陜西省榆林市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科(榆林719000)

樊海燕 劉曉鶯▲

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·臨床檢驗(yàn)·

外周血T細(xì)胞亞群及Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值在乙肝病毒感染者診斷中的價(jià)值

陜西省榆林市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科(榆林719000)

樊海燕 劉曉鶯▲

目的：探討外周血T細(xì)胞亞群及Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值在乙肝病毒感染者診斷中的價(jià)值。方法：選取193例乙肝病毒感染者,包括無癥狀HBV攜帶者47例,急性乙肝42例,慢性乙肝63例,原發(fā)性肝癌41例,同期，選取健康者45例作為正常對(duì)照組。利用流式細(xì)胞儀對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞亞群、Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比,急性乙肝、慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低,而CD8+升高(P<0.05)；與急性乙肝相比,慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低，而CD8+升高(P<0.05)；與慢性乙肝相比,原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低,而CD8+升高(P<0.05)；與正常對(duì)照組相比,慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞和Th17/Treg比值均升高(P<0.05)；與慢性乙肝相比,原發(fā)性肝癌外周血Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞和Th17/Treg比值均升高(P<0.05)；Pearson相關(guān)分析顯示，不同乙肝感染組患者外周血Treg和Th17細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.410,P<0.05),不同組患者外周血CD4+/CD8+比值和Th17/Treg比值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.357,P<0.05)。結(jié)論：隨著乙肝患者病情進(jìn)展,外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低,而CD8+升高,且Th17/Treg比值均升高,外周血T細(xì)胞亞群及Th17/Treg比值監(jiān)測(cè)可為評(píng)估乙肝患者病情及預(yù)后提供參考。

乙型病毒性肝炎(乙肝)在我國(guó)有較高的感染率和發(fā)病率,病程遷延反復(fù),少數(shù)患者進(jìn)展為肝硬化和肝癌，嚴(yán)重危害人類健康[1]。研究表明,乙肝感染后發(fā)病不僅與病毒直接損傷肝細(xì)胞有關(guān),而且機(jī)體細(xì)胞免疫所致的免疫損傷亦是導(dǎo)致肝損傷及病程進(jìn)展的重要原因[2]。T淋巴細(xì)胞作為淋巴細(xì)胞的主要組分,在機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)及免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用,其中,CD3+、CD4+和CD8+是重要的T細(xì)胞亞群,在調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3]。輔助性T細(xì)胞17(Th17)是CD4+T細(xì)胞亞群,可大量產(chǎn)生IL-17,加速和促進(jìn)免疫應(yīng)答反應(yīng),而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)則是具有免疫抑制功能的CD4+T細(xì)胞亞群,可減輕免疫損傷作用[4]。研究表明[5]，Th17和Treg平衡打破是導(dǎo)致多種免疫性疾病發(fā)病的主要因素。本研究嘗試對(duì)乙肝患者外周血T細(xì)胞亞群及Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞比值變化進(jìn)行分析，探討其在乙肝發(fā)病及病程進(jìn)展中的意義，以期為乙肝診斷及防治提供參考。

資料與方法

1 一般資料 選取2013年2月至2015年3月在我院門診及住院治療的乙肝病毒感染者193例,所有患者均符合2010版《慢性乙型肝炎防治指南》中的標(biāo)準(zhǔn)[6],其中,無癥狀HBV攜帶者47例,男32例,女15例,平均年齡38.8±8.6歲；急性乙肝42例,男24例,女18例,平均年齡41.6±12.5歲；慢性乙肝63例,男47例,女16例,平均年齡42.9±13.8歲；原發(fā)性肝癌41例,男27例,女14例,平均年齡47.4±15.2歲。同期,從本院體檢中心選取健康者45例作為正常對(duì)照組,其中,男24例,女21例,平均年齡42.4±12.9歲；排除傳染性疾病及慢性病者、系統(tǒng)性疾病及免疫性疾病者,患者乙肝表面抗原(HBsAg)陰性,且抗丙肝陰性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均行知情同意。

