楊宇虹

（永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院　永州 425100）

耐輻射奇球菌 DR_2327和 DR_2328基因克隆及功能分析

楊宇虹

（永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院永州 425100）

通過生物信息學(xué)分析耐輻射奇球菌DR_2327和DR_2328基因及編碼蛋白的基本性質(zhì)，利用PCR方法克隆DR_2327和DR_2328的全基因，連接至pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中，并進(jìn)行雙酶切鑒定。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，DR_2327和DR_2328基因位于同一操縱子中，且DR_2328蛋白具有組氨酸激酶活性，DR_2327蛋白具有反應(yīng)調(diào)節(jié)子功能，提示兩者很可能組成一對雙組分系統(tǒng)。體外實(shí)驗表明，DR_2327和DR_2328基因的外源表達(dá)在一定程度上提高了大腸桿菌對紫外輻照和H2O2的耐受能力。

耐輻射奇球菌，DR_2327，DR_2328，基因克隆，生物信息學(xué)分析

CLCQ78， Q527

耐輻射奇球菌（Deinococcus radiodurans， DR）是迄今為止地球上已知生物中輻射抗性最強(qiáng)的物種之一，最早由美國科學(xué)家Anderson等在經(jīng)X射線滅菌后仍然變質(zhì)的肉罐頭中分離出來［1］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DR擁有驚人的抗輻射能力，其暴露于γ射線劑量達(dá)到 5 kGy時不會喪失任何的活力，達(dá)到 15 kGy時仍然保持37%的細(xì)胞活力，在由137Cs源提供的劑量率高達(dá)60 Gy/h的持續(xù)γ輻照條件下仍能維持生長且不會誘發(fā)突變，在接受由10 MeV，18 kW的β射線源提供的15 kGy輻照后，培養(yǎng)12 h的細(xì)胞活力達(dá)到對照條件下的50%左右［2-5］。然而接受電離輻射達(dá)到 5～6 Gy時便能引起一個健康成年人的死亡，達(dá)到200～800 Gy時能滅活大腸桿菌等常見微生物。接受這種高劑量的電離輻射會導(dǎo)致DR的基因組破碎成無以數(shù)計的DNA片段，但這些DNA碎片在DR的下一次細(xì)胞分裂前能得到有效的修復(fù)，重新精確組裝成完整的基因組而不會發(fā)生突變。

DR在極端輻射環(huán)境下表現(xiàn)出來的超強(qiáng)DNA損傷修復(fù)能力表明其擁有一套高效、精確的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，而在這個修復(fù)系統(tǒng)中首先要能快速的感受到外界環(huán)境的變化，從而快速啟動機(jī)體的應(yīng)對機(jī)制。雙組分系統(tǒng) （Two-component regulatory system， TCS） 是細(xì)菌感受外界環(huán)境變化并啟動內(nèi)部應(yīng)激反應(yīng)的重要組成部分，由組氨酸激酶（Histidine kinase， HK）和反應(yīng)調(diào)節(jié)器（Response regulator， RR）兩個基本元件構(gòu)成，對細(xì)菌適應(yīng)不良環(huán)境條件起著關(guān)鍵作用［6-7］。在 DR中，Desai等［8］發(fā)現(xiàn) DR_B0090和DR_B0091組成一對雙組分系統(tǒng)，DR_B0090和DR_B0091的單或雙敲除株表現(xiàn)出對 DNA損傷劑的敏感性增強(qiáng)，且 DNA雙鏈斷裂修復(fù)明顯延遲，這表明雙組分系統(tǒng)對DR的DNA損傷修復(fù)能力具有重要作用，也提示DR中還存在由其它基因組成的雙組分系統(tǒng)。

本研究利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測DR中可能的雙組分系統(tǒng)，初步證明蛋白DR_2327和DR_2328很可能在DR中組成一對雙組分系統(tǒng)，目前國內(nèi)外尚未見針對DR_2327和DR_2328基因功能研究的報道，其在 DR中的具體功能未知。本研究對DR_2327和DR_2328的基本性質(zhì)和功能進(jìn)行分析和預(yù)測，利用PCR的方法克隆這兩個基因并保存在T載體中，為進(jìn)一步研究 DR的雙組分系統(tǒng)及DR_2327、DR_2328的生物學(xué)功能提供實(shí)驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

