劉海,趙劍秋,彭曉靜,劉洋,劉冰冰,蔡立松

(河北省唐山市開灤總醫(yī)院麻醉科,河北 唐山　063000)

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內(nèi)毒素吸附劑對(duì)失血性休克大鼠NO，IL-6及IL-12水平的影響

劉海,趙劍秋,彭曉靜,劉洋,劉冰冰,蔡立松

(河北省唐山市開灤總醫(yī)院麻醉科,河北 唐山063000)

目的：探討內(nèi)毒素吸附劑對(duì)失血性休克大鼠一氧化氮(NO)，白細(xì)胞介素-6( IL-)及白細(xì)胞介素-2(IL-2)水平的影響。方法：選取成年SD大鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只，模型組和藥物組各20只。模型組和藥物組建立失血性休克大鼠模型，藥物組造模前30 min采用內(nèi)毒素吸附劑進(jìn)行灌胃。復(fù)蘇后1 h、2 h、4 h、8 h、12 h檢測(cè)所有大鼠血清NO、IL-6、IL-2及內(nèi)毒素水平。結(jié)果：模型組和藥物組血清NO、IL-、IL-2及內(nèi)毒素水平均高于正常對(duì)照組，且模型組高于藥物組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：內(nèi)毒素吸附劑可明顯降低失血性休克模型大鼠血清NO、IL-、IL-2及內(nèi)毒素水平，對(duì)減輕炎性反應(yīng)、減少組織損傷有顯著作用。

內(nèi)毒素吸附劑;失血性休克;一氧化氮;白細(xì)胞介素-6;白細(xì)胞介素-12

失血性休克是指由多種原因如外傷、消化性潰瘍出血、婦產(chǎn)科疾病等引起大量失血造成的休克，如果不能及時(shí)有效的治療，可引起全身炎癥反應(yīng)或多器官功能綜合征，甚至導(dǎo)致死亡[1]。失血性休克可造成各組織器官灌注不足，缺血缺氧的狀態(tài)會(huì)引起各組織器官功能障礙及免疫損傷，而腸道是對(duì)缺血反應(yīng)最敏感的器官，在失血性休克發(fā)生后，腸道最早出現(xiàn)損傷、最晚得到修復(fù)。腸道功能障礙可引起菌群移位、腸道內(nèi)毒素逸出，引起全身感染和內(nèi)毒素血癥，最終發(fā)展為多器官功能衰竭[2-4]。因此，對(duì)感染的控制及內(nèi)毒素的清除是降低失血性休克危害的關(guān)鍵。一氧化氮(nitric oxide，NO)具有細(xì)胞毒性作用，過(guò)量的NO可抑制相關(guān)抗氧化酶的活性，引起細(xì)胞氧化凋亡。失血性休克發(fā)生時(shí)，炎癥細(xì)胞受到應(yīng)激刺激活化，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)及白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)均為在失血性休克炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞炎癥因子。IL-6可誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞活化、增殖，參與機(jī)體免疫應(yīng)答，促進(jìn)炎性反應(yīng)發(fā)生；IL-12是樹突狀細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子之一，可促使T細(xì)胞活化，激發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)[5]。因此，本研究通過(guò)建立失血性休克大鼠模型，并檢測(cè)其復(fù)蘇后血清NO、IL-、IL-2及內(nèi)毒素水平，探討內(nèi)毒素吸附劑對(duì)失血性休克大鼠的影響。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)成年SD大鼠(購(gòu)買自南京君科生物工程有限公司)50只，雌雄各半，周齡(6.0±1.5)周，體重(225±25)g。將所有大鼠分籠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由活動(dòng)與進(jìn)食，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，控制室溫在(24±2)℃，室內(nèi)濕度控制在50%～55%，晝夜周期為12 h。