2 主要試劑和儀器 熒光素標(biāo)記抗人CD3/CD4-APC/CD8-PE單克隆抗體復(fù)合試劑購(gòu)自美國(guó)Roche公司，F(xiàn)ITC-抗人CD3抗體、抗人IL-17-PE抗體、PECy7-抗人CD8抗體、抗人CD69抗體、Treg Cocktil、紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，RPMI 1640培養(yǎng)液、莫能霉素、PMA、離子霉素均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，F(xiàn)ACSCalibur 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司。

3 方 法 ①外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)：所有患者均抽取晨起空腹靜脈血6 ml,置于EDTA-K2抗凝管中。取50 μl外周血，將10 μl熒光素標(biāo)記抗人CD3/CD4-APC/CD8-PE單克隆抗體復(fù)合試劑加入,混勻,于室溫下避光25 min,加入 250μl紅細(xì)胞裂解液,混勻,于室溫下避光15 min,加入1 ml PBS液,混勻,于300 g離心力下離心6 min，棄上清，加入1 ml PBS液重懸,再次離心6 min,加入500 μl PBS液重懸,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞亞群百分比。②外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞檢測(cè)：取250 μl全血和250 μl RPMI 1640培養(yǎng)混勻,加入PMA 2.5 μl、離子霉素5 μl和莫能霉素0.8 μl，5% CO2條件下于37℃恒溫箱培養(yǎng)6 h,取培養(yǎng)后100 μl全血，加入20 μl FITC-抗人CD3抗體和5 μl PECy7-抗人CD8抗體,室溫下避光孵育25 min,將紅細(xì)胞裂解液和破膜劑加入后,室溫破膜,用PBS液洗滌3次,加入抗人IL-17-PE抗體20 μl,避光室溫孵育10 min,PBS液洗滌后上機(jī)檢測(cè),設(shè)置同型陰性對(duì)照,獲得Th17細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的比例。取100 μl全血,加入20 μl Treg cooktail,避光孵育20 min,加入紅細(xì)胞裂解液,用PBS液洗滌3次,上機(jī)檢測(cè),設(shè)置同型陰性對(duì)照,獲得Th17細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的比例。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，利用Pearson相關(guān)分析對(duì)變量間相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同組患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化情況 見表1。與正常對(duì)照組相比，HBV攜帶者外周血CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，急性乙肝、慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低，而CD8+升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與急性乙肝相比，慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低，而CD8+升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與慢性乙肝相比，原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低，而CD8+升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同組患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化(%)

注：與正常對(duì)照組相比，aP<0.05；與HBV攜帶者相比，bP<0.05；與急性乙肝相比，cP<0.05；與慢性乙肝相比，dP<0.05

2 不同組患者外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞變化情況 見表2。正常對(duì)照組、HBV攜帶者和急性乙肝外周血Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞和Th17/Treg差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與正常對(duì)照組相比，慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞和Th17/Treg比值均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與慢性乙肝相比，原發(fā)性肝癌外周血Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞和Th17/Treg比值均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同組患者外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞變化±s)

注：與正常對(duì)照組相比，aP<0.05；與HBV攜帶者相比，bP<0.05；與急性乙肝相比，cP<0.05；與慢性乙肝相比，dP<0.05

3 不同變量間相關(guān)性分析 見附圖。Pearson相關(guān)分析顯示，不同乙肝感染組患者外周血Treg和Th17細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.410，P<0.05)，不同組患者外周血CD4+/CD8+比值和Th17/Treg比值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.357，P<0.05)。

討 論

本研究顯示,與正常對(duì)照組相比,急性乙肝、慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低，而CD8+升高，說明在乙肝病程進(jìn)展中T細(xì)胞免疫發(fā)揮重要作用，與乙肝病程轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，隨著乙肝患者病程進(jìn)展,CD3+和CD4+T細(xì)胞比例下降，而CD8+T細(xì)胞比例升高，出現(xiàn)CD4+/CD8+比值倒置，提示機(jī)體免疫功能被打破，免疫功能異?？赡軈⑴c了乙肝感染患者病程進(jìn)展過程[7]。

