趙　樂，馬利剛，李曉陽，馮衛(wèi)生，鄭曉珂*

( 1. 河南中醫(yī)學院 藥學院，鄭州 450046；2. 呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450046 )

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獨行菜LaMCT基因的克隆、序列分析與原核表達

趙樂1,2，馬利剛1,2，李曉陽1，馮衛(wèi)生1,2，鄭曉珂1,2*

( 1. 河南中醫(yī)學院 藥學院，鄭州 450046；2. 呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450046 )

強心苷作為藥用植物獨行菜(Lepidiumapetalum)的活性成分，其化學和藥理學研究已有良好的基礎，但其生物合成途徑目前仍不清楚。該研究以獨行菜幼苗為材料，通過分析獨行菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設計特異性引物，PCR擴增得到了強心苷生物合成MEP途徑的關(guān)鍵酶2-C-甲基赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(MCT)基因的開放閱讀框(ORF)，命名為LaMCT(Genbank注冊號KT832554)，并進行序列分析和原核表達。序列分析結(jié)果表明：LaMCT基因ORF全長為912 bp，編碼304個氨基酸。亞細胞定位和保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明：LaMCT蛋白位于葉綠體中，不含信號肽，沒有跨膜區(qū)，含有類異戊二烯合成酶保守結(jié)構(gòu)域(isoprenoid synthase domain)。系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明：LaMCT蛋白與擬南芥的MCT蛋白具有94%的序列相似性，親緣關(guān)系較近。通過構(gòu)建pET-32a-LaMCT原核表達載體，成功在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中誘導表達LaMCT重組蛋白，并得到了純化的LaMCT重組蛋白。該研究首次從獨行菜中克隆了LaMCT基因，建立其穩(wěn)定的原核表達體系，為LaMCT蛋白抗體的制備以及研究LaMCT基因在獨行菜強心苷類化合物生物合成途徑中的功能奠定了基礎。

獨行菜, MCT, 基因克隆, 序列分析, 原核表達

獨行菜(Lepidiumapetalum)是十字花科獨行菜屬植物，其干燥成熟種子是我國傳統(tǒng)中藥北葶藶子，具有瀉肺平喘、利水消腫的功效(李紅偉等，2013)。目前，已從獨行菜中分離得到多種化合物如強心苷類、硫苷類、黃酮類、生物堿類等，其中強心苷類化合物具有強心、保護心肌和改善心血管功能等作用，是獨行菜重要的藥效物質(zhì)基礎之一(周喜丹等，2014)。對獨行菜強心苷類化合物在化學和藥理學方面的研究已有良好的基礎，但對其生物合成途徑及相關(guān)功能基因的研究目前較少，所以開展強心苷類化合物生物合成途徑的研究具有重要意義。

對獨行菜中分離得到的強心苷類化合進行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其屬于植物甾醇類，植物甾醇和三萜結(jié)構(gòu)類似，在生物體內(nèi)是由鯊烯通過不同方式環(huán)化而成，即通過甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway，MVA pathway)和甲基赤蘚醇磷酸途徑(methylerythritol phosphate pathway，MEP pathway)衍生而來(張長波等，2007)。在植物中，MVA途徑存在于細胞質(zhì)中，MEP途徑存在于質(zhì)體中(Eisenreich et al，2004)，異戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)是溝通兩條代謝途徑的中間體，IPP在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶的作用下可以部分轉(zhuǎn)化為二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)，DMAPP是IPP的雙鍵異構(gòu)體，IPP和DMAPP再經(jīng)過催化可以生成各種復雜的萜類化合物和植物甾醇(Capell and Christou 2004)。IPP和DMAPP可以在酶催化下生成法呢基焦磷酸(FPP)，F(xiàn)PP是三萜類化合物生物合成的前體物，F(xiàn)PP在鯊烯合成酶作用下生成鯊烯，經(jīng)鯊烯環(huán)氧酶催化生成環(huán)氧化鯊烯，形成三萜類化合物和植物甾醇的骨架(陳建，趙德剛，2005)。MEP途徑中，2-C-甲基赤蘚醇-4-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶(2-C-methylerythritol-4-phosphate cytidylyltransferase，MCT)，在CTP的參與下催化底物2-C-甲基赤蘚醇-4-磷酸(2-C-methylerythritol-4- phosphate，MEP)生成4-焦磷酸胞苷-2-C-甲基赤蘚醇(4-diphosphocytidyl-2C-methylerythritol，CDP- ME)，MCT是強心苷類化合物生物合成MEP途徑的第3個關(guān)鍵酶(Ma et al，2012; Rohdich et al，2000)。

