西安交通大學第二附屬醫(yī)院血液科(西安 710004)

張鵬宇 羅 靜 趙 璇△ 張龍進 雷 博 蒙 欣 田 瑋 陳銀霞 張王剛

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白血病相關基因MLAA-34與急性單核細胞白血病相關性探討*

西安交通大學第二附屬醫(yī)院血液科(西安 710004)

張鵬宇 羅 靜 趙 璇△張龍進 雷 博 蒙 欣 田 瑋 陳銀霞 張王剛

目的：探討白血病相關基因MLAA-34表達與急性單核細胞白血病(M5)患者疾病特征的關系,及對M5患者化療緩解率和總生存期的影響。方法：應用 RT-PCR 方法對58例M5患者、12例正常健康人骨髓細胞MLAA-34 mRNA 的表達水平進行檢測，統(tǒng)計分析MLAA-34與M5患者的相關性。結果：M5患者的MLAA-34表達量顯著高于正常對照組；MLAA-34高表達組患者外周血象白細胞計數(shù)更高,異常核型的比例明顯升高；M5患者CR后MLAA-34表達水平較治療前明顯下降；M5復發(fā)患者,MLAA-34的表達顯著高于其初發(fā)時的水平；MLAA-34高表達組對化療反應性差,CR率低,中位生存時間短。結論：MLAA-34是和M5發(fā)生、發(fā)展相關的腫瘤相關基因,其高表達是M5患者的一個高危預后因素。

急性單核細胞白血病(M5)是急性髓性白血病中較常見的類型,病情進展快,預后差。由于目前尚未鑒定出M5相關的特異性分子標志物，對于大多數(shù)M5患者僅能通過臨床特征進行分層和預后判斷。為此,我們課題組前期已應用Stratagene公司的λZAP定向克隆表達系統(tǒng)成功地構建了具有單核細胞分化特點的人U937細胞定向克隆cDNA表達文庫,并采用M5型白血病患者的混合血清對所建文庫進行篩選,發(fā)現(xiàn)35條M5抗原新基因(序列全部在GenBank登錄)。應用crELISA技術對這些抗原新基因進行抗體特異性表達的小樣本(各23例)檢測,鑒定出具有特異性抗體、陽性率高的M5抗原新基因MLAA-34[1]；應用RACE技術克隆出其基因的全長cDNA序列(已在GenBank登錄,序列編號：AY288977.2)；通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)：MLAA-34基因是功能未知基因CAB39L的一個新的剪接變體；應用RNAi 技術研究發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因是和M5發(fā)生相關的新的抗凋亡分子[2]；慢病毒介導過表達MLAA-34的U937細胞可顯著抑制細胞凋亡,并增加潛在的致瘤性；應用免疫共沉淀,鳥槍法測序和生物信息學分析示71種蛋白質(zhì)參與了MLAA-34基因可能的信號通路[3]。前期,我們應用實時熒光定量 RT-PCR及Western Blot技術小樣本檢測發(fā)現(xiàn)：MLAA-34基因的mRNA及蛋白水平在M5患者白血病細胞中特異性高表達[4]。本研究進一步分析MLAA-34基因表達與M5患者疾病特征的關系,及對M5患者化療緩解率和總生存期的影響。

對象與方法

1 研究對象 選取2013年10月至2015年10月我科收治的初診M5患者58例，其中男37例，女21例，年齡18～71 歲，中位年齡44.5歲。所有患者均經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學、流式細胞術檢測的白血病免疫分型、骨髓細胞的染色體核型分析、白血病常見基因(NPM1、FLT3和C-KIT)的突變檢測確診?；颊叩墓撬铇吮静扇∮诔踉\、誘導化療后及白血病復發(fā)時。另取12例健康志愿者骨髓作為對照組,其中男6例,女6例,中位年齡39.2歲。骨髓及外周血單個核細胞收集后-80 ℃留存?zhèn)溆?所有人員均獲知情同意并簽署書面同意書。

2 治療方案、療效判定及隨訪 選取的初治M5患者應用MA方案或TA方案進行誘導緩解化療，MA方案：米托蒽醌 8 mg/m2，d1-3，阿糖胞苷 150 mg/m2，d1-7；TA方案：吡柔比星 50 mg/m2，d1-3，阿糖胞苷 100 mg/m2，d1-7。7 d的誘導化療方案未完成之前，患者如合并感染、嚴重骨髓抑制而生命體征不穩(wěn)定者可停藥。第一個化療療程未完成的患者,視為放棄治療；誘導緩解治療完成后觀察療效及緩解率,納入統(tǒng)計指標。療效判定按照張之南等[5]的血液病診斷及療效標準,分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)以及未緩解(NR)。白血病復發(fā)的診斷指標：緩解后骨髓白血病細胞>5%,但<20%,經(jīng)有效的抗白血病治療一個療程仍未達CR者；骨髓白血病細胞>20%；或臨床出現(xiàn)髓外白血病浸潤(骨髓及血象仍正常)三項之一。隨訪起自患者初次就診日期至2015年10月10日止。

