王彬，李淑芹，李曉齊，曹紅，王永強，鄭世軍

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，北京海淀100193）

傳染性囊病病毒（IBDV）VP3蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

王彬，李淑芹，李曉齊，曹紅，王永強，鄭世軍

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，北京海淀100193）

為制備抗IBDV VP3蛋白的單克隆抗體，以VP3-His蛋白免疫BALB/c小鼠，經(jīng)4次免疫、融合、亞克隆，篩選出1株能夠穩(wěn)定分泌抗VP3蛋白單克隆抗體的細胞株，命名為4H8F7C10。經(jīng)間接ELISA方法檢測，小鼠的腹水效價為2.05× 106，單克隆抗體的解離常數(shù)（kD）為9.67×10-8，此株抗體亞類為IgG3。通過Western Blot和間接免疫熒光試驗檢測，該株單克隆抗體可以識別IBDV感染DF-1細胞產(chǎn)生的VP3蛋白。初步確定此株單克隆抗體的抗原識別區(qū)位于VP3蛋白N端的第50-90位氨基酸。此株單克隆抗體的制備為IBDV臨床檢測方法的建立以及致病分子機制的研究奠定了基礎(chǔ)。

IBDV；單克隆抗體；VP3蛋白

傳染性囊?。↖BD），是一種危害3～8周齡雛雞的烈性、高度接觸性傳染病，主要侵害腔上囊等淋巴組織。腔上囊的損傷導(dǎo)致免疫抑制，使其他疾病的發(fā)生率明顯升高。IBD往往為突然暴發(fā)，死亡率高達20%～30%，并經(jīng)常發(fā)展為隱性感染。IBD在全世界范圍內(nèi)廣泛傳播。

傳染性囊病病毒（IBDV）屬于雙RNA病毒科雙RNA病毒屬，無囊膜的病毒。該病毒基因組由A、B兩個片段組成［1］。IBDV B片段大約為2 800 bp，編碼VP1蛋白，該蛋白為病毒的RNA聚合酶；A片段大約為3 200 bp，由兩個重疊的開放閱讀框構(gòu)成，較大的ORF編碼pVP2-VP3-VP4多聚蛋白前體，該蛋白前體由VP4蛋白剪切為pVP2、VP3和VP4三個蛋白［2］，pVP2被進一步剪切成VP2和若干個短肽，較小的ORF編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白VP5［3］。

VP3具有腳手架蛋白的作用［4］，在病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)上具有不可替代的功能。在病毒粒子的組裝過程中，與VP1和病毒的雙鏈RNA結(jié)合，招募VP1進入衣殼［5］，包裹著病毒的雙鏈RNA［6］，并且與VP1、病毒雙鏈RNA形成核糖核蛋白復(fù)合體，形成病毒樣粒子。VP3在病毒與宿主細胞相互作用上有一定聯(lián)系，王笑梅等的研究表明，VP3蛋白C端一個氨基酸的突變就可影響病毒的復(fù)制［7］；同時VP3與pVP2、VP4形成的多聚蛋白可以抑制B淋巴細胞的細胞增殖和有絲分裂的刺激［8］；VP3蛋白還可以抑制PKR和elF2α的磷酸化，進而抑制PKR介導(dǎo)的細胞凋亡，并且這種功能的實現(xiàn)是借助VP3蛋白的雙鏈RNA結(jié)合區(qū)［9］；VP3形成的核糖核蛋白復(fù)合體可以借助內(nèi)吞途徑定位于近核區(qū)域，高爾基體在病毒的形成過程中有重要作用［10］。因此，VP3蛋白參與病毒粒子的形成，并在病毒與宿主細胞的相互作用中具有重要的位置，本試驗成功制備了抗VP3蛋白單克隆抗體，為IBDV致病機理的研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌株、毒株、細胞與實驗動物pET-28a-VP3、pGEX-6P-1-VP3質(zhì)粒，DH5α、BL21菌株，雞傳染性貧血癥病毒（CAV）、禽白血病病毒（ALV）、禽呼腸孤病毒（ARV）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒（REV），骨髓瘤細胞SP2/0為本實驗室保存，BALB/c小鼠，購自北京維通麗華實驗動物技術(shù)有限公司；IBDV毒株Lx由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所劉爵研究員饋贈。

