馬英輝　李利軍　盧美歡　王銀存

(1.陜西省微生物研究所,陜西西安,710043；2.西北大學(xué),陜西西安,710069)

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·細菌纖維素·

細菌纖維素的制備及其對LBKP性能的影響

馬英輝1李利軍1盧美歡1王銀存2

(1.陜西省微生物研究所,陜西西安,710043；2.西北大學(xué),陜西西安,710069)

探討了以秸稈水解液作為唯一碳源生產(chǎn)細菌纖維素的工藝參數(shù),并考察了細菌纖維素濕膜對漂白硫酸鹽闊葉木漿(LBKP)紙張性能的影響。實驗結(jié)果表明,以秸稈水解液作為唯一碳源,采用動靜兩步法制備細菌纖維素的最大產(chǎn)量為4.27 g/L；細菌纖維素濕膜添加到LBKP中能夠明顯提高紙張抗張指數(shù)、撕裂指數(shù)、耐破指數(shù)、耐折度、透氣度等物理性能。

細菌纖維素；秸稈水解液；LBKP；紙張性能

細菌纖維素(BC)是由細菌合成的一種高性能納米纖維素材料,作為一種新興的高分子材料,具有傳統(tǒng)纖維素所無法比擬的物理、化學(xué)性質(zhì),直徑為植物纖維的1/100,其彈性模量高達1.5×1010Pa,與鋁相當(dāng)[1]。細菌纖維素因其具有高純度[2]、高結(jié)晶度、高聚合度、高持水能力、較好的生物相容性和可降解性等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于音響膜、人工血管[3]、復(fù)合材料、無紡布等重要領(lǐng)域。細菌纖維素在造紙工業(yè)中也已表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[4],如在涂料、增稠劑、增強劑、膠黏劑、高強度紙張、防偽紙制品、高品質(zhì)薄型印刷紙、可循環(huán)使用的嬰兒尿布等方面的開發(fā)應(yīng)用。但目前細菌纖維素的產(chǎn)量低,生產(chǎn)成本還較高,價格較貴,使得其應(yīng)用局限于某些高附加值產(chǎn)品的制造過程中[5]。

利用木質(zhì)纖維廢棄物水解液作為碳源生產(chǎn)細菌纖維素能夠顯著降低其成本[6],本課題將以秸稈水解液為碳源,研究制備細菌纖維素的工藝參數(shù),降低細菌纖維素的制備成本,促進細菌纖維素在造紙工業(yè)中的應(yīng)用。

1　實　驗

1.1菌株

GluconacetobacterHC-N,實驗室保存,從土壤中分離獲得,并經(jīng)過秸稈水解液誘導(dǎo)的菌株。

1.2實驗儀器設(shè)備

培養(yǎng)箱、恒溫搖床、722可見分光光度計、攪拌器、光學(xué)顯微鏡、耐折度儀(GT- 6014-A)、臥式抗張強度儀(L&W SE060)、耐破度儀(SE180)、透氣度儀(4110- 4320-1)、撕裂度儀(SE009)、纖維疏解機(model500-1)、抄紙機(HK-CP01)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1200BV-OSB2100)、掃描電鏡(6700F)。

1.3實驗原料

秸稈水解液[7]：秸稈粉碎后經(jīng)過多聚磷酸與生物酶處理,層析柱純化后,真空濃縮為糖濃度10%的液體。

活化培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：秸稈水解液,調(diào)整糖濃度為2%。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：秸稈水解液糖含量2%,蛋白胨0.5%,酵母粉0.5%,磷酸氫二鈉0.27%,檸檬酸0.115%,硫酸鎂0.025%,121℃滅菌20 min后加無水乙醇2%。

1.4實驗方法

1.4.1GluconacetobacterHC-N菌株的活化與誘導(dǎo)

1.4.1.1菌種活化

將GluconacetobacterHC-N接種于固體活化培養(yǎng)試管中,30℃活化16 h,待長出菌落后,接種于液體活化培養(yǎng)基中,180 r/min、30℃搖瓶培養(yǎng)24 h。

1.4.1.2秸稈水解液誘導(dǎo)

將活化好的液體種子按10%～15%的接種量接種于糖濃度為2%的秸稈水解液中,180 r/min搖瓶培養(yǎng),每隔4 h測定種子液吸光度(OD)值(600 nm),直到OD值達到1.5以上時,取出待用。

