陳德坤　陳嘉川　楊桂花　王　強　賈廷鵬　劉姍姍

(齊魯工業(yè)大學制漿造紙科學與技術教育部重點實驗室,山東濟南,250353)

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·麥草預處理·

氧氣-離子液體預處理對麥草酶解效率的影響

陳德坤陳嘉川*楊桂花王強賈廷鵬劉姍姍

(齊魯工業(yè)大學制漿造紙科學與技術教育部重點實驗室,山東濟南,250353)

以麥草為原料,探討了氧氣(O2)-離子液體(1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽，[Emim]Ac)預處理工藝條件,以期提高麥草的酶解效率。結(jié)果顯示,較適宜的O2-[Emim]Ac預處理條件為：固液比1∶1.5,氧壓0.4 MPa,溫度130℃，處理時間6 h。在此條件下,經(jīng)過O2-[Emim]Ac預處理的麥草酶解(酶解條件為：纖維素酶用量30 U/g原料,酶解時間72 h)還原糖得率為65.1%,高于未經(jīng)預處理麥草酶解還原糖得率5倍以上。掃描電鏡、X射線衍射和紅外光譜分析表明,O2-[Emim]Ac預處理后麥草纖維表面粗糙,孔隙增加,結(jié)構(gòu)疏松,結(jié)晶度降低12.6%。

麥草；離子液體；氧氣；酶解

近10年來尋找可再生的替代能源成為世界各國的研究熱點[1]。生物質(zhì)能源已經(jīng)成為世界排位僅次于煤炭、石油和天然氣的第四大能源。研究發(fā)展生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè),符合我國資源環(huán)境和諧發(fā)展的戰(zhàn)略目標。木質(zhì)纖維素可轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖(如葡萄糖和木糖),從而被認為是有前途的生物質(zhì)燃料和生物基產(chǎn)品材料。纖維素是木質(zhì)纖維原料的主要組分,可通過纖維素酶水解為葡萄糖。但酶解反應受孔隙率、纖維可及度、纖維比表面積、纖維素結(jié)晶度和木素含量的影響[2-3],因此,纖維素酶水解前需要進行預處理以降低纖維素的結(jié)晶度和提高纖維的孔隙率。不同的預處理方法可用于提高纖維素材料的孔隙率,其中稀酸法[4]或堿法[5]是最常用的,同時蒸汽爆破[6]、氨蒸汽爆破[7]、濕氧法[8]、臭氧法等[9]具有較大的發(fā)展?jié)摿?但這些方法需要的設備成本較高,能耗也較高。因此,探尋提高生物質(zhì)利用效率、降低預處理成本的方法和技術是目前科學研究的熱點。

2002年,Swatloski等人[10]發(fā)現(xiàn)纖維素無需活化即可直接溶解在離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([Bmim]Cl)中,為纖維素的溶劑體系開辟了一個新領域。離子液體是有機鹽,由于其高的熱穩(wěn)定性和不揮發(fā)性,與易揮發(fā)和不穩(wěn)定的有機溶劑相比,離子液體成為具有吸引力的溶劑。隨著對離子液體的深化研究,已發(fā)現(xiàn)多種離子液體可溶解纖維素?；诂F(xiàn)有的研究報道,離子液體1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽([Emim]Ac)是纖維素較好的溶劑[11-12],其特點是無毒、無腐燭性、常溫下呈液態(tài)、黏度低、對纖維素溶解能力較強,因此其在纖維素溶解加工及制備纖維素纖維方面具有較好的應用前景。本實驗選用氧氣(O2)-離子液體([Emim]Ac)對麥草進行預處理,優(yōu)化預處理工藝條件,以提高麥草酶解效率。通過掃描電鏡、X射線衍射和紅外光譜分析,探索預處理前后麥草的化學結(jié)構(gòu)和結(jié)晶度變化,旨在為生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用提供理論指導。

1　實　驗

1.1原料

麥草取自山東省濟南市郊區(qū),收集之后,研磨成粉末(40～60目),在恒溫干燥箱內(nèi)干燥備用。離子液體[Emim]Ac由成捷化學有限公司提供(上海)。商業(yè)用纖維素酶,購自雅客生物科技公司。

1.2O2-[Emim]Ac預處理

取2 g絕干麥草粉放入反應釜中,加入離子液體[Emim]Ac,固液比為1∶1.5,攪拌均勻。再向反應釜中加入不同壓力的O2，在不同條件下預處理麥草。反應過程中,反應釜不斷旋轉(zhuǎn),保證反應的均勻性。反應結(jié)束后,加水終止反應,并用去離子水過濾,回收麥草?；厥盏柠湶莘胖糜诤銣馗稍锵鋬?nèi)烘干備用。