3 主要試劑及檢測方法 淋巴細胞分離液購自上海試劑二廠；Trizol 試劑購自 Invitrogen 公司；RNA 反轉錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司；pMD18-T 載體購自 Promega Biotech公司；Taq DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司。應用 RT-PCR 方法對 M5患者及對照組骨髓的 MLAA-34 mRNA 的表達水平分別進行檢測。對 AML-M5 患者不同病程階段(初診、完全緩解、部分緩解或未緩解及復發(fā)) 的 MLAA-34 mRNA 的表達水平進行檢測并分析。骨髓單個核細胞的分離、cDNA 的合成、實時熒光 RT-PCR 檢測見參考文獻[4]。MLAA-34 mRNA的引物序列和Taqman探針序列、內(nèi)參β-actin基因的引物序列、及產(chǎn)物長度,見表1。引物及探針均 委托中山大學達安基因公司合成。

表1 RT-PCR反應的引物及探針序列

4 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件；計量資料呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)(M)描述，兩樣本中位數(shù)比較采用 Mann-Whitney 檢驗，多個樣本間的中位數(shù)比較采用 Kruskal-Wallis 檢驗。率的比較采用 χ2檢驗。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 初發(fā)的M5患者與對照組MLAA-34 mRNA的表達水平 見表2。Mann-Whitney Test統(tǒng)計表明，M5患者MLAA-34的表達水平顯著高于對照組(P< 0.05)。

表2 初發(fā)M5患者與對照組MLAA-34 mRNA的表達水平

2 初發(fā)的M5患者臨床特征與MLAA-34基因表達的關系 初發(fā)M5組患者MLAA-34表達的中位值為7.16×102，以中位值為標準將M5患者分為高表達MLAA-34組和低表達MLAA-34組，每組29例。應用Mann-Whitney Test統(tǒng)計分析的比較結果表明：①患者的年齡、性別與MLAA-34基因的表達無關,兩組間無統(tǒng)計學差異。②與MLAA-34低表達組患者相比,高表達組患者外周血白細胞計數(shù)更高，兩組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；骨髓穿刺檢查原始細胞比例也高,但兩組間差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。③兩組的染色體核型分析結果表明，兩組共有23例患者被檢出異常核型，包括涉及11q23的缺失或易位及+8,9q-等,MLAA-34高表達組異常核型的檢出率明顯增高,兩組之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表3 初發(fā)M5患者臨床特征與MLAA-34基因表達的關系(n=25)

3 M5患者骨髓緩解狀態(tài)與MLAA-34基因表達的關系 為了解M5患者不同病程階段(初診、完全緩解、部分緩解、難治或復發(fā))其MLAA-34表達水平的變化，對30例M5患者進行了MLAA-34 mRNA表達的跟蹤檢測。結果發(fā)現(xiàn)：M5完全緩解(CR)的患者MLAA-34 mRNA表達水平較治療前顯著下降(P<0.05)；M5部分緩解及未緩解的患者MLAA-34表達水平與初治組無統(tǒng)計學差異； M5復發(fā)患者MLAA-34表達水平顯著高于初治組(P<0.05)。見表4。

表4 M5患者骨髓緩解狀態(tài)與MLAA-34基因表達的關系

4 MLAA-34基因表達與M5緩解率的關系 58例初發(fā)急性單核細胞白血病中，經(jīng)誘導緩解方案化療后，1例患者未完成首次化療即因出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥死亡，2例患者未完成首次誘導緩解放棄治療。在可分析的55例患者中，63.4% (35例)的患者達到完全緩解。其中MLAA-34低表達組患者完全緩解率為75%(21/28)，高表達組患者完全緩解率為51.9% (14/27)，MLAA-34低表達組患者CR率顯著高于高表達組，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=4.371,P<0.05 )。

5 MLAA-34基因表達與M5預后的關系 MLAA-34基因低表達組患者中位生存時間為18個月，高表達組患者中位生存時間為10.5月。MLAA-34基因低表達組總生存率顯著高于高表達組患者 (76.2% VS 53.2%,P<0.05)。

討 論

白血病的發(fā)生是一個多步驟的復雜過程，目前具體的過程及發(fā)病機制尚不清楚；但研究已經(jīng)證實，基因突變、染色體易位等基因組的異常在白血病的發(fā)生過程中起著重要作用。在急性白血病的發(fā)生中主要有兩類基因突變起著重要作用，一類是累及酪氨酸激酶的基因突變、重排，使得酪氨酸激酶活性持續(xù)激活，從而導致造血前體細胞獲得增殖/生存優(yōu)勢，比如：BCR/ABL、KIT、TEL/PDGFβR、K-RAS N-RAS、及FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復等突變；第二類是累及轉錄因子的突變，導致機體造血祖細胞分化成熟障礙、阻滯其正常的凋亡,比如：AML1/ETO、PML/RARα、NUP98/HOXA9、CBFβ/SMMHC、C/EBPα和AML1基因點突變等。當?shù)谝活愅蛔儐为毎l(fā)生時會產(chǎn)生CML樣病變，第二類突變單獨存在是將導致似骨髓增生異常綜合征樣(MDS-like)的臨床表現(xiàn)。只有以上兩類突變同時具備時方可導致白血病的發(fā)生，這就是目前被大多數(shù)人接受的AML發(fā)生的多次打擊學說[6]。

