于鑫，張琦，陳媛媛，王鈺鑫，賀一博，趙相洋，陳爽，劉明星，李令政，徐闖

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶　163319）

大鼠非酒精性脂肪肝與梯度熱量飼料關(guān)系的研究

于鑫，張琦，陳媛媛，王鈺鑫，賀一博，趙相洋，陳爽，劉明星，李令政，徐闖

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319）

通過飼喂不同能量梯度高脂高膽固醇飲食，促使SD大鼠肝臟形成脂肪肝病變，觀察不同能量梯度的高脂高膽固醇飼料對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝病變程度的影響。將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分組，甲、乙、丙組分別食用由低到高不同能量梯度的高脂高膽固醇飼料飼喂，丁組大鼠飼喂普通飼科，自由飲水，飼喂4周。結(jié)果表明，甲組與正常對(duì)照組大鼠肝臟相對(duì)比無脂肪空泡產(chǎn)生，乙組與丙組大鼠肝臟均出現(xiàn)脂肪顆粒，丙組較乙組脂肪顆粒有所增加。實(shí)驗(yàn)表明在一定能量梯度下的高脂高膽固醇配比飼料飼喂大鼠所形成的脂肪肝程度不同。

脂肪肝；能量梯度飼料；大鼠

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一種無過量飲酒史（酒精攝入量＜20 g·d-1），而以肝細(xì)胞脂質(zhì)貯積和脂肪變性為特征的臨床病理綜合癥，其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確。有研究表明脂質(zhì)過氧化損傷、炎癥、氧自由基、胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂和鐵超載等作用都與脂肪肝發(fā)病機(jī)制有關(guān)［1-6］。關(guān)于NAFLD模型，國(guó)內(nèi)外已有較多報(bào)道［7-8］，文獻(xiàn)報(bào)道最多的造模方式為高熱量飲食誘導(dǎo)［9］，高脂飼養(yǎng)大鼠模型誘發(fā)脂肪肝是國(guó)內(nèi)外最常用的非酒精性脂肪肝模型，但是在各種建立模型的方法中主要通過給飼喂大鼠統(tǒng)一成分、統(tǒng)一熱量的飼料，少有進(jìn)一步觀察不同梯度能量飼料對(duì)脂肪肝病理組織學(xué)改變的影響報(bào)道，實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠飼喂能量飼料進(jìn)行梯度設(shè)置，觀察比較不同能量梯度飼料導(dǎo)致大鼠肝臟的病理學(xué)變化，從而為過度食用高脂高膽固醇的食物所引起的非酒精性脂肪肝的研究提供可靠的動(dòng)物模型。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康雄性SD大鼠48只，體重200±20 g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)4天后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要試劑

豬油（自制），蛋黃粉和膽固醇購(gòu)自納川生物技術(shù)工作室，豬膽鹽購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，普通大鼠飼料購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

大鼠適應(yīng)性飼喂4 d后，將24大鼠隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組和三組梯度能量模型組，每組6只，正常組飼喂普通飼料，三組模型組分別給予不同能量梯度的飼料飼喂，平均每只SD大鼠每天20 g飼料，共飼喂4周。飼料能量按照一定比例增加，對(duì)所有實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組，分別為正常對(duì)照丁組，模型甲組、模型乙組、模型丙組。稱量其處死前體重，并作保存。

1.2.2高脂高膽固醇不同能量梯度飼料配比方法見表1 。

表1　SD大鼠分組及不同能量梯度喂養(yǎng)情況Table 1SD rats divide into groups and different energy gradient feed situation

1.2.3試驗(yàn)過程

每組動(dòng)物按照預(yù)期飼養(yǎng)時(shí)間，分別于飼養(yǎng)第0周，1周，2周，3周，4周記錄大鼠重，并于第4周末隨機(jī)抽取12只大鼠，將大鼠乙醚深度麻醉后，進(jìn)行解剖，大鼠死后取出肝臟并稱量其濕重，肉眼觀察肝臟變化，計(jì)算肝指數(shù)，參照《非酒精性脂肪肝診斷標(biāo)準(zhǔn)》（2002-10中華肝病學(xué)會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制定），并將分離出的肝臟進(jìn)行對(duì)比，拍照記錄后完整分離肝右葉，在離邊緣1 cm處，橫切一塊肝組織用10%中性福爾馬林固定，肝臟進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察病理組織學(xué)變化。

2　結(jié)果

2.1體重以及肝指數(shù)變化情況

在實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠體重一直保持上升，各組體重有顯著性變化，肝指數(shù)也根據(jù)能量梯度的升高逐漸上升見表2。

表2　大鼠體重變化和肝指數(shù)Table 2Weight change and liver index of the rats

2.2肝臟組織觀察

對(duì)照組丁組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝竇清晰可見，肝索排列整齊，肝細(xì)胞無脂肪變性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央。模型甲組第4周末肝索排列開始紊亂；模型乙組第4周末可見個(gè)別肝細(xì)胞脂肪空泡；模型丙組第4周肝細(xì)胞出現(xiàn)較多空泡。如圖1~4所示。

圖1　造模第4周對(duì)照組丁組大鼠肝臟病理切片（HE，×400）Fig.1Rat liver biopsy in group D at the 4 week（HE，×400 ）

圖2　造模第4周模型甲組大鼠肝臟病理切片（HE，×400）Fig.2Rat liver biopsy liver in group A at the 4 week（HE，×400）