1.2主要試劑與儀器限制性內(nèi)切酶、LA Taq酶和DNA連接酶，購自TaKaRa公司；dNTPs，購自CNS公司；山羊抗小鼠IgG二抗，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，購自Hyclone公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT和Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents，均購自Sigma公司；KoDak醫(yī)學(xué)X線顯影機102型，購自美國KoDak公司；Sunrise 96孔酶標(biāo)儀，購自TECAN公司；XDS-1B倒置顯微鏡，購自重慶光學(xué)儀器廠。

1.3抗VP3單克隆抗體的制備用純化得到的VP3-His蛋白免疫小鼠。小鼠血清效價大于1：10 000時，無菌狀態(tài)下取免疫小鼠的脾臟，分離脾細胞與SP2/0細胞融合，隨后進行陽性克隆篩選、亞克?。?1］。

1.4抗VP3單克隆抗體特性鑒定

1.4.1單克隆抗體亞類鑒定按照Sigma公司的Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents鑒定試劑盒說明書進行亞類鑒定。

1.4.2單克隆抗體特異性鑒定以ALV、CIAV、REV、IBDV、ARV感染宿主細胞獲取的總蛋白進行SDS-PAGE電泳，以制備的抗VP3單抗為一抗，進行Western Blot檢測。

1.4.3單克隆抗體親和力鑒定參照文獻［12］進行親和力解離常數(shù)（kD）的測定。

1.4.4Western Blot鑒定將DF-1細胞以1×105/孔接種于24孔板中，待細胞密度達到70%～90%時，以IBDV（MOI=1）接種細胞，并設(shè)置相應(yīng)的陰性對照。24 h后收取細胞裂解總蛋白，進行Western Blot鑒定。

1.4.5間接免疫熒光試驗（IFA）鑒定按照1.4.4所述方法進行病毒感染，并設(shè)置相應(yīng)的陰性對照。培養(yǎng)24 h后，用1%多聚甲醛進行固定和0.2%Triton X-100透化處理，1%BSA封閉后加入抗VP3單克隆抗體作為一抗，以FITC標(biāo)記的IgG為二抗，置于熒光顯微鏡下進行觀察。

1.4.6抗原識別區(qū)分析將VP3基因按150個堿基的間距分別從N端和C端進行截短，構(gòu)建到pEGFP-N1載體上，轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞。收取細胞總蛋白用Western Blot方法鑒定單抗抗原表位識別區(qū)域。

2試驗結(jié)果

2.1單克隆抗體的制備和亞類鑒定小鼠經(jīng)3次免疫，用間接ELISA方法測定小鼠血清效價為1：12 800。加強免疫后，取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0細胞進行融合，經(jīng)過3次亞克隆，獲得1株能穩(wěn)定分泌抗VP3的雜交瘤細胞株，命名為4H8F7G8。將雜交瘤細胞注射到經(jīng)產(chǎn)BALB/c母鼠腹腔內(nèi)制備腹水，間接ELISA測定小鼠腹水效價為2.05×106，用Sigma公司的ELISA亞類鑒定試劑盒檢測表明，此株單克隆抗體的亞類為IgG3。

2.2抗VP3單克隆抗體特異性檢測與親和力鑒定抗VP3單克隆抗體可以識別IBDV VP3蛋白，不識別ALV、REV、ARV感染DF-1細胞，CIAV感染MSB1細胞收取的細胞總蛋白（圖1A），表明獲得的單克隆抗體具有良好的特異性。親和力檢測結(jié)果表明，此株單抗的親和力解離常數(shù)（kD）為9.67×10-8（圖1B），屬于高親和力的單抗。