Deinococcus radiodurans R1（編號 CGMCC 1.633）購自中國科學(xué)院微生物所菌種保藏中心，E.coli JM109菌株由中心實(shí)驗室保存，pGEM-T Easy Vector 購自 Promega 公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶 EcoR I、Xho I、T4 DNA 連接酶購自Fermentas 公司；瓊脂糖、胰蛋白胨酵母提取物、葡萄糖、NaCl購自 OXID公司；DNA Maker購自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司，引物合成委托上海生工完成。

1.2主要儀器

DTC-3 PCR 基因擴(kuò)增儀（上海嘉鵬），HPX-9052MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅），SHZ-A水浴恒溫振蕩器（上海博迅），DYCP-31CN瓊脂糖水平電泳儀（北京六一），WD-9413A型凝膠成像分析系統(tǒng)（北京六一），F(xiàn)A2004B型電子天平（上海越平）。

1.3方法

1.3.1DR_2327和DR_2328的生物信息學(xué)分析

在GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取DR_2327和DR_2328的基因組和蛋白質(zhì)序列，并分析 DR_2327和DR_2328基因在 DR基因組中的定位，利用Genome2D 在線數(shù)據(jù)庫分析DR_2327和DR_2328是否位于同一個操縱子中，利用 SSDB預(yù)測DR_2327和DR_2328蛋白的結(jié)構(gòu)域，利用NPS在線服務(wù)器和 SWISS-MODEL對 DR_2327和DR_2328基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行同源建模分析。

1.3.2引物設(shè)計

根據(jù)在GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取的DR_2327和DR_2328的基因序列，利用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計 PCR擴(kuò)增引物，在兩端加上合適的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基， 擴(kuò)增DR_2327的上游引物DR_2327-F序列為：5'-CGGAATTCATGCGCCTGCTGCTCG TCGA-3'（下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn)），下游引物DR_2327-R序列為：5'-TCCTCGAGTCACT TCTCG GTCCG GTAGCCC-3'（下劃線為Xho I酶切位點(diǎn)）；擴(kuò)增DR_2328的上游引物DR_2328-F序列為：5'-CG GAATTCGTGAAGCTCTCGCTGCGTG-3'（下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn)），下游引物DR_2328-R序列為：5'-TCCTCGAGTCATGGCGTCACATGCTCCGGT-3'（下劃線為Xho I酶切位點(diǎn)）。委托上海生工合成上述引物。

1.3.3DR基因組的提取

從-80 ℃超低溫冰箱中取出保存的DR菌種，接種于營養(yǎng)肉汁瓊脂固體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，牛肉提取物3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂15 g/L）中，30 ℃倒置培養(yǎng)36 h，挑取單克隆轉(zhuǎn)接于TGY液體培養(yǎng)基（蛋白胨5 g/L，酵母提取物3 g/L，葡萄糖1 g/L），30 ℃，215 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，采用CTAB/NaCl法提取DR全基因組DNA。

1.3.4DR_2327和DR_2328的克隆

采用PCR方法從提取的DR基因組DNA中擴(kuò)增出目的基因 DR_2327和 DR_2328，反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min，（94 ℃變性1 min，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)），72 ℃延伸 5 min，產(chǎn)物用 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因并進(jìn)行膠回收?；厥债a(chǎn)物和pEGM-T載體分別用Xho I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，4 ℃連接過夜，連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 感受態(tài)中，接種在LB固體平板（蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L）上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。藍(lán)白斑篩選法獲取陽性克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用Xho I和EcoR I雙酶切鑒定。

1.3.5紫外輻照處理

將轉(zhuǎn)染pEGM-T空載體、pEGM-DR_2327和pEGM-DR_2328的大腸桿菌JM109培養(yǎng)至OD600值約1.2，用新鮮的培養(yǎng)基梯度稀釋106倍，取100 μL菌液均勻涂抹至LB平板中，用強(qiáng)度800 W/m2波長254 nm的紫外燈分別照射2、4、6、8、10、12 s，各吸收劑量做重復(fù)3次測定。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)過夜，取出平板計數(shù)菌落，計算存活率。