圖3　造模第4周模型乙組大鼠肝臟病理切片（HE，×400）Fig.3Rat liver biopsy in group B at the 4 week（HE，×400）

圖4　造模第4周模型丙組大鼠肝臟病理切片（HE，×400）Fig.4Rat liver biopsy in group C at the 4 week（HE，×400）

3　討論

脂肪肝是由中性脂肪在肝內(nèi)過多蓄積所致，并且肝臟內(nèi)脂類含量超過了肝濕重的5%。引起動(dòng)物非酒精性脂肪肝的因素有很多，大量食用含有高脂肪高膽固醇的食物是引起非酒精性脂肪肝使其中的一個(gè)重要因素，還包括高脂血癥、年齡、糖尿病和藥物中毒等其他引起脂肪肝的因素，大多數(shù)的研究表明脂肪肝的發(fā)病機(jī)制主要為過多的脂肪酸在肝細(xì)胞內(nèi)沉積，從而造成肝細(xì)胞脂肪變性，對(duì)于患有脂肪肝疾病的動(dòng)物應(yīng)改善飲食結(jié)構(gòu)，堅(jiān)持以食用低熱能、高維生素、高膳食纖維的食物，如麥麩、燕麥、玉米及豆類食品，防止高熱量、高脂肪、高蛋白低纖維的膳食結(jié)構(gòu)的缺陷。

研究采用高脂高膽固醇飼料誘發(fā)大鼠脂肪肝，即在飼料中按梯度加入一定比例的豬油、膽固醇等物質(zhì)，通過第四周的大鼠肝臟組織病理切片觀察顯示模型組中乙組和丙組大鼠脂肪肝產(chǎn)生了脂肪空泡，而且丙組脂肪空泡多于乙組脂肪空泡，而對(duì)照組和模型甲組無明顯脂肪變性，即甲組的飲食在四周時(shí)不能夠引起動(dòng)物肝臟產(chǎn)生脂肪肝病變，也說明只有當(dāng)食物中的脂肪達(dá)到一定的比例，利用長(zhǎng)鏈脂肪酸及高脂肪的飲食增加肝臟內(nèi)脂質(zhì)的產(chǎn)生［10-11］。模型組中乙組和丙組肝指數(shù)明顯高于對(duì)照組，脂質(zhì)化程度加深，以上說明高脂高膽固醇飼料能夠促使脂質(zhì)堆積在肝臟內(nèi)，從而引起大鼠肝臟發(fā)生脂肪變性。并隨著能量的增高脂肪變性程度增高。

實(shí)驗(yàn)通過在大鼠普通飼料中添加豬油，膽固醇，蛋黃粉等物質(zhì)，于4周后成功制備了非酒精性大鼠脂肪肝模型，病變有一定的發(fā)展過程；形成率高，死亡率低，重復(fù)性好；造模方法簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)，所造模型易于大批量復(fù)制。并且該模型方法可以為實(shí)驗(yàn)研究同時(shí)提供不同病變程度的非酒精性脂肪肝模型，對(duì)于研究不同飲食習(xí)慣所產(chǎn)生不同能量攝入所引起的脂肪肝疾病具有重要意義。

4　結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通過自由采食方式飼喂方式進(jìn)行大鼠脂肪肝造模，脂肪肝病變隨著不同梯度能量飼料有不同程度改變，導(dǎo)致輕度和中度脂肪肝模型的出現(xiàn)，沒有出現(xiàn)重度脂肪肝模型，這與飼喂方式有關(guān)，如果采取灌胃方式將會(huì)使病變程度更加明顯。但是基于采取自由采食的方式更符合動(dòng)物和人類脂肪肝疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律，更接近臨床真實(shí)病例，所以實(shí)驗(yàn)并未采取灌胃方式造模，實(shí)驗(yàn)將對(duì)研究NAFLD的疾病演變發(fā)展過程提供重要的實(shí)踐依據(jù)，同時(shí)也為不同階段脂肪肝的治療藥物篩選和藥效學(xué)供肝的研究提供有價(jià)值的模型。

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Study on Relationship between non Alcoholic Fatty Liver and Gradient Heat Diet in Rats

Yu Xin，Zhang Qi，Chen Yuanyuan，Wang Yuxin，He Yibo，Zhao Xiangyang，Chen Shuang，Liu Mingxing，Li Lingzheng，Xu Chuang
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

By the different energy gradient of high fat and high cholesterol diet，the liver of SD rats induced to form fatty liver disease，and the pathological features of liver in rats were observed.The SD rats were randomly divided as normal control group D，gradient model group A，group B，group C.the rats model were fed with the common growth，and feeding section，A，B and C were fed with the different energy gradient of High fat and high cholesterol diet，and the free drinking water.Rats were fed for 4 weeks，the rats were killed，took the liver tissue quickly and weighed it，and the liver was observed.The results show that the liver of B and C group occured fat particles，and C group compared with B group the fat particles increased.The fatty liver of rats fed with high fat and high cholesterol ratio in a certain energy gradient is different.

fatty liver；energy gradient feed；rats

S856.5

A

1002-2090（2016）02-0050-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.02.010

2015-02-03

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372625）；國(guó)家科技支撐項(xiàng)目（2013BAD21B01）。

于鑫（1993-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)2014級(jí)本科生。

徐闖，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：xuchuang7175@163.com。