通過分析本實驗室前期獲得的獨行菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)多個參與MEP途徑的基因。本研究首次從獨行菜中克隆了MEP途徑第三步反應的關(guān)鍵酶MCT基因的ORF，命名為LaMCT，然后對LaMCT基因編碼的蛋白質(zhì)進行生物信息學分析，構(gòu)建了pET-32a-LaMCT原核表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中成功表達了LaMCT重組蛋白，通過Ni2+親和層析得到了純化的LaMCT重組蛋白，這為進一步研究LaMCT基因在獨行菜強心苷類化合物生物合成途徑中的功能奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1 材料與試劑

獨行菜種子采自河南省伏牛山區(qū)，經(jīng)河南中醫(yī)學院藥學院董誠明教授和謝小龍博士鑒定為十字花科獨行菜屬獨行菜(Lepidiumapetalum)的成熟種子，種植于植物培養(yǎng)箱中，光照強度為3 000 lx，在16 h、23 ℃光照，8 h、20 ℃黑暗，70%相對濕度條件下培養(yǎng)。種子萌發(fā)長出4片真葉后，轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)罐中，用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，每個培養(yǎng)罐中培養(yǎng)4顆獨行菜幼苗，每隔3 d更換1次營養(yǎng)液，培養(yǎng)60 d后，采其幼苗葉片作為供試材料。

植物總RNA提取試劑盒、RNase-Free DNase I、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自北京天根公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript II Reverse Transcriptase和大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α和BL21 (DE3) 菌株購自北京全式金公司；ExTaq酶、限制性核酸內(nèi)切酶(EcoR I、XhoI)、T4DNA連接酶、pMD19-T vector購自Takara公司；引物合成、樣品測序由北京三博遠志公司完成。

1.2 LaMCT基因的克隆

取100 mg獨行菜幼苗葉片在液氮中迅速研磨成粉末，按照植物總RNA提取試劑盒說明書，提取得到獨行菜葉片的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，用NanoDrop 2000在260 nm/280 nm波長下測定總RNA的純度和濃度。以提取的總RNA為模板，以oligo (dT)18primer為反轉(zhuǎn)錄引物，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

根據(jù)本實驗室前期獲得的獨行菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中LaMCT基因的序列信息，用Primer 5設計一對LaMCT基因編碼區(qū)的特異性引物，正向引物：LaMCT-Exp-F (5′- CGGAATTCATGGCTATGCTTC AA-3′，下劃線部分為EcoR I酶切位點)；反向引物：LaMCT-Exp-R (5′- CCGCTCGAGTCATGAGTCCAT GCT -3′，下劃線部分為XhoI酶切位點)。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR反應，PCR反應條件：95 ℃、2 min；95 ℃、10 s，52.4 ℃、15 s，72 ℃、1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化回收，純化的PCR產(chǎn)物與pMD19-T vector連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，經(jīng)菌液PCR和電泳檢測后，挑取陽性克隆送北京三博公司測序。

1.3 LaMCT基因編碼蛋白的序列分析

用DNAMAN軟件對LaMCT基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行預測，使用ExPASy Protemics Server提供的在線工具ProtParam (http://web.expasy.org/ protparam/)預測其相對分子量與理論等電點，使用InterPro Scan (http://www.ebi.ac.uk/ interpro/)進行LaMCT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預測，使用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)進行三維同源建模，使用TargetP 1.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) 分析LaMCT蛋白的亞細胞定位，SignalP 4.1 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析LaMCT蛋白是否含有信號肽，使用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行跨膜區(qū)預測，用ClustalW 軟件與其他植物MCT蛋白的氨基酸序列進行比對后，使用MEGA 4軟件的相鄰連接法(neighbor-joining)和泊松模型(poission model)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，bootstrap檢驗的重復次數(shù)為1 000次(Tamura et al，2007)。