1.3酶解工藝

分別稱取0.2 g反應前后麥草粉于兩個25 mL錐形瓶中,加入pH值4.8的緩沖液,加入纖維素酶,酶用量為30 U/g原料,在45℃和120 r/min下的恒溫振蕩鍋中進行酶解,在規(guī)定時間內(nèi)分別移取各個時間段的酶解液,離心,取上清液，用DNS法檢測其還原糖含量。

1.4原料分析

(1)水分含量測定:參照GB/T2677.2—1993造紙原料水分的測定。

(2)灰分含量測定:參照GB/T2677.3—1993造紙原料灰分的測定。

(3)綜纖維素含量測定:按照GB/T2677.進行苯醇抽提;參照GB/T2677.10—1995造紙原料灰分的測定。

(4)Klason木素含量測定:參照GB/T2677.8—1994造紙原料酸不溶木素的測定；酸溶木素的測定采用Klason木素測定的水解濾液,用730紫外分光光度計測定濾液的吸光值,吸光系數(shù)取110 L/(g·cm)，經(jīng)計算得到。

(5)聚戊糖含量測定：參照GB/T2677.9—1994造紙原料聚戊糖的測定。

(6)纖維素含量為綜纖維素減去聚戊糖的含量。

1.5葡萄糖標準曲線的繪制

圖1為葡萄糖標準曲線。以下實驗均采用該標準方程計算葡萄糖含量：y=0.0742x+0043,相關系數(shù)R=0.9988。式中,y為葡萄糖含量，mg/mL；x為吸光度。

圖1　葡萄糖標準曲線

1.6分析方法

纖維形貌觀察用FEI公司的Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡；纖維素結(jié)晶度測定采用德國布魯克AXS公司的D8-ADVANCE射線衍射儀；還原糖測定采用美國安捷倫公司的DR/4000V分光光度計；紅外光譜檢測采用日本島津公司的IRPrestige-21傅里葉紅外光譜儀。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實驗

實驗探討了O2-[Emim]Ac預處理麥草過程中各參數(shù)對酶解效率的影響,并優(yōu)化了單因素預處理條件。

2.1.1氧壓

取絕干麥草粉2 g,按固液比1∶1.5加入離子液體[Emim]Ac,在處理溫度120℃和處理時間6 h的條件下,改變氧壓,探討了不同氧壓預處理下麥草酶解還原糖得率,氧壓對麥草酶解還原糖得率的影響見圖2。

圖2中數(shù)據(jù)顯示,隨著預處理氧壓的增加,麥草酶解還原糖得率出現(xiàn)先升高后平緩下降的趨勢。當預處理氧壓從0.2 MPa增加到0.4 MPa時,麥草酶解還原糖得率提高幅度較大,當預處理氧壓為0.6 MPa時,麥草酶解還原糖得率增加緩慢。因此,較適宜的預處理氧壓為0.4 MPa。

圖2　氧壓對麥草酶解還原糖得率的影響

圖3　處理時間對麥草酶解還原糖得率的影響

圖4　處理溫度對麥草酶解還原糖得率的影響

2.1.2處理時間

取絕干麥草粉2 g,按固液比1∶1.5加入離子液體[Emim]Ac,在預處理氧壓0.4 MPa和溫度120℃的條件下,改變預處理時間,探討了不同預處理時間下麥草酶解還原糖的得率,預處理時間對麥草酶解還原糖得率的影響見圖3。

從圖3可以看出,在預處理時間2～4 h范圍內(nèi)時,酶解還原糖得率顯著增加,4～6 h范圍增加緩慢，當預處理時間超過6 h后,酶解還原糖得率有所降低,而且預處理底物顏色較深,因此處理時間不宜過長,6 h較適宜。

2.1.3處理溫度

取絕干麥草粉2 g,按固液比1∶1.5加入離子液體,在氧壓0.4 MPa和處理時間4 h的條件,改變處理溫度,探討了不同處理溫度下麥草酶解還原糖的得率,處理溫度對麥草酶解還原糖得率的影響見圖4。

圖4中數(shù)據(jù)表明,在110～130℃范圍內(nèi),酶解還原糖得率增加明顯,當處理溫度為140℃時,酶解還原糖得率變化緩慢,因此,較適宜的處理溫度為130℃。

