價(jià)為1258.01±14.23IU·mL-1，萃取率達(dá)到83.7%，證明此方法能夠較好地分離純化植物乳桿菌M1-UVs29細(xì)菌素。影響極顯著（P＜0.01），硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間相互影響顯著（P＜0.05），其他因素之間相互作用不顯著。圖7-11為響應(yīng)值在各因素交互作用下得到的三維曲面圖。

2.3.2模型驗(yàn)證試驗(yàn)

圖8　效價(jià)=f（X1，X3）響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.8Response surface and contour plots for cross action of the concentration of PEG4000 and sodium chloride on titer

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Optimization of Aqueous Two-phase Extraction of Bacteriocin by Lactobacillus plantarum M1-UVs29

Liang Xiaoyue1，Zhang Dongjie1，Wang Ying1，2，Wang Yue1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy，Daqing 163319；2.Research Center of National Coarse Cereals Engineering）

To optimize of extraction conditions of Lactobacillus plantarum M1-UVs29 bacteriocin，the suitable phase material was chosen to test effects of different concentration of PEG，ammonium sulfate，pH，ionic strength on bacteriocin titer and extraction rate by the single factor experiment.The results showed that the optimum extraction conditions were 20%PEG4000，18%ammonium sulfate，1.3%sodium chloride，pH4.0，titer 1 258.01±14.23 IU·mL-1，and the rate of extraction achieved by 83.7%.It proved that aqueous two-phase systems could well purify bacteriocins by Lactobacillus Plantarum M1-UVs29.

Lactobacillus plantarum；bacteriocins；aqueous two-phase systems；response surface

Q93

A

1002-2090（2016）02-0053-07

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.02.011

2014-12-10

防腐保鮮新型物流包裝材料開發(fā)（2015BAD16B05）。

梁小月（1990-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2012級碩士研究生。

張東杰，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zdj_66@126.com。