Bedelkhan Almagul， 任 浩， 章 婷， 鄭婕施， 韓肖飛， 蔣冬花

浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004

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紫色紅曲霉Mp-24高產(chǎn)Monacolin K發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化

Bedelkhan Almagul， 任 浩， 章 婷， 鄭婕施， 韓肖飛， 蔣冬花*

浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004

將單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與響應(yīng)面法相結(jié)合，對高產(chǎn)Monacolin K的紫色紅曲霉Mp-24菌株進(jìn)行發(fā)酵工藝條件優(yōu)化。通過搖瓶發(fā)酵對碳源、氮源、碳源含量、氮源含量、培養(yǎng)時(shí)間等進(jìn)行單因素優(yōu)化，確定Mp-24菌株搖瓶發(fā)酵適宜條件：乳糖為碳源、酵母膏為氮源、碳源含量7%、氮源含量2%、培養(yǎng)時(shí)間12 d，Monacolin K產(chǎn)量為167 mg/L。應(yīng)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)化發(fā)酵條件，結(jié)果顯示最佳發(fā)酵工藝條件為：碳源(乳糖)8%，氮源(酵母膏)3%，培養(yǎng)時(shí)間11 d，在此條件下Monacolin K的含量達(dá)到247.8 mg/L，比優(yōu)化前提高1.5倍。

紫色紅曲霉； Monacolin K； 發(fā)酵工藝； 應(yīng)面優(yōu)化

莫納可林K(Monacolin K)是控制膽固醇合成的抑制劑，是紅曲霉菌種的次級代謝產(chǎn)物；它能抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶(EC1.1.1.34)在膽固醇生物合成中轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸[1]。Monacolin K已經(jīng)被描述為降低血清膽固醇含量的最有效的一類藥物，并已報(bào)道可以減少心血管疾病和冠狀動脈疾病患者的死亡率[2]。與傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵法相比，液態(tài)發(fā)酵法具有規(guī)模大、自動化程度高、人力成本低及生產(chǎn)過程中可以控制雜菌染菌的顯著優(yōu)點(diǎn)，近年來國內(nèi)在 Monacolin K的研究和生產(chǎn)取得了一些進(jìn)展，但是生產(chǎn)水平仍較低[3]，目前Monacolin K市場價(jià)格居高不下也源于此。因此，如何提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量是目前國內(nèi)外相關(guān)科研工作者解決的重要問題。響應(yīng)面法(response surface methodology，RSM)可用于優(yōu)化培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件[4,5]，提升發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量；響應(yīng)面法中的Box-Benhken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)已廣泛地應(yīng)用于發(fā)酵工藝優(yōu)化，其中包括 Monacolin K的液態(tài)發(fā)酵工藝[6,7]。本文利用響應(yīng)面中的Box-Benhken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，回歸分析法對紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)Mp-24菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)Mp-24菌株(以下稱Mp-24菌株)：為本實(shí)驗(yàn)室前期從紅曲米中篩選到的高產(chǎn)Monacolin K的優(yōu)良菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基[8]

PDA培養(yǎng)基(%)：馬鈴薯20、葡萄糖2、瓊脂1.5,pH 5.5～6.0。用于Mp-24菌株的常規(guī)培養(yǎng)和活化。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(%)：麥芽汁2、瓊脂2、蔗糖2、蛋白胨1,pH 5.5～6.0。用于Mp-24菌株的常規(guī)培養(yǎng)。

種子培養(yǎng)液(%)：葡萄糖6、蛋白胨2、NaNO30.2、MgSO4.7H2O 0.1、KH2PO40.2,pH 5.5～6.0。用于Mp-24菌株的種子培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)液(%)：乳糖7、酵母膏2、NaNO30.2、MgSO4.7H2O 0.1、KH2PO40.2，pH 5.5。用于Mp-24菌株的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Mp-24菌株的培養(yǎng)[9]

菌株的活化培養(yǎng)：將所保存的菌種接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫活化培養(yǎng)6 d～7 d。再將PDA培養(yǎng)基上的菌種轉(zhuǎn)接到麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d～8 d。

菌株的種子液培養(yǎng)：500 mL三角瓶裝200 mL種子培養(yǎng)液，將在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d～8 d的菌落用打孔的方法取4個(gè)菌餅(直徑0.6 cm)接入種子培養(yǎng)液中，26 ℃、100 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)4 d，用作種子液。

菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)：250 mL 三角瓶裝100 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，將種子液按5%的體積接種到發(fā)酵培養(yǎng)液中，26 ℃、180 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)12 d。

這個(gè)設(shè)備利用晶體管取代開關(guān)。與上述的裝置一樣，開啟和關(guān)閉電壓用來檢測傳感器的工況。與利用開關(guān)的裝置一樣，由發(fā)動機(jī)ECU提供一個(gè)5V電壓給傳感器，當(dāng)晶體管打開或關(guān)閉時(shí)會產(chǎn)生端子電壓的變化，ECU使用端子電壓的變化來檢測傳感器的工況。另外，有些裝置使用12V的電源。