1.3.6過氧化氫處理

將轉(zhuǎn)染pEGM-T空載體、pEGM-DR_2327和pEGM-DR_2328的大腸桿菌JM109培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取H2O2母液分別配制10、20、30、40、50 mmol/L的溶液分別加入到100 μL菌液中，混勻后4 ℃遮光處理30 min，加入100 μg/mL的過氧化氫酶處理剩余的H2O220 min。稀釋菌液至合適濃度后分別涂板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，觀察平板上菌落數(shù)目并計算存活率。H2O2處理組均重復(fù)3次測定取均值。

2　結(jié)果與分析

2.1DR_2327與DR_2328在基因組上的定位

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取DR_2327與DR_2328的基因序列，其中DR_2327的基因序列長為663 bp，編碼蛋白質(zhì)含220個氨基酸殘基；DR_2328的基因序列長為1 509 bp，編碼的蛋白質(zhì)包含502個氨基酸殘基。DR_2327與DR_2328均位于DR基因組的染色體I中，為相鄰基因，具體位置如圖1所示。為了進(jìn)一步研究兩者的位置關(guān)系，利用Genome2D 在線軟件對 DR的全基因組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示DR_2327、DR_2328與上游的DR_2326三個基因位于同一個操縱子中。

2.2DR_2327與 DR_2328編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測

2.2.1DR_2327與 DR_2328蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用 NPS服務(wù)器中的 SOPMA算法預(yù)測DR_2327與DR_2328編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)［9］，結(jié)果顯示 DR_2327編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋，無規(guī)則卷曲次之，β片層第三，轉(zhuǎn)角最少（圖2），而 DR_2328編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋，β片層次之，無規(guī)則卷曲最少（圖3）。

2.2.2DR_2327與 DR_2328蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

為進(jìn)一步了解DR_2327與DR_2328蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，采用 SWISS-MODEL在線軟件對DR_2327和DR_2328基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行同源建模，結(jié)果見圖4。由圖4可知，DR_2327蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)主要由螺旋和卷曲組成，與二級結(jié)構(gòu)組成基本一致，整體上與假定的組氨酸激酶CovS和傳感蛋白CPXA具有較高的相似性，末端還具有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，提示其可能具有DNA結(jié)合功能。

DR_2328蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)主要由螺旋和片層組成，與二級結(jié)構(gòu)組成基本一致，末端存在片層連接兩個α螺旋的HAMP樣結(jié)構(gòu)域（圖4），這與組氨酸激酶的受體、ATP水解酶等結(jié)構(gòu)上具有較高的相似性。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)提示DR_2327與DR_2328蛋白質(zhì)具有組成細(xì)菌雙組分系統(tǒng)蛋白的特性。

2.2.3DR_2327與DR_2328的功能結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步分析DR_2327和DR_2328的功能結(jié)構(gòu)域，利用 NCBI數(shù)據(jù)庫中的 Conserved Domains［10］在線工具對DR_2327和DR_2328蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明DR_2327蛋白主要具有REC、Trans_reg_C和OmpR等功能結(jié)構(gòu)域，包含8個激活位點(diǎn)、9個DNA結(jié)合位點(diǎn)、1個磷酸化位點(diǎn)、多個二聚化接口（圖5，表1）。REC是信號接受結(jié)構(gòu)域，在細(xì)菌中廣泛存在，如CheY、OmpR、 NtrC和PhoB等，包含一個磷酸化受體位點(diǎn)，能接收傳感蛋白的信號，在細(xì)菌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用。Trans_reg_C是反應(yīng)調(diào)節(jié)子效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，在細(xì)菌和真核生物的雙組分系統(tǒng)中高度保守，DR_2327蛋白的Trans_reg_C結(jié)構(gòu)域包含DNA結(jié)合位點(diǎn)，提示其是一種 DNA結(jié)合反應(yīng)調(diào)節(jié)子，與OmpR調(diào)節(jié)子高度相似。DR_2328蛋白主要包含HAMP、HisKA、HATPase_c、Trans_reg_C等結(jié)構(gòu)域，具有1個磷酸化位點(diǎn)，13個ATP結(jié)合位點(diǎn)，1個Mg2+離子結(jié)合位點(diǎn)，4個G-x-G基序，多個二聚化接口（圖6，表2）。HAMP即組氨酸激酶（Histidine kinases）、腺苷酸環(huán)化酶（Adenylate cyclases）、甲基受體蛋白（Methyl accepting proteins）和磷酸酶（Phosphatases）結(jié)構(gòu)域，是一段50個氨基酸殘基的由α螺旋區(qū)域，一般以二聚體形式存在，在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要作用。HisKA結(jié)構(gòu)域一般以二聚體形式存在，形成4螺旋結(jié)構(gòu)，擁有保守的組氨酸殘基，可以通過反式自磷酸化激活，轉(zhuǎn)移磷?；o天冬氨酸殘基，發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，在細(xì)菌雙組分系統(tǒng)中廣泛存在。HATPase_c即組氨酸激酶樣ATP酶，該家族主要包括多個ATP結(jié)合蛋白，如組氨酸激酶、DNA促旋酶 B、拓?fù)洚悩?gòu)酶，熱休克蛋白HSP90、光敏色素類ATP酶和DNA錯配修復(fù)蛋白等，具有重要的生物學(xué)功能。