1.4 LaMCT原核表達載體的構(gòu)建與誘導表達

用EcoR I和XhoI分別對原核表達載體pET-32a和測序正確的pMD19-T-LaMCT質(zhì)粒進行雙酶切，切膠回收載體片段和目的基因片段，用T4DNA連接酶將載體片段和目的基因片段在16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株，均勻涂布在LB平板上(含氨芐青霉素)進行篩選，挑取單克隆經(jīng)菌落PCR和雙酶切鑒定后，挑選陽性克隆送北京三博公司測序。將測序正確的單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素)，在37 ℃、220 rpm條件下培養(yǎng)過夜，第二天按照1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素)，繼續(xù)在37 ℃、220 r·min-1條件下培養(yǎng)，當OD600達到0.6時，加入IPTG，IPTG終濃度為0.4 mmol·L-1，繼續(xù)在28 ℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)8 h，誘導LaMCT重組蛋白的表達，然后用SDS-PAGE進行檢測。

1.5 LaMCT重組蛋白的純化

根據(jù)LaMCT重組蛋白的誘導表達條件，擴大培養(yǎng)體積，在大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中大量表達LaMCT重組蛋白，通過離心獲得菌體，用PBS (pH 7.4)重懸菌體，然后用超聲裂解菌體直到菌液變清，大腸桿菌裂解液在4 ℃，12 000 ×g離心20 min，離心完成后，取上清用0.45 μm濾膜過濾，利用Ni2+親和層析，采用Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare)樹脂進行純化，然后用含有不同咪唑濃度的洗脫緩沖液進行梯度洗脫(咪唑濃度為50、100、200、300和500 mmol·L-1)，洗脫得到的樣品用SDS-PAGE電泳進行檢測，收集只有單一目的條帶的洗脫樣品，用透析袋透析收集的洗脫樣品，透析后用超濾管濃縮樣品，采用Bradford法對樣品溶液的蛋白含量進行測定，樣品經(jīng)真空冷凍干燥后，保存于-70 ℃。

2　結(jié)果與分析

2.1 LaMCT基因的克隆

通過分析本實驗室前期獲得的獨行菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)多個參與MEP途徑的基因，其中有一個注釋為MCT的轉(zhuǎn)錄本，長度為1 111 bp，將基因序列提交到NCBI ORF Finder分析，發(fā)現(xiàn)其包含一個完整的ORF，長度為912 bp，根據(jù)該基因ORF序列設計特異性引物LaMCT-Exp-F和LaMCT-Exp-R，PCR擴增得到1條900 bp左右的片段，電泳結(jié)果如圖1所示，與預期大小相符，進行測序后得到獨行菜LaMCT基因的編碼序列，大小為912 bp，編碼304個氨基酸(圖2)，序列信息已提交到NCBI Genbank，登錄號為KT832554。

2.2 LaMCT基因編碼蛋白的序列分析

利用DNAMAN軟件預測LaMCT基因編碼304個氨基酸(圖2)，利用ExPASy Proteomics Server的在線工具Protparam對其編碼蛋白的理化性質(zhì)進行預測分析，推測LaMCT蛋白的分子式為C1518H2456N398O450S12，分子量：33.87 kD，等電點pI：9.15；正電殘基(Arg+Lys)：40，負電殘基(Asp+Glu)：38，不穩(wěn)定指數(shù)為40.37。這說明LaMCT蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。

圖 1　PCR擴增LaMCT基因　M. DL2000 DNA marker；1. LaMCT基因PCR擴增產(chǎn)物。Fig. 1　PCR amplification of LaMCT gene　M. DL2000 DNA marker; 1. PCR product of LaMCT gene.

利用InterPro Scan分析LaMCT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示LaMCT蛋白含有類異戊二烯合成酶(isoprenoid synthase domain)保守結(jié)構(gòu)域，分別位于氨基酸序列的81～299位(2-C-甲基赤蘚醇-4-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶，IPR001228)和79～299位(核苷酸-二磷酸-糖轉(zhuǎn)移酶，IPR029044)，屬于MCT蛋白家族成員。

根據(jù)SignalP 4.1預測，LaMCT蛋白不含信號肽，TargetP 1.1預測，顯示LaMCT蛋白可能定位于葉綠體，TMHMM預測該蛋白不含跨膜域。用PredictProtein對LaMCT蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果顯示在該蛋白中α-螺旋占25.41%，β-折疊占18.81%，無規(guī)則卷曲占55.78%。以擬南芥位于葉綠體的2-C-甲基赤蘚醇-4-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶(AtMCT，PDB ID：2yc3)為模板，用SWISS-MODEL預測LaMCT蛋白的三維結(jié)構(gòu)，LaMCT蛋白與AtMCT蛋白的序列相似度為93.83%，在第77～301位氨基酸建模，模型覆蓋率為75%，從預測的三維模型中可以看出，LaMCT蛋白可能以同源二聚體的形式發(fā)揮作用(圖3)。

