陜西省咸陽市第一人民醫(yī)院(咸陽712000)

郝 瑞 張 熊 鄧 睿

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ANXA3 mRNA和Livin mRNA在膽囊癌和膽囊息肉中的表達(dá)及意義

陜西省咸陽市第一人民醫(yī)院(咸陽712000)

郝 瑞 張 熊 鄧 睿

目的：探討膜聯(lián)蛋白A3(ANXA3)mRNA和Livin mRNA 在膽囊癌和膽囊息肉組織中的表達(dá)及意義。方法：收集35例膽囊癌患者(膽囊癌組)和34例膽囊息肉患者(息肉組)的臨床資料,采用RT-PCR技術(shù)檢測組織ANXA3和Livin的表達(dá),觀察兩標(biāo)志物的變化與膽囊癌和膽囊息肉疾病之間的關(guān)系。結(jié)果：膽囊癌組ANXA3 mRNA和Livin mRNA表達(dá)與息肉組比較顯著增高(P<0.01)。膽囊癌組ANXA3 mRNA和Livin mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.617,P<0.01)。膽囊癌組中ANXA3 mRNA和Livin mRNA的表達(dá)量分別和血清CEA、CA19-9及CA50具有相關(guān)性[(r=0.627, 0.593，0.607，P<0.01),(r=0.643, 0.610,0.623,P<0.01)]。結(jié)論：檢測組織ANXA3和Livin的表達(dá)有助于膽囊癌和膽囊息肉疾病的早期鑒別診斷,

膽囊癌是膽道最常見的惡性病變。膽囊息肉樣變是臨床上較常見的一種良性病變,可分為非腫瘤性息肉和腫瘤性息肉,后者中腺瘤性息肉惡變率為1.5%,一直被認(rèn)為是膽囊癌的癌前病變,應(yīng)及時(shí)手術(shù)切除膽囊，所以對膽囊癌和膽囊息肉的鑒別診斷顯得尤為重要[1]。目前B超對于<5mm的息肉診斷率可達(dá)90%以上,但難以定性息肉的性質(zhì)[2]。膜聯(lián)蛋白A3(ANXA3)屬于膜聯(lián)蛋白超家族且是非常重要的一員,近年來有研究顯示,ANXA3可能與多種惡性腫瘤的演進(jìn)有密切相關(guān)性[3]。Livin基因是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員，其可以抑制凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程而阻斷凋亡的發(fā)生,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[4]。本文應(yīng)用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶聯(lián)反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)研究膽囊癌和膽囊息肉樣變組織中ANXA3 mRNA和Livin mRNA表達(dá)狀況,探討其與膽囊癌和膽囊息肉樣變之間的關(guān)系。

對象與方法

1 研究對象 膽囊癌組為2011年3月至2015年3月在本院住院的膽囊癌患者35例,其中男9例,女26例,年齡35～70(平均55±10.7)歲；術(shù)前診斷為膽囊結(jié)石膽囊炎20例,膽囊息肉14例；膽囊結(jié)石患者病史7～26(平均11±3.5)年,主要的癥狀為右上腹痛,且向肩背部放射；膽囊息肉患者病史均在6年以上,其中25例于術(shù)前行MRCP檢查,10例行超聲檢查。35例膽囊癌病理分級：高分化5例、中分化9例、低分化21例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性17例,陽性18例。息肉組為同期本院行膽囊切除的患者,根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果選取腺瘤性息肉患者34例,男12例,女22例,年齡35～67(平均56±11.2)歲；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)等代謝性疾病者；合并肝硬化及膽道梗阻者；近1個(gè)月內(nèi)服用膽酸、非甾體抗炎藥、激素類等影響代謝功能藥物者；B超檢查、術(shù)中及術(shù)后病理提示息肉與結(jié)石并存者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn),所有研究對象已簽署知情同意書。