表1　DR_2327蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Table 1　Conserved domains analysis result of DR_2327

表2　DR_2328蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Table 2　Conserved domains analysis result of DR_2328

2.3DR_2327與DR_2328的基因克隆

以DR基因組DNA為模板，利用設(shè)計的特定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆DR_2327與DR_2328基因，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對應(yīng)泳道可見分別為663 bp和1509 bp的條帶（圖7（a）），與目的基因大小一致；將PCR產(chǎn)物回收、純化、酶切后與pEGM-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109，過夜培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，經(jīng)Xho I和EcoR I雙酶切鑒定，對應(yīng)泳道分別得到663 bp和3 015 bp、1 509 bp和3 015 bp條帶（圖7（b）），表明成功克隆DR_2327和DR_2328基因。

2.4DR_2327與DR_2328基因的表達(dá)對大腸桿菌UV輻照壓力存活率的影響

為了確定 DR_2327與DR_2328基因的表達(dá)對大腸桿菌紫外輻照耐受的影響，我們對轉(zhuǎn)染pEGM-DR_2327、pEGM-DR_2328載體的JM109進(jìn)行了不同劑量的紫外輻照處理，并與轉(zhuǎn)染pEGM-T空載體組比較，觀察它們細(xì)胞存活率的變化情況。實(shí)驗結(jié)果表明，與空載體組相比，pEGM-DR_2327和 pEGM-DR_2328轉(zhuǎn)染組的紫外輻射抗性顯著增強(qiáng)（見圖 8）。由圖 8可知，當(dāng)紫外輻照 2 s時，pEGM-DR_2327轉(zhuǎn)染組的生存率在 40%以上，pEGM-DR_2328的生存率在50%以上，而對照的空載體轉(zhuǎn)染組僅20%左右；照射6 s時，對照組已存在明顯的致死性效應(yīng)，存活率不足 1%，而此時pEGM-DR_2327轉(zhuǎn)染組的存活率仍有 15%左右，pEGM-DR_2328轉(zhuǎn)染組的存活率仍有 30%左右。pEGM-DR_2327和pEGM-DR_2328轉(zhuǎn)染組在紫外輻照下表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，提示 DR_2327和DR_2328基因在紫外輻射抗性方面發(fā)揮重要作用，且DR_2328基因的抗性能力更強(qiáng)，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.5DR_2327與DR_2328基因的表達(dá)對大腸桿菌H2O2壓力存活率的影響

氧化應(yīng)激是電離輻射對生物大分子產(chǎn)生損傷的重要機(jī)制。為了確定 DR_2327與DR_2328基因的表達(dá)能否增強(qiáng)大腸桿菌的抗氧化能力，我們對轉(zhuǎn)染pEGM-DR_2327、pEGM-DR_2328載體的JM109用不同濃度的H2O2處理，并與轉(zhuǎn)染pEGM-T空載體組比較，觀察它們細(xì)胞存活率的變化情況。如圖 9所示，在穩(wěn)定生長期，10 mmol/L H2O2處理30 min后，各處理組的存活率均顯著下降，空載體組、pEGM-DR_2327組和pEGM-DR_2328組的存活率分別約為45%、47%和55%；20 mmol/L H2O2條件下，兩者的下降趨勢都較快，空載體組、pEGM-DR_2327組和pEGM-DR_2328組的存活率分別約為23%、28%和36%；30 mmol/L濃度H2O2處理后，空載體組的生存率降至不到 10%，pEGM-DR_2327組和pEGM-DR_2328組的生存率約為12%和17%；高濃度H2O2（＞30 mmol/L）下空載體組幾乎不能生長，而 pEGM-DR_2327組和pEGM-DR_2328組的存活率仍在8%左右的。實(shí)驗結(jié)果顯示，DR_2327和DR_2328基因的外源表達(dá)均能夠在一定程度上增強(qiáng)E.coli細(xì)胞的抗氧化能力。