附圖 不同變量間相關(guān)性分析

Th17細(xì)胞作為抗感染免疫效應(yīng)性T細(xì)胞，在促進(jìn)免疫功能、清除病毒感染中發(fā)揮重要作用，并可通過分泌IL-17調(diào)控機(jī)體炎性反應(yīng)過程[8]，本研究顯示，與正常對(duì)照組相比，慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血Th17細(xì)胞比例升高，說明隨著乙肝患者病程慢性化進(jìn)展，Th17細(xì)胞比例出現(xiàn)上升，可能是隨著乙肝病毒大量復(fù)制，反應(yīng)性的出現(xiàn)Th17細(xì)胞比例升高，以加強(qiáng)機(jī)體免疫作用，同時(shí)，可能參與肝細(xì)胞炎性反應(yīng)加重有關(guān)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[9]。Treg作為具有免疫抑制作用的T細(xì)胞，可通過調(diào)控免疫應(yīng)答強(qiáng)度而減輕對(duì)組織損傷，在自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用，Th17和Treg共同作用在維持機(jī)體正常的免疫功能中發(fā)揮重要作用，這種平衡打破可能是炎性疾病和免疫性疾病發(fā)生的重要原因[10]。本研究顯示，與正常對(duì)照組相比，慢性乙肝和原發(fā)性肝癌外周血Th17細(xì)胞比例均升高，與慢性乙肝相比，原發(fā)性肝癌外周血Th17細(xì)胞比例均升高，說明在乙肝患者病情進(jìn)展中，隨著細(xì)胞免疫的增強(qiáng)，抑制細(xì)胞免疫的作用亦加強(qiáng),以維持機(jī)體免疫平衡,Pearson相關(guān)分析顯示,不同乙肝感染組患者外周血Treg和Th17細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.410，P<0.05),說明隨著病情進(jìn)展,患者體內(nèi)大量HBV病毒復(fù)制,使效應(yīng)性Th17細(xì)胞比例增高,而為了抑制過度免疫,減少免疫過度對(duì)機(jī)體組織的損傷,Treg細(xì)胞反饋性的升高,同時(shí),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)是調(diào)控Th17和Treg細(xì)胞分化的重要因子,有研究指出[10]，乙肝患者體內(nèi)TGF-β水平隨病情進(jìn)展而增加。推測(cè)本研究中患者外周血Treg和Th17細(xì)胞升高亦可能與TGF-β升高有關(guān)。本研究亦顯示，在患者病情進(jìn)展中，Th17細(xì)胞升高幅度較Treg細(xì)胞更為明顯，使Th17和Treg平衡被打破，加重肝細(xì)胞損傷，從而促進(jìn)乙肝患者病情進(jìn)展。Pearson相關(guān)分析顯示,不同組患者外周血CD4+/CD8+比值和Th17/Treg比值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.357，P<0.05)，而CD4+/CD8+比值是動(dòng)態(tài)反映機(jī)體免疫平衡的重要指標(biāo),提示Th17/Treg比值亦可作為機(jī)體免疫平衡的指標(biāo),為臨床提供參考。

綜上所述，隨著乙肝患者病情進(jìn)展，外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均降低,而CD8+升高,且Th17/Treg比值均升高,免疫細(xì)胞構(gòu)成的免疫平衡被打破,共同參與了乙肝病程進(jìn)展,外周血T細(xì)胞亞群及Th17/Treg比值監(jiān)測(cè)可為評(píng)估乙肝患者病情及預(yù)后、指導(dǎo)患者治療提供參考。

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(收稿：2016-01-22)

▲通訊作者

乙型肝炎 診斷 預(yù)后 抗原,分化,T淋巴細(xì)胞 CD4+陽性T淋巴細(xì)胞 Th17細(xì)胞

R512.62

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.051