實驗結(jié)果表明,O2-[Emim]Ac預處理麥草較適宜條件為：氧壓0.4 MPa,處理溫度130℃,處理時間6 h。

2.2預處理對麥草各組分的影響

實驗探討了O2-[Emim]Ac預處理對麥草各組分及酶解還原糖得率的影響,結(jié)果見表1。

表1　預處理對麥草組分及酶解還原糖得率的影響　%

注氧壓0.4 MPa,處理時間6 h,處理溫度130℃。

由表1可知,麥草經(jīng)O2-[Emim]Ac預處理后,纖維素含量由41.4%上升到61.2%,增加幅度為47.8%,半纖維素含量由23.6%下降到17.4%,降低幅度為26.2%,木素含量降低了35.1%。預處理后的麥草在纖維素酶用量30 U/g原料、酶解時間72 h條件下，酶解還原糖得率增加到65.1%,高于未經(jīng)預處理的麥草酶解還原糖得率5倍多。在GONG[13]的研究中，單獨堿處理麥草,當堿用量為4%時,酶水解率僅為39.9%,O2-[Emim]Ac預處理方法相對單獨堿處理較大提高了麥草酶解效率。在預處理過程中由于采用了弱堿性離子液體和相對較低的溫度(130℃),有效避免了纖維素的堿性水解和剝皮反應,使大部分高聚糖在預處理過程中保留下來。在O2氛圍下,氧分子從堿性狀態(tài)木素的酚氧負離子脫去電子,產(chǎn)生酚氧自由基,氧分子變成負離子自由基,然后進行一系列反應,木素發(fā)生降解。在反應體系中氧的負離子自由基可以轉(zhuǎn)化成為一系列含氧活性反應因子,它們的存在是提高木素脫除的重要因素[14]。同時該反應是在一個弱堿環(huán)境下進行的,木素結(jié)構(gòu)破壞的程度較小,因此較好的實現(xiàn)了木素與纖維素、半纖維素的分離。對于半纖維素而言,由于其具有分枝結(jié)構(gòu)、大分子聚合度低、聚集態(tài)呈無定形等特征,相對于纖維素較易降解。O2-[Emim]Ac預處理脫除部分木素后,離子液體[Emim]Ac處理使其結(jié)晶度大大降低,無定形區(qū)增大,預處理后的麥草纖維暴露出更大的表面積,這些因素共同促進了酶解速率,使麥草酶解還原糖得率大幅提高。

2.3預處理前后麥草纖維表面形貌變化

預處理前后麥草纖維表面形貌變化見圖5。

由圖5可見,未經(jīng)預處理的麥草纖維結(jié)構(gòu)致密,表面覆蓋有不規(guī)則的蠟質(zhì)層,纖維表面較為光滑。而經(jīng)O2-[Emim]Ac預處理后,麥草纖維表面出現(xiàn)粗糙、凹凸不平、多孔、疏松等現(xiàn)象,原因可能是O2氛圍下,離子液體[Emim]Ac更加容易破壞纖維素內(nèi)部氫鍵[15],有利于離子液體溶解麥草纖維,從而增加后續(xù)纖維素酶與麥草纖維的接觸面積,提高酶解效率。

圖5　預處理前后麥草纖維表面形貌變化

圖6　預處理前后麥草的FT-IR譜圖

吸收峰波數(shù)/cm-1基團振動說明3400～3500O—H伸展(氫鍵)振動3100～3400O—H伸展(氫鍵)振動2900C—H伸展振動1636H—O—H變形振動(吸附水)1596苯環(huán)伸展振動(木素)1506苯環(huán)伸展振動(木素)1426CH2剪(纖維素)、CH3彎曲(木素)、CO伸展振動(木素)1370芳環(huán)OH彎曲1319O—H平面內(nèi)形變(纖維素)1282CO伸縮振動1160C—O—C不對稱伸展振動(纖維素和半纖維素)1110O—H締合光帶(纖維素和半纖維素)1060C—O伸展振動(纖維素和半纖維素)1034CO伸展振動(纖維素、半纖維素和木素)898異頭碳(C1)振動664OH面外彎曲

2.4傅里葉紅外光譜(FT-IR)檢測

利用FT-IR對預處理前后的麥草進行定性分析,FT-IR譜圖見圖6,麥草中各功能基團對應紅外吸收峰值見表2。

由表2可知,3400、2900、1160 cm-1處分別代表纖維素分子中O—H伸縮振動、C—H伸縮振動、及C—O—C不對稱伸縮振動,為纖維素的特征吸收峰,觀察預處理前后麥草FT-IR譜圖發(fā)現(xiàn),在這三處仍有明顯的吸收峰,只是峰的強度略有不同,這說明纖維素在反應過程中沒有發(fā)生衍生化反應。在木素的苯環(huán)特征峰1596、1506和1426 cm-1處,吸收峰強度顯著下降,這表明在預處理過程中,木素結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)發(fā)生了開裂。這可能是因為無論是自由基還是單線態(tài)氧,都具有強親電性,而在木素結(jié)構(gòu)中,苯環(huán)電子云密度大,且多與側(cè)鏈形成π-π、P-π共軛,因此更容易發(fā)生反應造成價鍵斷裂,使得木素降解成碎片[16]。木素的脫除有助于麥草纖維暴露出更大的表面積,利于后續(xù)酶解的進行。