1.4.2細菌纖維素制備工藝優(yōu)化

1.4.2.1培養(yǎng)方式研究

采用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基分別進行150 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d、30℃靜置培養(yǎng)7 d、先150 r/min搖瓶40 h培養(yǎng)再靜置5 d的培養(yǎng)，并對其進行對比，以找到秸稈水解液為唯一碳源的最佳培養(yǎng)方式。

1.4.2.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件研究

利用design-expert軟件設(shè)計因素水平實驗,考查碳源濃度、氮源種類及配比、合成因子種類及濃度以及培養(yǎng)條件對菌株GluconacetobacterHC-N發(fā)酵秸稈水解糖制備細菌纖維素產(chǎn)量的影響,從而獲得以秸稈水解液為唯一碳源的最佳細菌纖維素制備工藝。

1.4.3細菌纖維素產(chǎn)量計算方法

將發(fā)酵獲得的細菌纖維素膜進行酸洗、堿洗以除去菌體，用蒸餾水洗至中性，80℃干燥4 h，稱重。

1.4.4細菌纖維素對LBKP性能的影響

將發(fā)酵獲得的細菌纖維素濕膜進行酸洗、堿洗以除去菌體,用蒸餾水沖洗至中性,然后采用疏解分散機進行分散,剪切轉(zhuǎn)速為3000 r/min,剪切60 min,剪切分散,細菌纖維素用量分別為0.5%、1%、2%(對LBKP絕干量),然后進行打漿、抄造手抄片,按照相應(yīng)國家標準測定手抄片的定量、厚度、松厚度、透氣度、耐折度、抗張指數(shù)、撕裂指數(shù)、耐破指數(shù)。

2　結(jié)果與討論

2.1菌株GluconacetobacterHC-N在以秸稈水解液為唯一碳源誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長情況

圖1為菌株在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長情況。從圖1可以看出,菌株在前20 h處于調(diào)整期,菌體濃度基本無明顯的增長,這是由于秸稈水解液中存在一定量的多酚類物質(zhì)[8],一定程度上抑制了菌體的過快生長,不利的生長環(huán)境延長了菌株的調(diào)整期；20 h后,菌體濃度開始呈對數(shù)上升,40 h時OD值已經(jīng)達到2.0左右,說明菌株對惡劣的環(huán)境已經(jīng)適應(yīng)；40 h后由于培養(yǎng)液營養(yǎng)耗盡,菌體濃度處于較穩(wěn)定的狀態(tài)。從圖1中OD達到2.0所需的時間來看,由于唯一碳源和抑制因子的存在,使得菌株GluconacetobacterHC-N的生長周期變長。

圖1　Gluconacetobacter HC-N在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長曲線

2.2培養(yǎng)方式研究

圖2為不同培養(yǎng)方式對細菌纖維素產(chǎn)量的影響。從圖2可見,在不同的培養(yǎng)方式下,細菌纖維素產(chǎn)量差別較大,搖瓶培養(yǎng)7 d時的細菌纖維素產(chǎn)量最低；而先搖瓶40 h后再靜置培養(yǎng)5 d時細菌纖維素產(chǎn)量最高,達到3.2 g/L,因為秸稈水解液中含有抑制菌體生長的成分,菌體需要消耗大量的氧氣來抵抗水解液中的不良成分,搖瓶40 h后,菌體達到一定濃度,菌體進入了穩(wěn)定期開始合成細菌纖維素,此時再靜置培養(yǎng)5 d 有利于纖維素鏈的延伸[9]和保持較高的楊氏模量,所以先搖瓶后靜置的培養(yǎng)方式下細菌纖維素的產(chǎn)量最高。

圖2　不同培養(yǎng)方式對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

2.3細菌纖維素制備工藝的單因素實驗

2.3.1秸稈水解液糖濃度對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

圖3所示為秸稈水解液碳源濃度對細菌纖維素產(chǎn)量的影響。從圖3中可以看出,菌株GluconacetobacterHC-N以葡萄糖作為碳源時,隨著葡萄糖濃度的增加,細菌纖維素產(chǎn)量隨之上升,在葡萄糖濃度約3%時,細菌纖維素產(chǎn)量達到最大,后隨碳源濃度的增加,細菌纖維素的產(chǎn)量趨于穩(wěn)定；而以秸稈水解液作為碳源時,由于水解液中多酚類物質(zhì)的存在,所以細菌纖維素產(chǎn)量會隨著秸稈水解液糖濃度的增加先增大后減小[10],依據(jù)圖3的趨勢線,當(dāng)秸稈水解液中糖濃度為2%左右時,細菌纖維素產(chǎn)量最大。