將LaMCT蛋白的氨基酸序列提交到NCBI網(wǎng)站，通過blastp對非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(nr)進行比對。結(jié)果表明：LaMCT蛋白與擬南芥的定位于葉綠體的MCT蛋白(1W77A)序列相似性最高，達94%。從blastp的比對結(jié)果中選取與LaMCT蛋白質(zhì)相似性較高、來源于其他植物的20條MCT蛋白質(zhì)序列，包括藥用植物丹參、黃芪、銀杏等，模式植物擬南芥、水稻、玉米等，以及苔蘚植物和蕨類植物中完成基因組測序的小立碗蘚和卷柏等繪制系統(tǒng)進化樹(圖4)。從圖4可以看出，LaMCT蛋白與同為十字花科植物的擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtMCT蛋白處于同一分支上，親緣關(guān)系較近，與長春花、丹參、黃芪、亞洲棉、葡萄、大豆等植物聚為一類，都屬于被子植物中的雙子葉植物；水稻、小米、玉米和高粱等禾本科植物聚為一類，屬于被子植物中的單子葉植物；銀杏、北美云杉和產(chǎn)生紫杉醇的曼地亞紅豆杉，聚為一類，屬于裸子植物；小立碗蘚和江南卷柏在生物進化上較為原始，聚為一類，分別屬于苔蘚植物和蕨類植物。

2.3 LaMCT原核表達載體的構(gòu)建

用EcoR I和XhoI分別對原核表達載體pET-32a和測序正確的pMD19-T-LaMCT質(zhì)粒進行雙酶切，切膠回收載體片段和目的基因片段，利用重組DNA技術(shù)，構(gòu)建LaMCT基因的原核表達載體pET-32a-LaMCT，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，挑取單克隆經(jīng)菌落PCR鑒定無誤后，提取質(zhì)粒，用EcoR I和XhoI對重組質(zhì)粒pET-32a-LaMCT進行雙酶切檢測，酶切結(jié)果顯示有900 bp左右的目的基因條帶和6 000 bp左右的載體條帶(圖5)，說明LaMCT基因片段已插入到原核表達載體pET-32a中。將菌落PCR和雙酶切鑒定正確的單克隆送公司測序，測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET-32a-LaMCT中LaMCT基因的序列與目的基因LaMCT序列一致，未發(fā)生堿基突變或移碼突變，表明已成功構(gòu)建了LaMCT基因的原核表達載體。

2.4 LaMCT重組蛋白的原核表達與純化

挑取測序正確的大腸桿菌BL21(DE3)單克隆，振蕩培養(yǎng)，當大腸桿菌生長至OD600到0.6時，在0.4 mmol·L-1IPTG、28 ℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)8 h，誘導LaMCT重組蛋白的表達，誘導完成后提取大腸桿菌總蛋白進行SDS-PAGE分析。pET-32a-LaMCT重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中表達時，表達的LaMCT重組蛋白包含pET-32a載體的標簽序列(Trx-Tag，His-Tag和S-Tag)，總分子量為50.42 kDa。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在約50 kDa處出現(xiàn)目的蛋白條帶，與預測的LaMCT重組蛋白分子量符合，而含有空載體pET-32a的大腸桿菌對照樣品，在50 kDa處沒有目的條帶出現(xiàn)(圖6)。結(jié)果表明LaMCT重組蛋白成功在大腸桿菌BL21(DE3)中表達。

圖 2　LaMCT基因開放閱讀框序列及對應的氨基酸序列Fig. 2　Open reading frame of LaMCT gene cDNA

圖 3　LaMCT蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測Fig. 3　Prediction of three-dimensional structure of LaMCT protein

根據(jù)LaMCT重組蛋白的誘導條件，將LaMCT重組蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中大量表達，收集菌體，用超聲裂解菌體，裂解液經(jīng)離心取上清，利用Ni2+親和層析，采用Ni Sepharose 6 Fast Flow樹脂純化目的蛋白，最終得到純化的LaMCT重組蛋白(圖6)，用Bradford法測得純化蛋白的濃度為1.25 mg·mL-1。