2.5預處理對纖維素結(jié)晶度的影響

纖維結(jié)晶區(qū)是纖維分子間通過規(guī)則的氫鍵排列連接,總體表現(xiàn)出晶體的特征,計算纖維素結(jié)晶度的方法主要包括：X射線衍射、紅外光譜法以及拉曼光譜法等,較常見的計算方法是利用X射線衍射,對纖維素Ⅰ結(jié)晶度用Segal經(jīng)驗法[17]計算。

式中,CI為結(jié)晶度；I002為纖維素結(jié)晶區(qū)衍射峰的衍射強度；Iam為無定形區(qū)衍射強度(對纖維素Ⅰ,2θ=18°)。

預處理前后麥草纖維的結(jié)晶度變化見圖7。

圖7　預處理前后麥草纖維的結(jié)晶度變化

纖維素的結(jié)晶度是指纖維素構(gòu)成的結(jié)晶區(qū)占纖維素整體的百分率,它反映纖維素聚集時形成結(jié)晶的程度[18]。由圖7可知，未經(jīng)預處理的麥草纖維結(jié)晶度為44.49%,經(jīng)O2-[Emim]Ac預處理后麥草纖維結(jié)晶度為31.88%,結(jié)晶度降低了12.61%,纖維素結(jié)晶度的降低有利于纖維素酶水解,這也是預處理后麥草纖維酶水解效率提高的原因。

3　結(jié)　論

以麥草為原料,探討了氧氣(O2)-離子液體(1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽，[Emim]Ac)預處理工藝條件對麥草酶解效率的影響。

(1)在固液比1∶1.5條件下,O2-[Emim]Ac預處理麥草較適宜的條件為：處理溫度130℃,氧壓0.4 MPa,處理時間6 h。

(2)在溫度130℃,氧壓0.4 MPa,處理時間6 h的條件下預處理后,麥草酶解的還原糖得率為65.1%,高于未經(jīng)預處理麥草酶解還原糖得率的5倍多。

(3)經(jīng)O2-[Emim]Ac預處理后麥草纖維表面粗糙、多孔、疏松,纖維素結(jié)晶度降低了12.61%,纖維的可及度的提高和纖維結(jié)晶度的降低均有利于后續(xù)麥草纖維酶水解效率,進而表現(xiàn)出較高的酶解性能。

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(責任編輯：常青)

Improving Enzymatic Hydrolysis Efficiency of Wheat Straw by Oxygen-ionic Liquid [Emim]Ac Pretreatment

CHEN De-kunCHEN Jia-chuan*YANG Gui-huaWANG QiangJIA Ting-pengLIU Shan-shan

(KeyLabofPaperScienceandTechnologyofMinistryofEducation,QiluUniversityofTechnology,Ji’nan,ShandongProvince, 250353)

(*E-mail: chenjc@qlu.edu.cn)

The combined pretreatment of oxygen and ionic liquid [Emim]Ac to improve the enzymatic hydrolysis efficiency of wheat straw was investigated in this paper. Results showed that the optimal conditions were: ratio of solid to liquid 1∶1.5, oxygen pressure 0.4 MPa, temperature 130 ℃ and treatment time 6 h. Under such conditions, the reducing sugar yield of 65.1% was obtained at cellulase dosage of 30 U/g and enzymatic hydrolysis time 72 h, which was 5 times higher than the unpretreated raw material. Characterization of the treated wheat straw by SEM, XRD and FT-IR analysis showed that its surface became rough and porous, and the crystallinity decreased by 12.6%.

wheat straw; ionicoliquid; oxygen; enzymatic hydrolysis

陳德坤先生，在讀碩士研究生；主要從事生物質(zhì)資源化方面的研究。

2016- 01- 07(修改稿)

本課題得到國家自然科學基金(31270626,31270627,31370580,31470602)、山東省重大科技專項(2014ZZCX09101,2015ZDZX-09002)、泰山學者工程專項經(jīng)費的資助。

陳嘉川先生,E-mail:chenjc@qlu.edu.cn。

TS721+.1

ADOI：10.11980/j.issn.0254- 508X.2016.06.007