2.3抗VP3單克隆抗體識別IBDV VP3蛋白用Western Blot方法檢測IBDV感染DF-1細胞（圖2A），試驗結(jié)果表明，該株單克隆抗體能夠特異性識別IBDV病毒感染細胞產(chǎn)生的VP3蛋白；以間接免疫熒光試驗檢測，結(jié)果同樣表明，該株單克隆抗體可以特異性識別IBDV感染DF-1細胞產(chǎn)生的VP3蛋白（圖2B）。以上試驗結(jié)果表明，4H8F7G8株單抗能較好的識別IBDV VP3蛋白。

圖1抗VP3單克隆抗體特異性和親和力測定

圖2單抗4H8F7C10株識別IBDV感染產(chǎn)生的VP3蛋白

2.4單克隆抗體抗原識別區(qū)的確定用抗GFP標(biāo)簽抗體作為一抗，Western Blot檢測表明VP3-GFP截短蛋白均可以表達（圖3B）。以4H8F7G8單克隆抗體為一抗，通過Western Blot分析株抗體識別的抗原表位所在區(qū)域為VP3蛋白N端第50-90位氨基酸（圖3C、3D）。

3討論

傳染性囊病是急性、高度接觸性傳染病，主要引起雞淋巴器官的傷害，尤其是腔上囊的損傷。耐過雞由于免疫器官的損傷，體液免疫和細胞免疫功能下降，引起免疫抑制，造成對其他疾病易感和免疫程序的失敗。傳染性囊病發(fā)病迅速、發(fā)病率高，有明顯的尖峰死亡曲線，5～7 d后隨即康復(fù)；目前傳染性囊病有效的治療方法是在雞發(fā)病初期注射卵黃抗體，減輕癥狀。疾病的早期診斷對于IBD的防控就尤為重要。IBDV編碼5個病毒蛋白，其中VP3蛋白為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，在血清1型病毒中占病毒蛋白的40%［13］。IBDV VP3單克隆抗體的制備為IBDV快速檢測方法的建立提供了有效途徑，同時VP3單克隆抗體也是IBDV致病機理研究的有利工具。

本研究成功制備了1株針對IBDV VP3蛋白的單克隆抗體，通過與CIAV、ALV、REV、ARV等其他禽類病毒的特異性試驗發(fā)現(xiàn)，該株抗體具有良好的特異性。我們在抗原識別區(qū)的確定過程中，分別從VP3蛋白的N端和C端進行截短表達，可以確定單克隆抗體更精確的識別區(qū)，也可以排除一株單克隆抗體在VP3蛋白上有多個識別區(qū)的可能。目前國內(nèi)很多實驗室都已成功制備了VP3單克隆抗體［14-16］，但這些抗體的親和力還不十分明確，不同親和力抗體的生物學(xué)功能是不同的，這就決定了其使用范圍與目的的不同。我們獲得的VP3單克隆抗體為高親和力抗體，這將在IBDV的檢測以及VP3功能研究中得到廣泛應(yīng)用。

圖3單抗抗原表位識別區(qū)分析

綜上所述，本研究成功制備了1株針對IBDV VP3蛋白的單克隆抗體，并對所制備的抗VP3單克隆抗體的亞型、特異性、親和力和抗原表位作了詳細分析，為IBDV致病機理的研究以及快速檢測試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

［1］Azad A A，Barrett S A，F(xiàn)ahey K J.The characterization and molecular cloning of the double-stranded RNA genome of an Australian strain of infectious bursal disease virus［J］.Virology，1985，143（1）：35-44.

［2］Spies U，Muller H，Becht H.Nucleotide sequence of infectious bursal disease virus genome segment A delineates two major open reading frames［J］.Nucleic Acids Res，1989，17（19）：7982.

［3］Mundt E，Beyer J，Muller H.Identification of a novel viral protein in infectious bursal disease virus-infected cells［J］.J Gen Virol，1995，76（Pt 2）：437-443.

［4］Maraver A，O?a A，Abaitua F，et al.The oligomerization domain of VP3，the scaffolding protein of infectious bursal disease virus，plays a critical role in capsid assembly［J］.J Virol，2003，77（11）：6438-6449.