1.2方法

1.2.1造模及實(shí)驗(yàn)方法所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只、模型組20只、藥物組20只。模型組和藥物組采用腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉，麻醉成功后取仰臥位，固定于37℃的恒溫板上，雙側(cè)腹股溝去毛、消毒，暴露股動(dòng)、靜脈，右側(cè)股動(dòng)脈放置導(dǎo)管，連接Medlab-u/2cs生物信號(hào)采集系統(tǒng)持續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠的平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)，注入500 IU/kg的肝素鈉；60 min后，左側(cè)股動(dòng)脈放血，15 min內(nèi)將大鼠的MAP降至40 mmHg后停止放血，維持血壓；60 min后經(jīng)股靜脈緩慢回輸含有乳酸林格氏液的失血，20 min內(nèi)輸完，復(fù)蘇后縫合血管及傷口，造成大鼠創(chuàng)傷-失血性休克模型。正常對(duì)照組與模型組行相同的手術(shù)操作，但不放血。藥物組在造模前30 min，給予內(nèi)毒素吸附劑溶液3 mL灌胃，內(nèi)毒素吸附劑溶液由1 mg多粘菌素B+10 mg維生素B6+0.3 g思密達(dá)溶于3 mL生理鹽水中制成。

1.2.2血清指標(biāo)采集分別于復(fù)蘇后1 h、2 h、4 h、8 h、12 h采集所有大鼠靜脈血，分離血清，采用硝酸還原酶法進(jìn)行血清NO水平檢測(cè)；酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定IL-6、IL-12水平；分光光度法測(cè)定血清內(nèi)毒素水平。所有操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1復(fù)蘇后3組大鼠血清中NO水平比較

復(fù)蘇后，模型組和藥物組大鼠血清NO水平均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，在1～12 h內(nèi)，模型組血清NO水平持續(xù)緩慢升高，藥物組血清NO水平在1～4 h內(nèi)緩慢升高，8 h、12 h出現(xiàn)下降；復(fù)蘇后1 h、2 h、4 h、8 h、12 h，藥物組血清NO水平均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　3組大鼠血清中NO水平比較

*P<0.05，與對(duì)照組比較；△P<0.05，與模型組比較。

2.2復(fù)蘇后3組大鼠血清中IL-6水平比較

復(fù)蘇后，模型組和藥物組血清IL-6水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，模型組在1～4 h內(nèi)，血清IL-6水平持續(xù)上升，4 h后出現(xiàn)緩慢下降，藥物組血清IL-6水平在2 h內(nèi)緩慢上升，2 h之后下降；復(fù)蘇后1～12 h，藥物組血清IL-6水平均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2　3組大鼠血清中IL-6水平比較

*P<0.05，與對(duì)照組比較；△P<0.05，與模型組比較。

2.3復(fù)蘇后3組大鼠血清中IL-12水平比較

復(fù)蘇后，模型組和藥物組血清IL-12水平均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，模型組在1～4 h的過(guò)程中，血清IL-12水平持續(xù)較大幅度升高，4 h后出現(xiàn)緩慢下降，藥物組血清IL-12水平1～2 h升高，2 h之后出現(xiàn)明顯回落；復(fù)蘇后1～12 h，藥物組血清IL-12水平均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3　3組大鼠血清中IL-12水平比較

*P<0.05，與對(duì)照組比較；△P<0.05，與模型組比較。

2.4復(fù)蘇后3組大鼠血清中內(nèi)毒素水平比較

復(fù)蘇后，模型組和藥物組血清內(nèi)毒素水平均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，模型組在1～12 h的過(guò)程中，血清內(nèi)毒素始終維持在較高水平，藥物組血清內(nèi)毒素水平1～4 h緩慢下降，8 h后迅速下降；復(fù)蘇后1～12 h，藥物組血清內(nèi)毒素水平均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4　3組大鼠血清中內(nèi)毒素水平比較±s，pg/mL)

