李善姬，杜超，劉敏，張洋婷，時念秋，梁承武

（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

枳椇水提液不同極性萃取組分對乙醇誘導(dǎo)的人體HL7702肝細(xì)胞脂肪變性的影響

李善姬，杜超，劉敏，張洋婷，時念秋，梁承武

（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

探討枳椇水提液不同極性萃取組分對乙醇誘導(dǎo)的人體HL7702肝細(xì)胞脂肪變性的影響。體外培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞株HL7702，設(shè)立空白對照組、乙醇模型組和枳椇不同極性萃取液干預(yù)組，采用MTT法測定細(xì)胞存活率，油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況，檢查細(xì)胞內(nèi)TG、ALT和AST的含量。結(jié)果0.6%乙醇誘導(dǎo)HL7702細(xì)胞24 h成功建立脂肪變性模型。同空白對照組相比，乙醇模型組細(xì)胞內(nèi)TG、ALT和AST含量明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；同模型組比，枳椇乙酸乙酯層萃取液干預(yù)的細(xì)胞TG、ALT和AST含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：具有減輕乙醇細(xì)胞損傷和降低肝細(xì)胞脂肪變性作用的最佳組分是乙酸乙酯萃取層。

酒精性脂肪肝；枳椇；萃取

酒精性脂肪肝病（AFLD）是指長期大量飲酒導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪蓄積量不斷增多，單位面積上有30%的脂肪形成或超過肝濕重5%，就可以稱之為肝細(xì)胞的脂肪變性。一些地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國成人酒精性肝病的患病率在4%左右［1］，并且具有逐年上升的趨勢。因此，酒精性脂肪肝越來越受到人們的關(guān)注。乙醇對肝臟的損傷機制尚未完全闡明，但酒精型肝炎動物模型的試驗結(jié)果和臨床結(jié)果均表明［2］：乙醇及其代謝產(chǎn)物對肝臟的損傷、細(xì)胞因子、免疫因素、自由基和內(nèi)毒素在發(fā)病過程中扮演者不可替代的作用。因此全面清除自由基和內(nèi)毒素可以保護(hù)肝臟免受損傷。

枳椇（Hovenia acerba）為鼠李科，枳椇屬，始載于《唐本草》，自古以來就是一味解酒良藥。動物實驗表明［3-4］，枳椇水提液對急性酒精中毒和酒精性脂肪肝有明顯的治療作用，對各種原因所導(dǎo)致的肝損傷有明確的保護(hù)和促生長作用，且有可能延緩和防止乙醇所致的脂肪肝的形成。目前，國內(nèi)外對枳椇解酒保肝作用的研究主要集中在單一的枳椇水提液干預(yù)動物實驗，對于枳椇水提液解酒保肝的有效成分的研究相對較少。因此，本試驗通過研究枳椇萃取液的不同極性組分對乙醇誘導(dǎo)人體HL7702肝細(xì)胞脂肪變性的影響，為枳椇的解酒保肝活性成分的研究提供初步線索。

1材料與方法

1.1細(xì)胞系人正常肝細(xì)胞株HL7702，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2受試物北枳椇的果實和果梗在75℃條件下水提3次，合并提取液濃縮后，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液濃縮后得到浸膏，進(jìn)一步凍干后得到供試品。

1.3主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、DMSO，購自美國GIBCO公司；MTT，購自美國Sigma公司；甘油三酯測定試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒，購自上海嵐派生物技術(shù)有限公司。

1.4方法

1.4.1乙醇作用濃度的選擇取對數(shù)生長期HL7702細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL，每孔100 μL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞均勻鋪滿孔底，分別加入無水乙醇（終濃度為0.1%、0.3%、0.6%、1.2%、2.4%和3.6%），設(shè)10個平行孔，置于37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。進(jìn)行MTT試驗和油紅O染色試驗。

1.4.2試驗分組根據(jù)MTT結(jié)果選擇0.6%乙醇誘導(dǎo)HL7702細(xì)胞48 h，建立肝細(xì)胞損傷模型。本試驗共分為11組，分別為空白對照組（N）、乙醇模型組（A）、枳椇水提液組（A+H）、枳椇乙酸乙酯層萃取液（A+E）低劑量組、枳椇乙酸乙酯層萃取液（A+E）高劑量組、枳椇石油醚層萃取液（A+P）低劑量組、枳椇石油醚層萃取液（A+P）高劑量組、枳椇正丁醇層萃取液（A+B）低劑量組、枳椇正丁醇層萃取液（A+B）高劑量組、枳椇水層萃取液（A+W）低劑量組、枳椇水層萃取液（A+W）高劑量組。

1.4.3枳椇不同極性提取物對酒精體外誘導(dǎo)的脂肪變性肝細(xì)胞增殖的影響取對數(shù)生長期HL7702細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL，每孔100 μL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞均勻鋪滿孔底，加入終濃度為0.6%的無水乙醇，置于37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。設(shè)10個平行孔，進(jìn)行MTT試驗。