基于對白血病的發(fā)病機制的認識,靶向藥物給血液腫瘤的治療帶來了新的曙光,如針對BCR/ABL融合基因的靶向藥物伊馬替尼、PML/RARA融合基因的靶向藥物全反式維甲酸和三氧化二砷,完全改變了慢粒及M3的治療模式及預后[7]。為尋找M5特異性的治療靶點,我們課題組通過構建人U937細胞定向克隆cDNA表達文庫，通過篩選和鑒定發(fā)現(xiàn)了M5抗原新基因MLAA-34；初步研究發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因是功能未知基因CAB39L的一個新的剪接變體；是和急性單核細胞白血病發(fā)生相關的新的抗凋亡分子。最近，我們課題組進一步研究了其可能的抗凋亡機制，發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因的高表達不僅在白血病細胞株中具有抗凋亡作用，而且在宮頸癌HeLa細胞中同樣具有抗凋亡作用[8]；并且發(fā)現(xiàn)其抗凋亡作用可能通過參與了β-Catenin/TCF4途徑[9]。以上基礎研究表明，MLAA-34是一個候選的白血病靶向基因。

本研究是我們既往工作的深入研究，采用特異的Taq Man探針進行定量PCR，統(tǒng)計分析表明：12例正常對照組其MLAA-34 mRNA表達水平極低或檢測不到；M5患者的MLAA-34表達量明顯高于正常對照組，結果與我們前期的小樣本研究結果相一致[4]。進一步的分析發(fā)現(xiàn)：MLAA-34基因高表達與M5患者診斷時的不利的臨床特征相關，與MLAA-34低表達組M5患者相比較，高表達組患者初發(fā)時外周血白細胞計數(shù)更高，發(fā)現(xiàn)異常核型的幾率更高，差異有統(tǒng)計學意義。雖然高表達組骨髓原始細胞比例高于低表達組，但差異沒有統(tǒng)計學意義，這可能與本研究樣本量較小有關。進一步我們對30例M5患者的MLAA-34基因的表達進行了跟蹤檢測，發(fā)現(xiàn)M5患者經(jīng)誘導化療獲得CR后其MLAA-34 mRNA表達水平較治療前明顯下降；尤其是M5患者復發(fā)后，MLAA-34的表達不但升高，而且顯著高于其初發(fā)時的水平。并且，MLAA-34高表達組對化療反應性差，CR率低；預后分析表明，其中位生存時間明顯縮短。

本研究進一步從臨床上證明了MLAA-34是和M5發(fā)生、發(fā)展相關的腫瘤相關基因，其特異性的在M5患者中表達，其高表達是M5患者的一個高危預后因素，有可能成為M5的治療靶點。但本研究仍然存在一些不足，如所納入的實驗對象例數(shù)仍然偏少、為單中心研究、隨訪時間短；后續(xù)的研究需要擴大研究樣本，爭取多中心合作，深入作用機制研究，進一步探討MLAA-34基因與急性單核細胞白血病的相關性及其作用機制。

[1] Chen G, Zhang W, Cao X,etal. Serological identification of immunogenic antigens in acute monocytic leukemia[J]. Leuk Res,2005,29(5)：503-509.

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(收稿：2016-07-25)

Correlation between leukemia associated gene MLAA-34 and acute mononuclear cell leukemia

Department of Clinical Hematology, The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University( Xi’an 710004)

Zhang Pengyu Luo Jing Zhao Xuan et al

Objective: To analyze the relationship between the expression of leukemia associated gene MLAA-34 and the disease characteristics of patients with acute leukemia (M5), and to investigate the effect of MLAA-34 expression on the remission rate and overall survival of patients with M5. Methods: RT-PCR method was used to detect the expression levels of mRNA in bone marrow cells of M5 patients and normal healthy people, and the correlation between MLAA-34 and M5 were statistically analyzed. Results: The expression level of MLAA-34 in M5 patients was significantly higher than that in normal control group; the high expression of MLAA-34 in patients with peripheral blood white blood cell count higher, abnormal karyotype increased significantly; the expression level of MLAA-34 in M5 patients after CR was significantly lower than that before treatment; the expression of MLAA-34 was significantly higher in the recurrent patients with M5 than the primary patients; MLAA-34 high expression patients had poor response to chemotherapy, low CR rate, and short median survival time.Conclusion: MLAA-34 is associated with the occurrence and development of M5, and its high expression is a high risk prognostic factors in patients with M5.

Leukemia, monocytic, acute Gene expression regulation, leukemic Prognosis @MLAA-34 gene

*國家自然科學基金資助項目(81000219)

△西安醫(yī)學院基礎部組胚教研室

白血病, 單核細胞, 急性 基因表達調(diào)控, 白血病 預后 @MLAA-34基因

R733.71

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.042