圖3　秸稈水解液糖濃度對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

2.3.2添加氮源種類及濃度對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

以秸稈水解液為唯一碳源的情況下,實驗了5種速效氮源對細菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。圖4顯示,有機氮源更能促進細菌纖維素的合成,是因為有機氮源的營養(yǎng)更豐富,能夠更有利于菌株對不良環(huán)境的克服,與文獻[11]報道相同。酵母粉和蛋白胨對細菌纖維素的產(chǎn)量影響差別很小,但酵母粉在濃度為0.6%時,細菌纖維素產(chǎn)量最先達到高值,所以綜合考慮,酵母粉的濃度為0.6%。

圖4　氮源及其濃度對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

2.3.3添加乙醇、瓊脂、殼聚糖對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

高分子聚合物如殼聚糖、瓊脂、明膠可改變發(fā)酵液黏度,也可改變細菌合成纖維素時纖維絲的裝配,從而可影響細菌的代謝途徑,誘導(dǎo)或阻礙細菌纖維素的合成[12]。而乙醇作為細菌纖維素的能源物質(zhì)[13],對傳統(tǒng)木醋桿菌生產(chǎn)細菌纖維素具有促進作用,但針對此菌株且在以秸稈水解液為唯一碳源的培養(yǎng)基中,乙醇的加入是否有促進作用還未知,所以,本實驗通過采用用量1 g/L的瓊脂、殼聚糖、明膠和體積分數(shù)2%的乙醇考察其對細菌纖維素合成的影響，結(jié)果見圖5。

圖5　乙醇與高分子物質(zhì)對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

從圖5可以看出,乙醇的添加能夠明顯促進細菌纖維素的合成,可能是因為菌株在生長過程中會形成乙醇中間體,而后才合成纖維素,乙醇的加入能夠提高乙醇中間體的濃度,促進菌體進入下游纖維素的合成階段；而高分子物質(zhì)瓊脂和明膠效果與對照樣差別不大,與文獻[14]報道的有所差別,原因可能是秸稈水解液削弱了瓊脂與明膠的增強作用；殼聚糖由于具有抑制菌株生長的作用,所以加入后明顯不利于細菌纖維素的合成；而乙醇與高分子物質(zhì)的混合加入,并沒有顯著提高細菌纖維素的合成效率。

2.3.4培養(yǎng)溫度、初始pH值對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

圖6和圖7分別顯示了培養(yǎng)溫度和pH值對細菌纖維素合成的影響。由圖6可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃時,細菌纖維素的產(chǎn)量達到最大，為3.53 g/L,后隨著溫度的升高,細菌纖維素產(chǎn)量呈下降趨勢。由圖7可知，當(dāng)初始pH值為5和7時,細菌纖維素的產(chǎn)量無明顯差別,應(yīng)在下一步的實驗中繼續(xù)研究。

圖6　培養(yǎng)溫度對細菌纖維素合成的影響

圖7　初始pH值對細菌纖維素合成的影響

2.4細菌纖維素制備工藝的Box-Behnken實驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,利用Design-expert 8.0設(shè)計Box-Behnken實驗,實驗方案及實驗結(jié)果如表1和表2所示。

表1　Box-Behnken水平實驗方案

表2　Box-Behnken實驗結(jié)果

由表3可見,在95%的置信區(qū)間內(nèi),用Design-expert最小誤差原則去掉不顯著項,擬合成的方程為：y=-9.2+0.8A+2.2B+3.1C+0.12AC-0.27A2-0.36B2-0.31C2。

圖8為該模型的學(xué)生化殘差分布圖。由圖8可以看出,其殘差各點的分布幾乎在一條直線上,說明模型擬合效果較好。

表3　各因子對響應(yīng)值的影響顯著程度

圖8　模型內(nèi)學(xué)生化殘差分布圖

根據(jù)數(shù)學(xué)模型中各影響因素系數(shù)的絕對值大小可以看出各影響因素對細菌纖維素產(chǎn)量影響的強度。系數(shù)絕對值越大,該因素對因變量的影響越大。由此可知,單因素對細菌纖維素產(chǎn)量影響的強弱順序為pH值(C)>乙醇濃度(B)>碳氮比(A)，碳氮比與pH值的交互作用(AC)對細菌纖維素的產(chǎn)量影響最大。模型的參數(shù)優(yōu)化與驗證結(jié)果見表4。

