黃　峰，李　莉，吳德玲，王　莉，王桐生

(1.安徽省亳州市人民醫(yī)院藥劑科，安徽 亳州　236800；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽 合肥　230038；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科技處，安徽 合肥　230012；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷臨床學(xué)院，安徽 合肥　230038)

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五子衍宗丸對少弱精子癥模型大鼠睪丸組織Catsper1蛋白及其mRNA表達(dá)影響

黃峰1，李莉2，吳德玲3，王莉4，王桐生2

(1.安徽省亳州市人民醫(yī)院藥劑科，安徽 亳州236800；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽 合肥230038；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科技處，安徽 合肥230012；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷臨床學(xué)院，安徽 合肥230038)

目的通過檢測大鼠睪丸組織Catsper1蛋白及其mRNA表達(dá)水平，探討五子衍宗丸治療少弱精子癥的作用機(jī)制。方法將體質(zhì)量200～220 g的雄性SD大鼠隨機(jī)分成正常組，模型組，生精膠囊組，五子衍宗丸低劑量、中劑量、高劑量組。采用連續(xù)灌服雷公藤多苷8周的方法復(fù)制少弱精子癥模型，模型復(fù)制成功后連續(xù)給藥4周。采用Western blot法測定Catsper1蛋白含量，采用熒光定量PCR法測定Catsper1 mRNA表達(dá)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測睪丸組織中cAMP含量。結(jié)果生精膠囊和高劑量五子衍宗丸能明顯提高模型大鼠睪丸組織中降低的cAMP含量以及升高睪丸組織中降低的Catsper1蛋白及其mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論促進(jìn)Catsper1蛋白表達(dá)并參與cAMP-Ca2+正反饋可能是五子衍宗丸提高精子質(zhì)量的機(jī)制之一。

五子衍宗丸；少弱精子癥；Catsper1蛋白；cAMP

五子衍宗丸始載于明朝張時徹的《攝生眾妙方》，由五味子、菟絲子、覆盆子、枸杞子、車前子組成，是補(bǔ)腎填精的經(jīng)典方劑，廣泛用于男性生殖系統(tǒng)疾病的治療。課題組前期研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，該方藥能明顯增加精子胞漿Ca2+含量，顯著改善少弱精子癥模型大鼠的精子質(zhì)量。Catsper1是最早被發(fā)現(xiàn)并命名的精子特異性鈣通道，其特異地表達(dá)于睪丸和精子，在精子的活化、頂體反應(yīng)等一系列生理功能及雄性生殖功能等方面均具有重要的作用[3]。因此，本研究以Catsper1為研究對象，觀察五子衍宗丸對其在少弱精子癥模型大鼠睪丸組織中表達(dá)的影響，以期探討該方藥治療少弱精子癥的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵。

1　材料

1.1動物雄性SD大鼠(SPF級)，體質(zhì)量200～220 g，由安徽省實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2011-002號。

1.2藥物五子衍宗丸：北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠生產(chǎn)，每次6 g，每日2次，批號 15035211。雷公藤多苷：每片10 mg，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號 150602；生精膠囊：貴州省遵義廖元和堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，每粒0.4 g，每次4粒，每日3次，批號 20150504。

1.3試劑Trizol提取劑：Invitrogen公司生產(chǎn)，批號 90802；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit)，Thermo公司生產(chǎn)，批號 00221108；兔抗鼠Catsper1多克隆抗體：Bioss公司生產(chǎn)，批號 bs-2986R；兔抗山羊IgG：購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號 ZB2301；β-actin：購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號 TA-09；ECL超敏發(fā)光試劑盒：Thermo公司生產(chǎn)，批號 34094；DL2000 DNA Marker：TakaRa公司生產(chǎn)，批號 B7301A；環(huán)磷酸腺苷(cAMP) ELISA 檢測試劑盒(大鼠)：上海滬峰生物科技有限公司生產(chǎn)，批號 E-14592；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4儀器EPS300型電泳儀、VE-186型轉(zhuǎn)膜儀：Tanon公司生產(chǎn)；RT-600型酶標(biāo)儀：雷杜公司生產(chǎn)；K960型普通PCR儀：杭州晶格科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；PIKOREAL 96型熒光定量PCR儀：Thermo公司生產(chǎn)。

2　方法

2.1動物分組及給藥取雄性大鼠60只，將其隨機(jī)分成正常組，模型組，生精膠囊組(陽性組，1.6 g/kg)，五子衍宗丸低劑量(1.0 g/kg，相當(dāng)于成人臨床用量的5倍)、中劑量(2.0 g/kg)、高劑量(4.0 g/kg)組，每組10只。除正常組外，其他各組動物每日灌服雷公藤多苷30 mg/kg(用0.5% CMC-Na制成混懸液)，連續(xù)灌服8周，復(fù)制大鼠少弱精子癥模型[1]。從模型復(fù)制第5周開始，各給藥組動物按劑量灌胃給藥，正常組、模型組動物給予等容量蒸餾水，給藥容積為10 mL/kg，給藥連續(xù)4周，末次給藥后30 min，用3%水合氯醛麻醉、處理動物，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