3　討論

獨行菜作為中醫(yī)臨床常用的重要中藥，其所含的強心苷類化合物在化學和藥理學方面的研究已有良好的基礎，而關(guān)于強心苷類化合物生物合成途徑及相關(guān)功能基因方面的研究較少，馬利剛等(2015)首次從獨行菜中克隆得到了二萜類化合物生物合成途徑的關(guān)鍵酶牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPS)基因，并對LaGGPS基因進行了生物信息學分析和原核表達。本研究從獨行菜幼苗的葉片中克隆得到了LaMCT基因，通過保守結(jié)構(gòu)域預測發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白的氨基酸序列含有類異戊二烯合成酶(isoprenoid synthase domain)保守結(jié)構(gòu)域(Rohdich et al，2000)，通過氨基酸序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)LaMCT蛋白與其他植物MEP途徑中MCT蛋白的序列高度同源，屬于MCT蛋白家族成員，表明LaMCT為獨行菜強心苷類化合物生物合成MEP途徑的關(guān)鍵酶，具有重要的研究意義(Gabrielsen et al，2006)。在植物中，第一個MCT基因是從擬南芥中克隆得到，利用RNAi技術(shù)，通過構(gòu)建AtMCT基因的RNAi載體，降低擬南芥中AtMCT基因的表達量，結(jié)果導致轉(zhuǎn)基因擬南芥中光合色素和貝殼杉烯(赤霉素的前體物)的含量都顯著下降(李莉等，2008; Rohdich et al，2000)，后來MCT基因陸續(xù)在藥用植物杜仲(劉慧敏等，2014)、曼地亞紅豆杉 (劉力宏等，2009)、丹參(Ma et al，2012)中被克隆，研究了MCT基因在不同組織中的表達情況，并初步進行了功能研究。

圖 4　LaMCT蛋白與其他物種MCT蛋白的系統(tǒng)進化樹分析　登錄號在物種名稱后，節(jié)點上的數(shù)值為通過bootstrap檢驗次數(shù)的百分數(shù)。Fig. 4　Phylogenetic tree of LaMCT protein and MCT proteins from other species　Accession numbers are showed after the name of species, bootstrap values of the nodes represent the percentage drawn from the bootstrap test.

圖 5　原核表達載體pET-32a-LaMCT的雙酶切鑒定M. DL2000 DNA marker；1. EcoR I和Xho I雙酶切。Fig. 5　Identification of prokaryotic expression vector pET-32a-LaMCT with double digestion　M. DL2000 DNA marker; 1. Double digestion results by EcoR I and Xho I.

圖 6　重組LaMCT蛋白的原核表達與純化　M. 蛋白分子量標準；C. 含pET-32a空載體的E. coli菌株作為對照；1. IPTG誘導的含pET- 32a- LaMCT質(zhì)粒的E. coli菌株；2. 純化的LaMCT重組蛋白。箭頭顯示為LaMCT重組蛋白。Fig. 6　Prokaryotic expression and purification of recombinant LaMCT protein　M. Protein marker; C. E. coli containing pET-32a used as control; 1. E. coli containg pET-32a- LaMCT under IPTG inducement; 2. The purified recombinant LaMCT protein. The arrows show the recombinant LaMCT proteins.