1.4.4細(xì)胞內(nèi)TG、ALT和AST的檢測將處于對數(shù)生長期的HL7702細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，調(diào)細(xì)胞濃度至5×104個/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞生長至80%融合時，用0.6%乙醇進(jìn)行誘導(dǎo)干預(yù)，繼續(xù)孵育48 h后對試驗組給予相應(yīng)劑量的受試物，干預(yù)細(xì)胞48 h。收集細(xì)胞，按照TG、ALT和AST試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 19.0 for Windows統(tǒng)計學(xué)軟件處理。檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組均數(shù)間比較前先進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗，如符合方差齊性，組間比較采用單因素方差分析，處理前后兩組間比較采用配對樣本t檢驗方法，選定P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度乙醇干預(yù)HL7702肝細(xì)胞48 h后MTT檢測結(jié)果由表1可知，當(dāng)乙醇濃度為0.1%、0.3%時，OD值較對照組稍增高，細(xì)胞活性均在100%以上，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)和對照組相比無明顯改變，生長良好；當(dāng)乙醇濃度為0.6%、1.2%時，OD值較對照組稍下降，細(xì)胞形態(tài)稍有增大，生長正常；當(dāng)濃度增至2.4%、3.6%時，OD值下降較明顯，肝細(xì)胞體積明顯增大，懸浮漂起的細(xì)胞增多，細(xì)胞存活率明顯下降。

表1不同濃度乙醇對HL7702肝細(xì)胞增殖的影響（-X±s，n=10）

2.2細(xì)胞油紅O染色結(jié)果選擇乙醇濃度為0.6%和1.2%進(jìn)行細(xì)胞油紅O染色。結(jié)果如中插彩版圖1所示：空白對照組細(xì)胞形態(tài)正常，長勢良好，胞漿內(nèi)無脂滴形成；0.6%乙醇組細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒呈連珠狀排列，界限清楚，均勻分布；1.2%乙醇組細(xì)胞內(nèi)脂滴顆粒較多，但脂滴皺縮、顆粒之間界限模糊，排列雜亂無序，部分細(xì)胞甚至出現(xiàn)胞膜破裂，脫壁細(xì)胞也明顯增多。因此，選用0.6%乙醇作為脂肪性酒精肝造模濃度。見前插彩版圖1。

2.3枳椇不同極性提取物對酒精體外誘導(dǎo)的脂肪變性肝細(xì)胞增殖的影響由表2可知，只有乙酸乙酯層（A+E）組的細(xì)胞活性略高于乙醇模型組（A），其他組別的細(xì)胞活性均低于乙醇模型組（A）。其中，隨著乙酸乙酯劑量的增加，細(xì)胞活性也逐漸增加。由此可以推斷：枳椇乙酸乙酯層具有拮抗酒精的作用，而且其作用強度與劑量成正相關(guān)。

表2枳椇不同極性提取物對酒精誘導(dǎo)的脂肪變性肝細(xì)胞增殖的影響（-X±s，n=10）

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2.4各組細(xì)胞內(nèi)TG含量檢測結(jié)果試驗結(jié)果如表3所示，與正常組（N）相比，乙醇模型組（A）的TG含量明顯增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與乙醇模型組（A）相比，枳椇水提液（A+ H）組和乙酸乙酯層（A+E）組的TG含量均降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中，乙酸乙酯層（A+E）低劑量組和高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明在一定濃度范圍內(nèi)，乙酸乙酯層（A+E）受試物具有降低TG的作用。

表3不同濃度的枳椇不同極性提取物組細(xì)胞TG含量（-X±s，n=10）

2.5細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)ALT、AST檢測結(jié)果由表4可知，乙醇模型組（A）中ALT、AST的泄漏量增加，與正常組（N）相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與乙醇模型組（A）相比，枳椇水提液（A+ H）組和乙酸乙酯層（A+E）組的ALT、AST泄露量有所降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中，乙酸乙酯層（A+E）低劑量組和高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明在一定濃度范圍內(nèi)，乙酸乙酯層（A+E）受試物具有降低ALT、AST的作用。

表4對照組內(nèi)ALT、AST的泄漏量（-X±s，n=5）

3討論

酒精性肝?。ˋLD）是由于長期大量飲酒所致的肝臟疾病。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，飲酒人數(shù)和人均飲酒量呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，酒精濫用和酒精依賴已成為公共衛(wèi)生問題［5］。ALD的防治措施主要有戒酒、中藥治療、應(yīng)用降脂藥物等，目前動物試驗已經(jīng)證實了枳椇水提液具有防治ALD的功效。