2 方 法 ①細(xì)胞分離和總RNA的提取：RNA提取采用美國Invitrogen公司產(chǎn)品。采用trizol法提取組織中的總RNA，在分光光度計(jì)上檢測A260/280的比值以驗(yàn)證RNA的純度。②PCR擴(kuò)增：用pfimer5軟件設(shè)計(jì)引物,ANXA3 的引物序列為：正義鏈5’-CAGGCACCCGTGTGGTTGCT-3’,反義鏈 5’-AGGCTGGTGGGGCATCGAAC-3’；擴(kuò)增產(chǎn)物長度205 bp；Livin引物序列為：正義鏈 5‘-ATGGGACCTAAAGACAGTGCC-3’,反義鏈5‘-GCGGCCAGTCATAGAAGGAG-3’；擴(kuò)增產(chǎn)物長度190 bp;β-actin作為內(nèi)參照,引物序列為：正義鏈5’- ACCATGGATGATGATATCGCC-3’, 反義鏈5’-GCCTTGCACATGCCGG-3’, 擴(kuò)增產(chǎn)物長度110bp。反應(yīng)條件：94℃,30s→94℃,30 s→55℃,90 s→72℃,60 s，35個(gè)循環(huán)→72℃,10 min→4℃保存。③基因片段序列測定和分析：使用測序儀對PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定,將測序結(jié)果通過BLAST應(yīng)用軟件與GenBank中的已知序列進(jìn)行同源性比較。④對擴(kuò)增的目的片斷進(jìn)行凝膠電泳,通過紫外光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并記錄,測定各組的cDNA的特異性,ANXA3 mRNA和Livin mRNA表達(dá)量用Ct值變化表示?！鰿t(HVCT)均值-(Xn)Ct,(HVCT)是內(nèi)參照Ct的平均值,Xn表示每個(gè)受試對象的Ct值。miRNA的相對表達(dá)量為2-△ct。⑤采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測兩組患者血清CEA、CA19-9及CA50含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,正態(tài)檢驗(yàn),率比較采用卡方檢驗(yàn)及Fishers精確概率法檢驗(yàn),相對表達(dá)量比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組患者ANXA3 mRNA和Livin mRNA 表達(dá)率和表達(dá)量比較 見表1,2。膽囊癌組兩標(biāo)志物表達(dá)率與息肉組比較明顯增高(P<0.01)。膽囊癌組兩標(biāo)志物表達(dá)量與息肉組比較明顯增高(P<0.01)。

2 兩組血清腫瘤標(biāo)志物檢測結(jié)果比較 見表3。膽囊癌組中的CEA、CA19-9及CA50分別與息肉組比較均增高(P<0.01)。

表1 兩組患者ANXA3 mRNA和Livin mRNA 表達(dá)率比較 (%)

注：與息肉組比較，*P<0.01

表2 兩組患者ANXA3 mRNA和Livin mRNA表達(dá)量比較±s)

注：與息肉組比較，*P<0.01

表3 兩組血清腫瘤標(biāo)志物檢測結(jié)果±s)

注：與息肉組比較，*P<0.01

3 相關(guān)分析 ANXA3 mRNA和Livin mRNA在膽囊癌的表達(dá)量具有相關(guān)性(r=0.617,P<0.01)。膽囊癌組ANXA3 mRNA和Livin mRNA表達(dá)量與血清CEA、CA19-9及CA50水平有明顯相關(guān)性[(r=0.627, 0.593,0.607，P<0.01),(r=0.643, 0.610,0.623,P<0.01)] 。

4 利用ROC曲線來評價(jià)兩項(xiàng)標(biāo)志物的價(jià)值 組織ANXA3和Livin表達(dá)量的AUC分別為(0.873,0.829,P<0.01),聯(lián)合檢測ANXA3和Livin 的AUC為0.953(P<0.01),即組織ANXA3和Livin 在鑒別膽囊癌和膽囊息肉疾病中有診斷意義。

討 論

膜聯(lián)蛋白A在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量較高,ANXA3是ANX超家族中的一員,研究證實(shí),ANXA3的異常表達(dá)與膽囊癌,乳腺癌[5]，肺癌[6]等惡性腫瘤有關(guān)。有研究通過miRNA干擾ANXA3 在膽囊癌細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的增殖能力下降、G1期細(xì)胞阻滯，提示阻滯ANXA3的表達(dá)可以改善膽囊癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[7]。本研究采用RT-PCR技術(shù)通過對膽囊癌和膽囊息肉組織ANXA3的分析發(fā)現(xiàn)膽囊癌組ANXA3表達(dá)高于息肉組(P<0.01)，上述研究表明，ANXA3高表達(dá)可能與膽囊癌關(guān)系密切,并有望成為膽囊癌診斷治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

Livin 是凋亡抑制蛋白家族的重要成員。Livin在正常成人的組織中低表達(dá)或不表達(dá),在多種腫瘤中過度表達(dá)[8]。研究發(fā)現(xiàn)Livin在卵巢癌[9]、肝癌[10]、胰腺癌[11]等腫瘤中過度表達(dá)。采用免疫組織化學(xué)方法檢測Livin在膽囊組織中的表達(dá)顯示膽囊腺癌組織中Livin顯著高于膽囊良性病變組織[12]。本研究顯示Livin在膽囊癌組織中的表達(dá)明顯高于息肉組織(P<0.01)。因此認(rèn)為,檢測Livin可能為以Livin 基因?yàn)榘悬c(diǎn)的膽囊癌基因診斷和治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù),Livin可能作為臨床上鑒別膽囊癌和膽囊息肉的分子標(biāo)志物。

ANXA3 mRNA和Livin mRNA在膽囊癌組織中的表達(dá)量具有正相關(guān)性(P<0.01)，兩標(biāo)志物也與血清CEA、CA19-9及CA50有相關(guān)性,提示兩標(biāo)志物與膽囊癌的發(fā)生，發(fā)展密切相關(guān)。ROC曲線分析結(jié)果也顯示ANXA3和Livin在鑒別膽囊癌和膽囊息肉疾病中有診斷意義,提示檢測兩標(biāo)志物有助于膽囊癌和膽囊息肉疾病的早期鑒別診斷,減少漏檢率,深入研究兩標(biāo)志物在膽囊癌和膽囊息肉疾病中的關(guān)系、作用及其機(jī)制,將為膽囊癌的基因診斷、預(yù)防及治療提供新思路。

[1] 黃永峰,董都選.膽囊息肉123例臨床分析[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2009,38(2)：239-240.