1.2.2 Monacolin K含量測定

(1)樣品處理：取發(fā)酵液1 mL，煮沸10 min，4 ℃，8 000 r/min離心10 min，上清液用HPLC法檢測Monacolin K產(chǎn)量[10]。

(2)高效液相色譜法測定Monacolin K含量[11]：配制梯度濃度的Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品用下述色譜條件測定產(chǎn)量并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜條件：Agilent TC-C18液相色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)，A溶液為乙腈(0.45 μm有機(jī)相濾膜過濾)，B溶液為pH 2.5的磷酸溶液(0.45 μm水相濾膜過濾)。檢測波長λ=237 nm，流速1 mL/min，流動相為乙腈∶磷酸緩沖液(pH 2.5)=75∶25，進(jìn)樣體積20 μL，柱溫27 ℃。得出相關(guān)系數(shù)高的標(biāo)準(zhǔn)曲線，HPLC法檢測Monacolin K的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=58.61x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，符合要求(圖1)。發(fā)酵上清液用相同的色譜條件測定Monacolin K產(chǎn)量。

圖1 Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 單因素對Monacolin K產(chǎn)量影響的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

Mp-24菌株26 ℃、180 r/min液體培養(yǎng)12 d，探討培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件對Mp-24菌株產(chǎn)Monacolin K的影響。① 碳源：葡萄糖、甘油、乳糖和蔗糖；② 氮源：黃豆粉、玉米粉、蛋白胨、酵母膏、硝酸鈉和硫酸銨；③碳源含量：3%、4%、5%、6%、7%和8%；④氮源含量：1%、2%、3%、4%和5%；⑤ 培養(yǎng)時(shí)間：6 d、8 d、10 d、12 d和14 d。

實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，發(fā)酵液用HPLC法檢測Monacolin K產(chǎn)量。

1.2.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇碳源含量(%)，氮源含量(%)，培養(yǎng)時(shí)間(d)等因素作為考察對象，Monacolin K的產(chǎn)量為響應(yīng)值，通過Box-Behnken[12]實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法篩選出產(chǎn)Monacolin K最高的條件因素。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用Stat-Ease Design-Expert 8.0.0中的Box-Bennken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉Mp-42菌株的鑒定

2.1.1 形態(tài)特征

Mp-24紅曲霉菌株在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)10 d的菌落見圖2.A，表面平坦，菌絲短小，絲絨狀，起初大部分呈淺紅色，邊緣呈淡黃色；培養(yǎng)10 d以后顏色變?yōu)樯罴t色，背面無輻射紋(圖2.B)，中間為深紅色，邊緣為橘黃色，菌落直徑達(dá)50 mm；顯微鏡觀察下菌絲光滑，有隔膜(圖2.C)；分生孢子直徑(7～8) μm近球形，單生或鏈狀(圖2.D)；閉囊殼呈球形(圖2.E)，囊內(nèi)孢子可見，直徑(6～8) μm，無色或者淡黃色。

2.1.2 ITS基因序列和系統(tǒng)發(fā)育樹

Mp-24菌株的ITS 基因序列分析結(jié)果見圖3，其長度為556 bp，基于紅曲霉屬ITS序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4，與紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)的相似度最高，為99%。

2.1.3 Mp-24菌株鑒定結(jié)果

圖2 Mp-24菌株的菌落(A，B)、菌絲(C)、分生孢子(D)及閉囊殼和子囊孢子(E)

圖3 Mp-24菌株ITS基因序列(556 bp)

圖4 基于14株紅曲霉屬ITS基因序列建立的

2.2 單因素優(yōu)化Mp-24菌株發(fā)酵條件

以Monacolin K產(chǎn)量為指標(biāo)，經(jīng)單因素優(yōu)化Mp-24菌株適宜的發(fā)酵條件為：碳源為乳糖、氮源為酵母膏、碳源含量7%、氮源含量2%、培養(yǎng)時(shí)間12 d，Monacolin K產(chǎn)量最高為167 mg/L(圖5)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化Mp-24菌株發(fā)酵條件

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中自變量為碳源含量(%)、氮源含量(%)和培養(yǎng)時(shí)間(d)，分別用X1、X2、X3代表，每個(gè)自變量又有低、中、高水平編碼值分別為-1、0、+1，發(fā)酵液中Monacolin K的產(chǎn)量為響應(yīng)值。試驗(yàn)因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子編碼水平與取值表

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

圖5 培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)時(shí)間對Mp-24菌株Monacolin K產(chǎn)生的影響

2.3.2 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用SAS8軟件對表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次線性回歸擬合，得到數(shù)學(xué)模型：