強心苷類化合物作為植物甾醇的一種，具有強心、保護心肌和改善心血管功能等作用，但是在獨行菜中強心苷類化合物的含量很低，不能滿足臨床需求，所以如何提高獨行菜中強心苷類化合物的含量具有重要的研究意義。近年來隨著對植物次生代謝途徑(如甾醇類化合物、丹參酮和紫杉醇等生物合成途徑)及其關(guān)鍵酶基因研究的深入，越來越多關(guān)鍵酶基因被克隆，功能被闡明，通過基因工程和合成生物學的方式對藥用植物進行遺傳改良，提高藥用植物體內(nèi)甾醇類化合物、丹參酮和紫杉醇的產(chǎn)量，已成為最有發(fā)展?jié)摿Φ漠a(chǎn)業(yè)之一。本研究首次從獨行菜幼苗的葉片中克隆了MCT基因，通過構(gòu)建原核表達載體pET-32a-LaMCT，成功在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中誘導表達出LaMCT重組蛋白，并且目的蛋白表達量較高，pET-32a載體(含有Trx-Tag、S-Tag標簽)以及大腸桿菌BL21(DE3)菌株可以增加細胞質(zhì)中表達的外源重組蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，幫助蛋白質(zhì)的折疊，提高外源重組蛋白的可溶性，利用pET-32a載體表達的外源重組蛋白N端帶有6個His-Tag標簽，方便純化重組蛋白(Rosano and Ceccarelli，2014)，所以采用Ni2+親和層析的方法得到純化的LaMCT重組蛋白，為下一步LaMCT蛋白抗體的制備以及研究LaMCT基因在獨行菜強心苷類化合物生物合成途徑中的功能奠定了基礎，研究結(jié)果將有助于深入認識獨行菜強心苷類化合物生物合成途徑及其調(diào)控機制，填補獨行菜在功能基因研究方面的空白，有助于加速藥用植物優(yōu)良品種選育，為今后對獨行菜進行遺傳改良提供候選基因。

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Cloning, sequence analysis and prokaryotic expression ofLaMCTgene fromLepidiumapetalum

ZHAO Le1,2, MA Li-Gang1,2, Li Xiao-Yang1, FENG Wei-Sheng1,2, ZHENG Xiao-Ke1,2*

( 1. School of Pharmacy, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China; 2. CollaborativeInnovationCenterforRespiratoryDiseaseDiagnosisandTreatment&ChineseMedicineDevelopmentofHenanProvince, Zhengzhou 450046, China )

The active components ofLepidiumapetalum, cardiac glycosides have been well studied both chemically and pharmacologically, but little is known about the cardiac glycosides biosynthesis pathway. Using cultivated seedlings as material, the transcriptome data ofLepidiumapetalum, designing specific primers and using PCR method, an open reading frame(ORF) of key enzyme 2-C-methylerythritol-4-phosphate cytidylyltransferase (MCT) gene which involved in MEP pathway was isolated and named asLaMCT(GenBank accession no. KT832554). The sequence analysis and prokaryotic expression were also performed. Sequence analysis showed thatLaMCThas an ORF of 912 bp, which encoded a protein of 304 amino acid residues. Subcelluar localization and conserved domain analysis indicated that LaMCT protein located in chloroplast had no signal peptide and transmembrane domain, but had a isoprenoid synthase conserved domain. Phylogenetic analysis revealed that LaMCT protein showed the highest homology, 94% similarity, with MCT protein fromArabidopsisthaliana. Through the construction of pET-32a-LaMCTvector, the recombinant LaMCT protein was successfully expressed inEscherichiacoliBL21 (DE3) cells. Finally, the recombinant LaMCT protein was purified through Ni2+affinity chromatography. TheLaMCTgene was cloned fromL.apetalum, and the stable prokaryotic expression system of pET-32a-LaMCTwas constructed. This study will provide some basic information for the further antibody preparation of LaMCT protein and would be helpful in functional research ofLaMCTgene involved in cardiac glycosides biosynthesis pathway.

Lepidiumapetalum, MCT, gene cloning, sequence analysis, prokaryotic expression

10.11931/guihaia.gxzw201510007

2015-11-29

2016-03-14

國家重點基礎研究發(fā)展計劃“973”項目(2013CB531802)；河南中醫(yī)學院博士科研基金(BSJJ2011-07)[Supported by National Program on Key Basic Research Project (2013CB531802); Doctoral Research Fund of Henan Chinese Medicine (BSJJ2011-07)]。

趙樂(1983-)，男，河南周口人，博士，講師，主要從事藥用植物分子生物學研究，(E-mail) zhaole1983@126.com。

鄭曉珂，博士，教授，博士生導師，主要從事中藥活性成分及作用機制研究，(E-mail) zhengxk.2006@163.com。

Q943.2

A

1000-3142(2016)10-1225-08

趙樂，馬利剛，李曉陽，等. 獨行菜LaMCT基因的克隆、序列分析與原核表達 [J]. 廣西植物，2016，36(10):1225-1231

ZHAO L, MA LG, Li XY，et al. Cloning, sequence analysis and prokaryotic expression ofLaMCTgene fromLepidiumapetalum[J]. Guihaia，2016，36(10):1225-1231