*P<0.05，與對(duì)照組比較；△P<0.05，與模型組比較。

3　討論

近年來(lái)，隨著社會(huì)工業(yè)化程度越來(lái)越高、機(jī)械化程度不斷提升，伴隨著交通運(yùn)輸?shù)刃袠I(yè)的發(fā)展，由機(jī)械傷害、交通意外造成的外傷逐漸增多。研究[6]認(rèn)為，至2020年全世界因外傷直接或間接導(dǎo)致的死亡人數(shù)將達(dá)840萬(wàn)左右，而其中一半患者死因?yàn)橥鈧鸬氖а孕菘?。失血性休克的發(fā)生通常會(huì)引起機(jī)體發(fā)生復(fù)雜的免疫應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫紊亂及炎癥反應(yīng)，若不能及時(shí)控制，最終會(huì)危及生命[7]。而全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生與大量失血后腸道屏障功能減弱、腸道細(xì)菌移位、大量?jī)?nèi)毒素被釋放入血并擴(kuò)散至全身各組織器官有關(guān)；復(fù)蘇后腸道黏膜易出現(xiàn)缺血再灌注損傷，黏膜通透性增加使組織損傷加重，刺激大量炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)缺血再灌注刺激自由基生成活化，促進(jìn)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步加劇腸黏膜損傷[8-9]。因此，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，及時(shí)清除內(nèi)毒素，是降低失血性休克危害的重點(diǎn)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組及藥物組血清NO水平均明顯高于正常對(duì)照組，且藥物組明顯低于模型組。NO是一種內(nèi)源性的血管舒張物質(zhì)，當(dāng)其體內(nèi)含量過(guò)高時(shí)，腎上腺素、去甲腎上腺素以及血管緊張素等會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)性低下，引起低血壓；缺血再灌注后，組織會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基，氧自由基可與NO迅速反應(yīng)生成更具細(xì)胞毒性的自由基，如過(guò)氧化亞硝基等，在休克再灌注損傷的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步損害細(xì)胞功能[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組復(fù)蘇后血清NO水平持續(xù)緩慢升高，而藥物組則在1～4 h內(nèi)緩慢升高，8 h、12 h出現(xiàn)下降，說(shuō)明內(nèi)毒素吸附劑可有效降低體內(nèi)NO含量，減少其對(duì)細(xì)胞功能的損害。

IL-6和IL-12均為重要的炎性因子。IL-6具有多種生物活性，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化及免疫防御、誘導(dǎo)急性期炎性反應(yīng)發(fā)生，對(duì)IL-6濃度的監(jiān)測(cè)可靈敏地反映出機(jī)體組織損傷程度[11]。IL-12是目前已知能增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(natural killer，NK)殺傷活性的最強(qiáng)細(xì)胞因子，還促使T細(xì)胞向T輔助細(xì)胞轉(zhuǎn)化，激活機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)[12]。研究[13]證實(shí)IL-12水平可確切反應(yīng)機(jī)體免疫水平，隨著失血性休克復(fù)蘇后缺血再灌注損傷，機(jī)體炎癥高反應(yīng)期IL-12水平也隨之升高。因此，IL-6和IL-12的水平變化均是對(duì)炎性反應(yīng)程度的重要反應(yīng)，內(nèi)毒素吸附劑的治療，可明顯改善機(jī)體炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷。

內(nèi)毒素是一種脂多糖成分，存在于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中，對(duì)機(jī)體具有細(xì)胞毒性。人體對(duì)內(nèi)毒素極其敏感，微量?jī)?nèi)毒素即可引起發(fā)熱、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等，還可加重炎癥反應(yīng)，作用于小血管可引起微循環(huán)障礙，加重休克。內(nèi)毒素吸附劑可利用配基對(duì)內(nèi)毒素較高的選擇吸附作用，達(dá)到有效清除腸道及血液中內(nèi)毒素的作用[14]。本研究選用內(nèi)毒素吸附劑可殺滅細(xì)菌，吸附內(nèi)毒素，保護(hù)腸黏膜，減少缺血再灌注損傷。多粘菌素B為多肽類抗菌素，可殺滅革蘭氏陰性菌；維生素B6可維持細(xì)胞正常代謝，并具有解毒功效；思密達(dá)顆粒小，具有良好的附著力，可對(duì)腸黏膜表面起到保護(hù)作用。

本研究通過(guò)對(duì)50例失血性休克大鼠進(jìn)行觀察，證實(shí)了內(nèi)毒素吸附劑可明顯降低失血性休克模型大鼠血清NO、IL-6、IL-12及內(nèi)毒素水平，對(duì)減輕炎性反應(yīng)、減少組織損傷有顯著作用。在下一步研究中，將進(jìn)行分子機(jī)制方面研究，為本研究所反映的現(xiàn)象做出進(jìn)一步論證和分析。

[1]馮洋,尹文.創(chuàng)傷失血性休克限制性液體復(fù)蘇的研究進(jìn)展[J].中國(guó)急救醫(yī)學(xué),2012,32(6):542-545.

[2]張婧婧,王焱林,覃兆軍.丙酮酸鹽腹腔復(fù)蘇對(duì)失血性休克大鼠腸道損傷的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志,2013,33(11):1393-1396.

[3]沈璟,王鵬飛,王斌,等.限制性液體復(fù)蘇對(duì)失血性休克大鼠腸損傷的影響[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2014,21(6):676-681.