Y1=180.4+12X1+44.13X2-54.38X3-2.50X1X2-8.50X1X3-20.75X2X3+7.18X12-10.57X22-102.07X32

由表3可知，該模型極顯著(P<0.01)，從表可知R2=0.941 7，說明該模型能解釋94%響應(yīng)值的變化，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.866 6，進(jìn)一步說明該模型擬合度較好，失擬合不顯著(P>0.05)，說明二次線性回歸方程高度顯著，對響應(yīng)值能很好的進(jìn)行預(yù)測[14]。一次項(xiàng)X2、X3表現(xiàn)為極顯著，(P<0.01)，說明它們對響應(yīng)值有影響。從響應(yīng)值F值可知，發(fā)酵條件對 Monacolin K質(zhì)量濃度影響因素顯著性順序?yàn)椋号囵B(yǎng)時(shí)間>氮源含量>碳源含量。

2.3.3 響應(yīng)面分析圖

響應(yīng)圖和等高線圖由SAS8.1軟件分析得出，可以直觀反映出各個(gè)因素與響應(yīng)值的交互作用，等高線圖的形狀可以反映出效應(yīng)的強(qiáng)弱，如果高線圖形狀為橢圓形的，則證明自變量之間交互作用顯著，圓形則為相反效應(yīng)[15]。具體的響應(yīng)圖結(jié)果見圖6～8。

從圖6的響應(yīng)面圖與等高線圖中可以看出，當(dāng)固定培養(yǎng)時(shí)間為12 d，在1%～3%的氮源(酵母膏)含量試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，Mp-24菌株中Monacolin K含量隨著碳源(乳糖)濃度的增加呈先較少后增加趨勢，當(dāng)碳源(乳糖)濃度在7.5%～8%時(shí)Monacolin K的濃度為最高。在6%～8%碳源(乳糖)濃度試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，Monacolin K含量隨氮源(酵母膏)濃度的升高而先較少后增加，氮源的最適濃度區(qū)間在2.5%～3%。添加不同碳源與氮源含量從低到高時(shí)，Monacolin K的濃度則先較少后增加，從等高線圖中因素軸向等高線變化密集度可知，氮源含量(%)對Monacolin K的影響高于碳源含量(%)。

表3 回歸方程統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

注:**極顯著(P<0.01); *顯著(0.01

圖6 碳源含量(X1)與氮源含量(X2)之間相互作用的響應(yīng)面和等高線圖

從圖7的響應(yīng)面圖與等高線圖中可以看出，當(dāng)固定氮源(酵母膏)含量為2%，在6%～8%的碳源含量(乳糖)試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，Mp-24菌株中Monacolin K含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈先上升后下降趨勢，最適的培養(yǎng)時(shí)間在11 d～12 d。在10 d～14 d培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，Monacolin K含量隨碳源(乳糖)濃度的升高而先較低后增加，碳源的最適濃度區(qū)間在7.5%～8%。添加不同碳源與不同培養(yǎng)時(shí)間從低到高時(shí)，Monacolin K 的濃度則先上升后下降，從等高線圖中因素軸向等高線變化密集度可知，培養(yǎng)時(shí)間對Monacolin K的影響高于碳源含量。

從圖8的響應(yīng)面圖與等高線圖中可以看出，當(dāng)固定碳源(乳糖)含量為7%，在1%～3%的氮源含量(酵母膏)試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，Mp-24菌株中Monacolin K含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈先上升后下降趨勢，最適的培養(yǎng)時(shí)間在11 d～12 d。在10 d～14 d培養(yǎng)時(shí)間(d)試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，Monacolin K含量隨氮源(酵母膏)含量的增加而先較低后增加，氮源的最適含量區(qū)間在2.5%～3%。添加不同氮源含量與增加培養(yǎng)時(shí)間從低到高時(shí)，Monacolin K 的濃度則先較少后增加，從等高線圖中因素軸向等高線變化密集度可知，培養(yǎng)時(shí)間對Monacolin K的影響高于氮源含量。

圖7 碳源含量(X1)與培養(yǎng)時(shí)間(X3)之間相互作用的響應(yīng)面和等高線圖

圖8 氮源含量(X2)與培養(yǎng)時(shí)間(X3)之間相互作用的響應(yīng)面圖與等高線圖

2.3.4 模型結(jié)論

為確定最佳點(diǎn)，再對數(shù)學(xué)回歸模型求一階偏導(dǎo)，得出優(yōu)化條件：X1=+12﹑X2=+44.13、X3=-54.38，此時(shí)Y1=260。利用編碼公式將上述編碼值轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)際參數(shù)為：碳源含量8%、氮源含量3%、培養(yǎng)時(shí)間11.18 d，考慮實(shí)際操作性，調(diào)整確定優(yōu)化工藝為：碳源含量8 g/mL(100 mL)、氮源含量3 g/mL(100 mL)、培養(yǎng)時(shí)間11 d，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在此條件下發(fā)酵液的Monacolin K 質(zhì)量濃度達(dá)到247.8 mg/L。在本實(shí)驗(yàn)條件下建立數(shù)學(xué)模型準(zhǔn)確可靠，試驗(yàn)實(shí)際值和預(yù)測值擬合度較好。