本試驗顯示，用0.6%和1.2%干預(yù)時細(xì)胞形態(tài)稍有增大，生長良好，存活率＞80%。與王春暉等［6］研究的乙醇干預(yù)濃度基本一致，可初步選擇0.6%、1.2%的乙醇濃度作為造模濃度。根據(jù)光鏡結(jié)果最終選用0.6%乙醇作為脂肪性酒精肝造模濃度。試驗結(jié)果再次驗證了枳椇水提取液具有解酒保肝的功效，這與郭感恩［7］的研究結(jié)果基本一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，枳椇乙酸乙酯層萃取液對酒精誘導(dǎo)的脂肪變性肝細(xì)胞起防治作用，這與時濤［8］等大鼠試驗結(jié)果相一致。對各組細(xì)胞內(nèi)TG含量、ALT和AST泄漏量的檢測結(jié)果顯示，枳椇乙酸乙酯萃取層具有減輕乙醇肝細(xì)胞損傷和降低肝細(xì)胞脂肪變性作用。此試驗結(jié)果和謝蓉蓉等［9］的體內(nèi)小鼠試驗結(jié)果幾乎一致，充分證實了枳椇乙酸乙酯層萃取液的解酒保肝作用，即使在酒精存在的情況下依舊對肝臟起保護(hù)作用，其中包括可以促進(jìn)酒精誘導(dǎo)的脂肪變性肝細(xì)胞的增殖及減輕酒精引起的脂肪變性。

枳椇乙酸乙酯層萃取液為復(fù)合物質(zhì)，真正發(fā)揮解酒保肝作用的單體成分仍需要我們進(jìn)一步的試驗證實及探討。本試驗結(jié)果為后續(xù)的單體研究提供初步線索。

［1］孫艷，吳陽.酒精性肝病的研究進(jìn)展［J］.吉林大學(xué)學(xué)報，2006，32（4）：733-736.

［2］Hoek J B，Pastorino J G.Ethanol，oxidative stress and cytokine 2 induced liver cell injury［J］.Alcohol，2002，27（1）：63-68.

［3］嵇揚，李俊，楊平.枳椇子對急性酒精中毒的作用［J］.中藥材，2001，24（2）：126-127.

［4］丁靜.枳椇子預(yù)防大鼠酒精性脂肪肝的實驗研究［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，17（3）：156-158.

［5］孫艷，吳陽，劉兵，等.酒精性肝病的研究進(jìn)展［J］.吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2006，32（4）：733-736

［6］王春暉.軟脂酸對酒精體外誘導(dǎo)的脂肪變性肝細(xì)胞的影響［D］.長沙：中南大學(xué)，2011.

［7］郭感恩.枳椇子水提取液對乙醇體外誘導(dǎo)脂肪變L-02細(xì)胞Adipor2基因表達(dá)的影響（D）.長沙：中南大學(xué)，2011.

［8］時濤，陳振德.枳椇子乙酸乙酯提取部位的解酒作用研究［J］.中國藥房，2009，20（18）：1378-1379.

［9］謝蓉蓉，張德志，龐小雄，等.枳椇子乙酸乙酯部位化學(xué)成分的研究［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8（9）：27-28.

Effects of different polar extraction layer of Hovenia acerba on human HL7702 fatty degeneration cells induced by ethanol

LI Shan-ji，DU Chao，LIU Min，ZHANG Yang-ting，SHI Nian-Qiu，LIANG Cheng-wu
（Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

To determine the effects of polar extraction layer of Hovenia acerba at different concentrations on alcohol-induced lipogenesis in HL7702 liver cells.Cultured HL7702 liver cells were divided into eleven groups：blank control group，alcohol induction group，and polar extraction layer of Hovenia acerba intervention groups.Cell proliferation was measured by MTT assay.The accumulation of lipid droplets was observed by light inverted microscopy after red oil-O staining.The levels of TG，ALT and AST were determined using ELISA kits.A model of alcohol-induced steatosis was successfully induced in HL7702 liver cells by incubation with 0.6%ethanol for 24 h.Compared with normal group，ALT，AST and TG were increased in alcohol induction group，and difference was statistically significant（P＜0.05）.Compared with alcohol induction group，the liquid Hovenia dulcis and ethyl acetate extract layer intervention ALT、AST and TG were significant decreased（P＜0.05）.The Ethyl acetate extraction layer can relieve ethanol cell damage and reduce the hepatocyte fatty degeneration in HL7702 fat cell induced by ethanol.

Alcoholic fatty liver；Hovenia acerba；Extraction

LIANG Cheng-wu

R 285

A

0529-6005（2016）08-0056-03

2016-04-13

吉林省衛(wèi)生廳科技項目（2014Z106）

李善姬（1969-），女，副教授，博士，研究方向為活性成分的生理功能與機制，E-mail：shanji@hotmail.com

梁承武，E-mail：medchem@sina.com