[4]黃其健,張良成.鹽酸戊乙奎醚減輕大鼠創(chuàng)傷失血性休克后腸道黏膜的損傷[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,47(5):297-300.

[5]白鵬舉.參附對(duì)大鼠失血性休克炎癥因子的抑制作用[D].山西醫(yī)科大學(xué),2013.

[6]Levy G,Fishman J E,Xu D,etal.Vagal nerve stimulation modulates gut injury and lung permeability in trauma-hemorrhagic shock[J].J Trauma Acute Care Surg,2012,73(2):338-342.

[7]耿智隆,趙峰,曹虹,等.高滲鹽羥乙基淀粉溶液伍用己酮可可堿對(duì)重度失血性休克大鼠早期腸組織氧化應(yīng)激損傷的影響[J].西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2015,36(7):424-428.

[8]李楊,王新穎,李寧,等.ω-3 多不飽和脂肪酸對(duì)失血性休克復(fù)蘇后大鼠炎癥反應(yīng)抑制作用[J].外科理論與實(shí)踐, 2012,17(2):120-124.

[9]謝俊然,胡旭明, 趙錦寧, 等. 限制性液體復(fù)蘇對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠全身炎性反應(yīng)的影響, 與非限制性液體復(fù)蘇法比較[J]. 中華麻醉學(xué)雜志, 2013, 33(9): 1125-1130.

[10]黃莉萍, 余艷紅,盛超,等.限制性液體復(fù)蘇產(chǎn)兔失血性休克對(duì)腸缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(9):1530-1533.

[11]王麗,王華偉,張煥利,等.復(fù)方丹參對(duì)失血性休克大鼠早期炎癥反應(yīng)影響的研究[J].空軍總醫(yī)院學(xué)報(bào),2008,24(2):92-94.

[12]王堯,方國(guó)恩,錢寶華,等.失血性休克豬輸注不同劑量游離血紅蛋白后血清白細(xì)胞介素-12及γ-干擾素的含量變化及意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2008,25(12):1589-1590.

[13]李國(guó)前,陳淑增,王杰華,等.瑞舒伐他汀對(duì)腦缺血再灌注后白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-12的影響[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2015,31(9):744-746.

[14]Kozar RA,Peng Z,Zhang R,etal.Plasma restoration of endothelial glycocalyx in a rodent model of hemorrhagic shock[J].Anesth Analg,2011,112(6):1289.

(學(xué)術(shù)編輯：楊小霖)

Influence of endotoxin adsorbent on the levels of NO,IL-6 and IL-12 in hemorrhagic shock rats

LIU Hai,ZHAO Jian-qiu,PENG Xiao-jing,LIU Yang,LIU Bing-bing,CAI Li-song

(DepartmentofAnesthesiology,KailuanGeneralHospital,Kailuan063000,Hebei,China)

Objective：To explore the influence of endotoxin adsorbent on the levels of nitric oxide (NO)，interleukin-6 (IL-6) and interleukin-2 (IL-12) level in hemorrhagic shock rats.Methods：Fifty adult SD rats were selected and randomly divided into control group (10 cases),model group (20 cases) and drug group (20 cases).The model of hemorrhagic shock rats model was established in the model group and drug group of Endotoxin adsorbent was given by intragastric administration in the drug group 30 min before the model was established.The levels of NO,IL-,IL-2 and endotoxin were tested 1 h,2 h,4 h,8 h and 12 h after recovery.Results：The levels of NO,IL-,IL-2 and endotoxin were higher both in the model group and drug group than those in the control group(P<0.05).The levels of NO,IL-,IL-2 and endotoxin in the model group were significantly higher than those in the drug group (P<0.05).Conclusion：Endotoxin adsorbent can significantly reduce the serum levels of NO,IL-,IL-2 and endotoxin in rats with hemorrhagic shock,which has a significant effect on the reduction of inflammatory response and tissue damage.

Endotoxin adsorbent;Hemorrhagic shock;Nitric oxide;Interleukin-6;Interleukin-2

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.017

河北省2014年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(ZD20140064)

2016-01-28

劉海(1984-)，男，碩士，主治醫(yī)師。E-mail：tsliuhai123@163.com

時(shí)間：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.034.html

1005-3697(2016)03-0348-04

R614

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