2.2睪丸組織Catsper1蛋白含量測定剪取約100 mg睪丸組織，加入RIPA細(xì)胞裂解液(內(nèi)含1 mmol/L PMSF)1 mL進(jìn)行裂解。12 000 r/min離心10 min，收集上清液，在10% SDS-PAGE凝膠中電泳分離、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，立即將蛋白膜放置到Western洗滌液中漂洗5 min。加入Western封閉液(5%脫脂奶粉)，在搖床上緩慢搖動2 h，進(jìn)行室溫封閉。加入1∶200稀釋的Catsper1多克隆抗體一抗，緩慢搖動，4 ℃孵育過夜。加入洗滌液(TBST)進(jìn)行洗滌，每次10 min，共洗滌3次。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(按照1∶50 000比例用二抗稀釋液稀釋)。室溫封閉2 h，加入洗滌液(TBST)進(jìn)行洗滌，每次10 min，共洗滌3次。使用ECL發(fā)光試劑盒檢測蛋白，采用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，圖片灰度值采用Image J軟件進(jìn)行分析。

2.3熒光定量采用PCR檢測睪丸組織Catsper1 mRNA表達(dá)。

2.3.1總RNA提取取睪丸組織50～100 mg，剪碎，液氮研磨，加入1 mL TRIzol勻漿，按試劑盒說明提取總RNA。

2.3.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取1 μg總RNA，1 μL的10 μmol/L Oligo(dT)、DEPC水補(bǔ)足至12 μL，輕輕混勻，點(diǎn)動離心。PCR儀上加熱(65 ℃)5 min，立即冰浴3 min。然后加入4.0 μL的5倍反應(yīng)緩沖液-10 mmol/L三磷酸脫氧核苷混合物2 μL、1 μL的RibolockTM核糖核酸酶抑制劑、RevertAidTMM-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，總反應(yīng)體積為20 μL。混勻，輕輕點(diǎn)離。42 ℃孵育混合物 60 min，70 ℃加熱5 min終止反應(yīng)。上述反應(yīng)液即為cDNA。-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)鼠Catsper1引物：上游5′-GTTGCTGGACGACTCTTTGA-3′，下游5′-CCGTTGCTTCTCTGTCATGT-3′，產(chǎn)物長度為130 bp；β-actin引物：上游5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，產(chǎn)物長度為150 bp?？偡磻?yīng)體系：2倍SYBR Green 熒光染料混合物5 μL，上下游引物(終濃度為10 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，無 RNase水2 μL，共10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、2 min，1個循環(huán)；按95 ℃、5 s，退火延伸60 ℃、10 s，共40個循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。采用相對定量研究分析方法，按2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

2.4睪丸組織cAMP含量測定取適量睪丸組織，按1∶9加入生理鹽水勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液。按試劑盒說明，采用ELISA法檢測cAMP含量。

3　結(jié)果

3.1五子衍宗丸對少弱精子癥模型大鼠睪丸組織Catsper1蛋白含量及其mRNA表達(dá)水平的影響模型復(fù)制8周后，模型組大鼠睪丸組織中Catsper1蛋白含量及其mRNA表達(dá)水平明顯下降，與正常組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。連續(xù)給藥4周，各給藥組均能提高Catsper1蛋白及其mRNA表達(dá)水平，其中生精膠囊組與五子衍宗丸中、高劑量組有明顯作用，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和表1。

注：1.正常組；2.模型組；3.生精膠囊組；4.五子衍宗丸低劑量組；5.五子衍宗丸中劑量組；6.五子衍宗丸高劑量組。

圖1　五子衍宗丸對少弱精子癥模型大鼠睪丸組織Catsper1蛋白表達(dá)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05。

3.2五子衍宗丸對少弱精子癥模型大鼠睪丸組織cAMP含量的影響模型復(fù)制8周后，各組大鼠睪丸組織cAMP含量明顯下降；連續(xù)給藥4周，五子衍宗丸組均能提高cAMP含量，其中高劑量組作用明顯，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　五子衍宗丸對少弱精子癥模型大鼠睪丸組織cAMP含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05。

4　討論

少弱精子癥是臨床男科的疑難病癥，大約占男性不育癥的46%[4]，其發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為影響社會和諧和總體生活質(zhì)量的社會問題。中醫(yī)無少弱精子癥病名，常將其歸屬于“精少”“精寒”“精薄”“精冷”等范疇。其病因病機(jī)較為復(fù)雜，醫(yī)家對該病癥的認(rèn)識多樣，但大多認(rèn)為其病機(jī)以腎虛為本，涉及肝脾，并與濕、熱、瘀、毒、蟲(感染)等有關(guān)。治療上以補(bǔ)腎填精為基本大法，并充分運(yùn)用辨證論治的原則，注重個體化治療，取得了良好的治療效果。五子衍宗丸是治療少弱精子癥的經(jīng)典方劑和基本方劑，方中菟絲子溫腎益精，枸杞子滋腎填精，共為君藥；五味子益氣補(bǔ)虛、強(qiáng)陰澀精，覆盆子不燥不凝，溫腎固精，共為臣藥；車前子清肝肺風(fēng)熱，導(dǎo)膀胱水邪，利水而不動氣，作為佐藥。數(shù)藥配伍，不涼不燥，達(dá)到補(bǔ)腎填精、疏利腎氣、種嗣衍宗的功效。