3　討論

隨著核電及核技術(shù)的不斷發(fā)展，核能在人類社會的應(yīng)用越來越廣泛，核安全與核防護(hù)日漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，尋找應(yīng)對核威脅的有效方法是多個政府部門和一大批科技工作者的工作重心。耐輻射奇球菌擁有極端的輻射抗性，自發(fā)現(xiàn)以來吸引了眾多學(xué)者探索其輻射抗性機(jī)制，并對其能否應(yīng)用于其他領(lǐng)域進(jìn)行了初步探索，結(jié)果表明DR的特有基因在處理核工業(yè)廢料［11］和增強(qiáng)其他生物的抗逆境能力等方面展現(xiàn)出了較好的潛力［12-15］。進(jìn)一步解讀DR的輻射抗性機(jī)制和探索其基因功能具有重要的研究價值和應(yīng)用意義。DR極端的輻射抗性機(jī)制得益于其擁有一套高效、精確的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，可以準(zhǔn)確無誤的快速修復(fù)輻射等因素造成的DNA損傷，而這需要能快速的感受到外界環(huán)境的變化并啟動機(jī)體的應(yīng)對機(jī)制。TCS是細(xì)菌應(yīng)對環(huán)境壓力的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，DR中包含多對可能的TCS，對其極端輻射抗性很可能具有極其重要的作用。本研究中我們通過生物信息學(xué)的方法對 DR_2327與DR_2328進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，發(fā)現(xiàn)兩者位于同一操縱子中，且DR_2327編碼產(chǎn)物具有典型的組氨酸激酶反應(yīng)調(diào)節(jié)子特性，DR_2328編碼產(chǎn)物具有典型的組氨酸激酶活性，提示兩者很可能組成DR的一對雙組分系統(tǒng)，并克隆了DR_2327和DR_2328基因，初步證明外源表達(dá)DR_2327或DR_2328均能在一定程度上增強(qiáng)大腸桿菌JM109對紫外輻照和氧化損傷的耐受能力，且DR_2328的效果可能更強(qiáng)些，提示兩者對DR的輻射抗性具有一定的作用。如能將DR_2327和DR_2328同時共轉(zhuǎn)染到細(xì)菌中，能更好的發(fā)揮雙組分功能，可能對不良環(huán)境的抗逆性更強(qiáng)些。當(dāng)然對DR_2327和DR_2328具體作用的解讀還需要進(jìn)一步進(jìn)行功能研究來證實(shí)。

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Cloning， and functional analysis of DR_2327 and DR_2328 in Deinococcus radiodurans

YANG Yuhong
（Yongzhou Vocational Technical College， Yongzhou 425100， China）

The main characteristics of DR_2327and DR_2328 in Deinococcus radiodurans were analyzeed by bioinformatics. Full-length gene of DR_2327 and DR_2328 was amplified by PCR， and constructed in pGEM-T vector. Transformed recombinant vector into E.coli JM109 and followed by restriction enzyme digestion. DR_2327 and DR_2328 gene was cloned successfully. Bioinformatic analysis results showed that DR_2327 and DR_2328 gene located in the same operon， and DR_2328 protein with histidine kinase activity， DR_2327 protein with response regulator activity. It is suggested that DR_2327 and DR_2328 constitute a two-component system in Deinococcus radiodurans. In vitro experiments showed that DR_2327 and DR_2328 could enhance tolerance to UV radiation and H2O2of E.coli.

Deinococcus radiodurans， DR_2327， DR_2328， Gene cloning， Bioinformatics analysis

YANG Yuhong （female） was born in October 1984 and obtained a master degree from University of South China in 2015，Lecturer， E-mail： yyh_100@163.com.

6 June 2016； accepted 7 July 2016

Q78，Q527

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.050203

楊宇虹，女，1984年10月出生，2015年于南華大學(xué)獲理學(xué)碩士學(xué)位，講師，E-mail： yyh_100@163.com

初稿2016-06-06，修回2016-07-07