表4　參數(shù)驗證

從表4可以看出,在碳氮比為3∶1、乙醇用量為3%、初始pH值為6.0時,細菌纖維素的產(chǎn)量為4.27 g/L,與模型的相對誤差僅為2.5%左右。說明Design-expert 8.0軟件所建立的細菌纖維素產(chǎn)量與碳氮比、乙醇濃度、pH值關(guān)系模型準確、可靠。

綜上可知，以秸稈水解液為唯一碳源的細菌纖維素的最佳制備條件為：秸稈水解糖含量2%、酵母粉0.7%、磷酸氫二鈉0.27%、檸檬酸0.115%、硫酸鎂0.025%,初始pH值為6.0,滅菌后接種前加入用量3%的無水乙醇,30℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)40 h,然后28℃靜置5 d,至液體培養(yǎng)基被消耗殆盡為止。

表5　添加細菌纖維素對LBKP性能的影響

圖9　細菌纖維素照片

此條件下獲得的細菌纖維素的產(chǎn)量為4.27 g/L。

2.5細菌纖維素對LBKP性能的影響

2.5.1細菌纖維素分散前的照片

圖9為細菌纖維素的顯微鏡及SEM照片。從圖9中可以看出,細菌纖維素細長,長徑比遠高于普通化學(xué)漿纖維,因此,細菌纖維素極難分散成單根纖維,而是多根纖維的聚集體。如果分散不徹底,那么纖維素分子鏈上的游離羥基就無法很好地暴露出來,造成與植物纖維的結(jié)合不好[15],其手抄片的強度就會受到影響,不僅無法提高紙張性能,反而會因為其顆粒較大阻礙植物纖維間的結(jié)合,嚴重影響手抄片的強度。

2.5.2紙張性能測試

表5為添加不同用量細菌纖維素對LBKP性能的影響。從表5中明顯看出,添加一定量的細菌纖維素后,LBKP紙張的透氣度、耐折度、撕裂指數(shù)和耐破指數(shù)都有所增加,而紙張的松厚度、抗張指數(shù)變化不太明顯,這與文獻[16]報道有所差別,主要原因是紙漿不同所致,即細菌纖維素對不同紙漿性能的增強效果不同,同時也與細菌纖維素的分散工藝有關(guān),分散不完全會影響抄紙的各項指標,但從總體來說,細菌纖維素的適量加入有利于改善紙張性能。

3　結(jié)　論

3.1以秸稈水解液作為唯一碳源,采用動靜結(jié)合兩步法合成養(yǎng)細菌纖維素的最佳條件為:秸稈水解糖含量2%、酵母粉含量0.7%、磷酸氫二鈉0.27%、檸檬酸0.115%、硫酸鎂0.025%,初始pH值為6.0,滅菌后接種前加入3%的無水乙醇,30℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)40 h,然后28℃靜置5 d,獲得細菌纖維素產(chǎn)量為4.27 g/L。

3.2細菌纖維素濕膜添加到漂白硫酸鹽闊葉木漿(LBKP)中能夠改善紙張的物理性能,但由于細菌纖維素性狀的特殊性,細菌纖維素的分散工藝與不同紙漿的結(jié)合能力還需進一步研究。

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(責(zé)任編輯：劉振華)

Bacterial Cellulose Preparation Using Straw Hydrolysate and Its Effect on LBKP Performance

MA Ying-hui1,*LI Li-jun1LU Mei-huan1WANG Yin-cun2

(1.ShaanxiProvinceInstituteofMicrobiology,Xi’an,ShaanxiProvince, 710043; 2.NorthwestUniversity,Xi’an,ShaanxiProvince, 710069)

(*E-mail： yinghuima@163.com)

Bacterial cellulose was prepared by using straw hydrolysate which was the only carbon source, then physical properties of the LBKP paper adding wet bacterial cellulose were studied. The result showed that the max dry production of bacterial cellulose was 4.27 g/L. Using two-step fermentation process with straw hydrolysate as carbon source, the physical properties of the paper adding the wet bacterial cellulose including tensile index, tear index, burst index, folding endurance and air permeability were obviously improved.

bacterial cellulose; straw hydrolysate; LBKP; paper performance

馬英輝先生,助理研究員；研究方向：資源環(huán)境微生物。

2015-12-22(修改稿)

陜西省科學(xué)院科技計劃項目2015K-14。

TS722

ADOI：10.11980/j.issn.0254- 508X.2016.06.005