Ca2+作為第二信使，與精子形態(tài)和運(yùn)動能力密切相關(guān)，在精子的各個生理階段發(fā)揮著重要作用，是精子質(zhì)量的重要標(biāo)志之一。研究[2,5]表明，少弱精子癥模型大鼠精子胞漿Ca2+含量顯著下降，并出現(xiàn)鈣離子失穩(wěn)態(tài)，Ca2+通道阻滯劑在體外可導(dǎo)致精子運(yùn)動能力可逆性下降。由此可見，精子運(yùn)動與Ca2+濃度密切關(guān)聯(lián)，游離的Ca2+在精子運(yùn)動中起著關(guān)鍵性作用。

Catsper蛋白為電壓依賴性門控鈣離子通道，是目前公認(rèn)的哺乳動物精子細(xì)胞上最重要的陽離子通道[6]，在精子運(yùn)動、精子超活化和受精過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，Catsper1缺失的小鼠其精子基本無前向運(yùn)動，超活化運(yùn)動缺失，穿過透明帶的能力喪失，導(dǎo)致不育[7]。在高活力人精子中Catsper1蛋白的表達(dá)水平顯著高于低活力人精子中表達(dá)水平，少弱精子癥患者精子活率以及a級精子(快速直線前向運(yùn)動精子)+b級精子(直線前向運(yùn)動精子)比例的降低與Catsper1蛋白的表達(dá)水平下降相關(guān)，Catsper1可能成為篩查不育人群病因的新診斷指標(biāo)[8]。在精子趨化、受精過程中，cAMP是重要介質(zhì)，外源性cAMP可升高精子細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，精子的Catsper通道缺失，cAMP誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流的作用消失，給予外源性Catsper蛋白后，cAMP又恢復(fù)對Ca2+濃度的誘導(dǎo)作用。而且Catsper1參與了cAMP-Ca2+正反饋回路，在Catsper1介導(dǎo)下cAMP引起精子中Ca2+濃度增加的同時，cAMP的含量也顯著增加[9]。

本研究表明，少弱精子癥模型大鼠睪丸組織中cAMP含量明顯下降，Catsper1蛋白的表達(dá)顯著降低，提示Catsper1蛋白表達(dá)降低可能是導(dǎo)致精子運(yùn)動能力下降的分子機(jī)制之一。五子衍宗丸能明顯提高少弱精子癥模型大鼠睪丸組織中cAMP含量及Catsper1蛋白的表達(dá)，故推測該方藥改善精子質(zhì)量與促進(jìn)Caspter1表達(dá)并參與cAMP-Ca2+正反饋有關(guān)。

[1]王秋萍，王桐生，龍子江，等.五子衍宗丸對少弱精癥模型大鼠精子質(zhì)量及睪丸組織的影響[J].中成藥，2011,33(10)：1796-1797.

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Effect of Wuzi Yanzong Pill on Protein and mRNA Expression of Catsper1 in Testicular Tissue of Rats with Oligoasthenozoospermia

HUANGFeng1,LILi2,WUDe-ling3,WANGLi4,WANGTong-sheng2

(1.DepartmentofPharmacy,ThePeople’sHospitalofBozhou,AnhuiBozhou236800,China; 2.ClinicalSchoolofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China;3.DepartmentofScienceandTechnology,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China;4.ClinicalCollegeofAcupunctureandOrthopedics,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of action of Wuzi Yanzong Pill in the treatment of oligoasthenozoospermia through the measurement of protein and mRNA expression of Catsper1 in testicular tissue in rats. MethodsMale Sprague-Dawley rats with a body weight of 200-220 g were randomly divided into normal group, model group, Shengjing Capsule group, and low-, medium-, and high-dose Wuzi Yanzong Pill groups. The rat model of oligoasthenozoospermia was established by the treatment with tripterygium glycoside by gavage for 8 consecutive weeks, and after the model was successfully established, the drugs were administered for 4 consecutive weeks. Western blot was used to measure the content of Catsper1 protein, fluorescence quantitative PCR was used to measure the mRNA expression of Catsper1, and enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure the content of cAMP in testicular tissue. ResultsThe Shengjing Capsule group and the high-dose Wuzi Yanzong Pill group showed significant increases in the reduced content of cAMP and the reduced protein and mRNA expression of Catsper1 in the testicular tissue (P<0.05). ConclusionWuzi Yanzong Pill improves the quality of sperms through promoting the expression of Catsper1 and being involved in cAMP-Ca2+positive feedback.

Wuzi Yanzong Pill; Oligoasthenozoospermia; Catsper protein; cAMP

國家自然科學(xué)基金項目(81473674)；安徽中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項目(2015032)

黃峰(1974-)，男，碩士，主管中藥師

王桐生，wtsyl@163.com

R256.56[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.05.021

2016-05-10；編輯：姚實林)