[2] 黃 鵬,趙梅芬,孟凡斌,等.膽囊息肉樣變患者血清中八種結(jié)合膽汁酸含量的分析[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2014,94(40)：3154-3158.

[3] 李 亞,吳正蓉.膜聯(lián)蛋白A3與惡性腫瘤演進(jìn)的關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)綜述,2014,20(14)：2537-2539.

[4] 段文晶,蔣愛梅,段體德,等.siRNA沉默Livin基因?qū)θ橄侔㎝CF-7 細(xì)胞化學(xué)治療增敏作用的研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2014,43(35)：4715-4718.

[5] Zeng C,Ke Z,Song Y,etal.Annexin A3 is associated with a Poor prognosis in breast cancer and participates in the modulation of apoptosis in vitro by aftecting the Bcl-2/Bax balmme．experimental and molecular pathology[J].Exp Mol Pathol,2013,95(1)：23-31．

[6] Liu YF,Xiao ZQ,Li MX,etal.Quantitative proteoille a11alysis reveals annexin A3 as a novel bionmrker in lung adenocarcinoma[J].J Pathol,2009,217(1)：54-64．

[7] 談 鼓,孟海萍,崔培元,等.膽囊良惡性組織中蛋白質(zhì)組差異表達(dá)及膜聯(lián)蛋白A3的功能[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2010,27(7)：879-882.

[8] 薛 棟,趙海霞,常 剛,等.人胰腺癌中Livin及血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)及其臨床意義[J].國際腫瘤學(xué)雜志,2014,41(9)：700-703.

[9] Liu X,Wang A,Gao H,etal.Expression and role of the inhibitor of apoptosis protein livin in chemotherapy sensitivity of ovarian carcinoma[J].Int J Oncol,2012,41：1021-10283 ．

[10] 徐 威,常 宏. 聯(lián)合轉(zhuǎn)染Livin和Survivin shRNA表達(dá)載體對肝癌HepG2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J]．中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展,2013,16(7)：509-514．

[11] 張財(cái)明,季一鳴,朱 敏,等. Livin shRNA 表 達(dá) 載 體 的 構(gòu) 建及在胰腺癌細(xì)胞的效應(yīng)研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2015,37(9)：747-749．

[12] 王峰波,盧綺萍,孫世波,等.Livin、Survivin和細(xì)胞核增殖抗原在膽囊腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2012,29(6)：1105-1107.

(收稿：2016-03-25)

The clinical application of detection of ANXA3mRNA and Livin mRNA in tissues in the diseases with the gallbladder carcinoma and the gallbladder polyps

The First People’s Hospital of Xianyang City(Xianyang 712000)

Hao Rui Zhang Xiong Deng Rui

Objective：To explore the clinical application of detection of ANXA3mRNA and LivinmRNA in tissues in the diseases with the gallbladder carcinoma and the gallbladder polyps.Methods：The serum and clinical data in 35 cases of patients with gallbladder carcinoma (carcinoma group) and 34 cases of patients with gallbladder polyps(polyps group)were collected, used the real-time fluorescent quantitative PCR (Real - time - PCR, rt-pcr) technology to detect the expression of tissue ANXA3 and Livin to observe the changes and the relationship with gallbladder diseases for of the two markers.Results：In the carcinoma group the expression of tissue ANXA3 and Livin respectively with comparision to those in the controls were significantly higher, the differences had statistical significance (P<0.01),and the expression of ANXA3mRNA and LivinmRNA were positively correlated in the carcinoma group(r=0.617,P<0.01),which respectively were relevant with the levels of serum CEA and CA19-9 and CA50 (r=0.627,0.593,0.607,P<0.01), (r=0.643, 0.610, 0.623,P< 0.01).Conclution：Testing the expression of ANXA3 and Livin in tissues can help the gallbladder carcinoma and the gallbladder polyps disease in the early differential diagnosis。

Gallbladder neoplasms Adenomatous polyps Gene expression regulation @ANXA3 @Livin

膽囊腫瘤 腺瘤性息肉 基因表達(dá)調(diào)控 @膜聯(lián)蛋白A3 @Livin基因

R735.8

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.059