3 討論與結(jié)論

通過對紅曲霉發(fā)酵過程中各種條件進(jìn)行優(yōu)化，可以促進(jìn) Monacolin K產(chǎn)量的增加。國內(nèi)外學(xué)者在這方面做了較多研究，從發(fā)酵過程中的培養(yǎng)基的組成到培養(yǎng)條件，均有相關(guān)報(bào)道。在培養(yǎng)基的配方上，國內(nèi)外學(xué)者多從碳源、氮源、碳氮含量等因素進(jìn)行研究；在培養(yǎng)條件的優(yōu)化上，從發(fā)酵時(shí)間、初始 pH、搖瓶轉(zhuǎn)數(shù)、裝液量等因素進(jìn)行研究，Monacolin K的產(chǎn)量均有提高。

本實(shí)驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)獲得適宜發(fā)酵條件為：乳糖7%，酵母膏2%，培養(yǎng)時(shí)間12 d，通過單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面法結(jié)合可以進(jìn)一步有效的優(yōu)化Mp-24菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K 的工藝條件。響應(yīng)面優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：乳糖8%、酵母膏3%、培養(yǎng)時(shí)間11 d，在此條件下Monacolin K的質(zhì)量濃度達(dá)到：247.8 mg/L，比優(yōu)化前提高1.5倍。方春玉等[16]的研究結(jié)果：最佳發(fā)酵條件碳源(甘油)為7%，氮源含量(酵母膏)為3%，培養(yǎng)時(shí)間為14 d，Monacolin K 產(chǎn)量達(dá)到了245 mg/L；張朝暉等[17]對1株不產(chǎn)桔霉素的紫色紅曲霉菌株，在2 L的發(fā)酵罐中，利用添加了酵母膏的葡萄糖-甘油培養(yǎng)基，在第13 d的Monacolin K產(chǎn)量可達(dá)104 mg/L。胡文效等[18]對1株紅曲霉菌株MS-12進(jìn)行三次誘變，結(jié)合液態(tài)發(fā)酵各因素的優(yōu)化結(jié)果，當(dāng)碳源為甘油7%+大米粉2%和氮源為0.5%的蛋白胨，培養(yǎng)時(shí)間則為12 d，Monacolin K的質(zhì)量濃度為264.7 mg/L。

本實(shí)驗(yàn)獲得最佳發(fā)酵條件為：碳源(乳糖)含量8%，氮源(酵母膏)含量為3%，培養(yǎng)時(shí)間為11 d，在此條件下得到的Monacolin K的質(zhì)量濃度與方春玉[16]等和胡文效等[18]的研究結(jié)果相接近。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析優(yōu)化發(fā)酵條件獲得最佳發(fā)酵工藝條件為：碳源8%，氮源3%，培養(yǎng)時(shí)間11 d，在此條件下Monacolin K的含量達(dá)到了247.8 mg/L，豐富了Monacolin K生產(chǎn)的菌株資源。

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Optimizing fermentation conditions of high-yielding Monacolin K byMonascuspurpureusstrain Mp-24 using response surface methodology

Bedelkhan Almagul, REN Hao, ZHANG Ting, ZHENG Jie-shi, HAN Xiao-fei, JIANG Dong-hua

College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004

Response surface methodology and single factor experiment were combined to optimize the submerged culture conditions for the production of Monacolin K usingMonascuspurpureusstrain Mp-24. Through analyzing the influence of carbon sources, nitrogen sources, carbon content, nitrogen content and culture time, the results showed that optimal fermentation conditions were as follows: lactose(carbon source), yeast extract(nitrogen source), carbon content of 7%, nitrogen content of 2% and culture time of 12 d. Monacolin K yield was 167 mg/L. After using Box-Behnken central composite design and response surface analysis, the optimum conditions were: carbon (lactose) of 8%, nitrogen (yeast extract) of 3% and culture time of 11 d. Under the optimized conditions, the content of Monacolin K reached 247.8 mg/L. The optimized fermentation conditions resulted in 1.5 times increase of Monacolin K yield in comparison with that of the original conditions.

Monascuspurpureus; Monacolin K; fermentation conditions; response surface methodology

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO. 31270061; NO. 31570013)。

Bedelkhan Almagul(1989～), 女, 哈薩克斯坦人, 在讀研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。

*通訊作者:蔣冬花(1964～)，女，教授。E-mail: jdh@zjnu.cn。