［5］Lombardo E，Maraver A，Castón J R，et al.VP1，the putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal disease virus，forms complexes with the capsid protein VP3，leading to efficient encapsidation into virus-like particles［J］.J Virol，1999，73（8）：6973-6983.

［6］Kochan G，Gonzalez D，Rodriguez J F.Characterization of the RNA-binding activity of VP3，a major structural protein of Infectious bursal disease virus［J］.Arch Virol，2003，148（4）：723-744.

［7］Wang Y，Qi X，Kang Z，et al.A single amino acid in the C-terminus of VP3 protein influences the replication of attenuated infectious bursal disease virus in vitro and in vivo［J］.Antiviral Res，2010，87（2）：223-229.

［8］Peters M A，Lin T L，Wu C C.Infectious bursal disease virus polyprotein expression arrests growth and mitogenic stimulation of B lymphocytes［J］.Arch Virol，2004，149（12）：2413-2426.

［9］Busnadiego，I.Maestre AM，Rodríguez D，et al.The infectious bursal disease virus RNA-binding VP3 polypeptide inhibits PKR-mediated apoptosis［J］.PLoS One，2012，7（10）：e46768.

［10］Delgui，L R，Rodriguez J F，Colombo M I.The endosomal pathway and the Golgi complex are involved in the infectious bursal disease virus life cycle［J］.J Virol，2013，87（16）：8993-9007.

［11］Yokoyama W M.Current protocols in Immunology［M］.JohnWiley& Sonc，Inc，1995：2.5.1-2.6.9.

［12］羅正，劉若塵，鄭世軍.單核增生性李氏桿菌溶血素的原核表達及其單克隆抗體的制備［J］.生物工程學(xué)報，2009，25（10）：1652-1657.

［13］Dobos P，Hill B J，Hallett R，et al.Biophysical and biochemical characterization of five animal viruses with bisegmented doublestranded RNA genomes［J］.J Virol，1979，32（2）：593-605.

［14］胡伯里.傳染性法氏囊病病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2和VP3調(diào)控細胞自噬的分子機制研究［D］.杭州：浙江大學(xué)，2014.

［15］鄧小蕓，高玉龍，高宏雷，等.傳染性腔上囊病病毒VP3蛋白模擬表位的篩選［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2006，36（10）：791-794.

［16］程宇，鄧小蕓，高玉龍，等.抗雞傳染性法氏囊病病毒VP3單克隆抗體制備及抗原表位的初步分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2006，37（12）：1323-1327.

Development and identification of monoclonal antibodies against Infectious Bursal DiseaseVirus（IBDV）VP3

WANG Bin，LI Shu-qin，LI Xiao-qi，CAO Hong，WANG Yong-qiang，ZHENG Shi-jun
（State Key Laboratory of Agrobiotechnology，College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

To develop antibodies against IBDV VP3，BALB/c mice were vaccinated with VP3-His.After four times immunization，fusion，and subcloning，a hybridoma cell clone that stably secreted McAbs against VP3 was obtained and named 4H8F7C10. Antibody titers were 2.05×106as examined by indirect ELISA in ascite fluid of mice inoculated intraperitoneally with monoclonal antibody-producing hybridoma cells.The dissociation constant（kD）of the monoclonal antibody was determined to be 9.67×10-8and the isotype was IgG3.The McAb specifically bound to VP3 in IBDV-infected DF-1 cells was validated by Western Blot and indirect Fluorescence Antibody assay.The epitope in VP3 that was recognized by 4H8F7C10 was located between 50 to 90 aa as demonstrated by Western Blot.The McAb will be useful for the examination of IBDV antigen and to elucidate the molecular mechanism of IBDV infection.

IBDV；monoclonal antibody；VP3

ZHENG Shi-jun

S852.4

A

0529-6005（2016）08-0025-04

2015-06-10

國家自然科學(xué)基金（31430085；31272543）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（NYCYTX-41）

王彬（1988-），男，博士生，主要從事病原與宿主相互作用機制的研究，E-mai：6942362@163.com

鄭世軍，E-mail：sjzheng@cau.edu.cn