陜西省寶雞市人民醫(yī)院骨二科(寶雞 721000)

蘇 權(quán) 黨曉謙△▲ 王坤正△ 時(shí)志斌△

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大鼠脊髓缺血再灌注后早期脊髓內(nèi)促炎因子及抗炎因子的表達(dá)

陜西省寶雞市人民醫(yī)院骨二科(寶雞 721000)

蘇 權(quán)黨曉謙△▲王坤正△時(shí)志斌△

目的： 研究脊髓缺血再灌注后早期不同時(shí)相點(diǎn)脊髓組織內(nèi)促炎因子TNF-α、IL-6及抗炎因子IL-4、IL-10的表達(dá),探討TNF-α、IL-6、 IL-4及IL-10在脊髓缺血再灌注后早期的變化規(guī)律及其意義。方法：健康成年SD大鼠120只,隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血30 min組、缺血45 min組及缺血60 min組,每組30只。各組再分為處理后2 h、4 h、8 h、16 h、24 h共5個(gè)時(shí)相組,每個(gè)時(shí)相組6只。參照Zivin法制作脊髓缺血再灌注損傷動(dòng)物模型。每組在2 h、4 h、8 h、16 h、24 h各時(shí)相點(diǎn)分別評估大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能后立即處死動(dòng)物,取L2～L5節(jié)段脊髓，重80～100 mg,剝離脊髓組織外膜,-80℃凍存?zhèn)溆?采用雙抗體夾心ELISA法檢測脊髓勻漿中TNF-α、IL-6、IL-4及IL-10含量。結(jié)果：各時(shí)相點(diǎn)假手術(shù)組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評分明顯高于各缺血組,缺血60 min組的評分最低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。促炎因子TNF-α、IL-6在2 h時(shí)相組即有明顯升高,8 h達(dá)到高峰,24 h仍維持在較高水平；抗炎因子IL-4、IL-10亦具有近似的變化規(guī)律。結(jié)論：促炎因子TNF-α、IL-6及抗炎因子IL-4、IL-10的共同釋放參與脊髓缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過程,促炎因子與抗炎因子的同步變化規(guī)律提示其之間存在一個(gè)動(dòng)態(tài)的相互平衡關(guān)系。

脊髓缺血再灌注損傷(Spinal cord ischemia reperfusion injury, SCII)是脊柱手術(shù)及胸腹主動(dòng)脈手術(shù)的災(zāi)難性并發(fā)癥,其發(fā)生機(jī)制目前仍未明了，學(xué)者們提出了許多學(xué)說如：炎癥反應(yīng)、氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用、Ca2+超載、興奮性氨基酸的毒性作用、細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)、血-腦脊髓屏障通透性改變等。其中炎癥反應(yīng)參與脊髓缺血再灌注后的繼發(fā)損傷機(jī)制受到了廣泛的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠脊髓缺血再灌注模型，動(dòng)態(tài)觀察大鼠脊髓組織內(nèi)炎性因子TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10的在脊髓組織內(nèi)的表達(dá)，探討促炎因子及抗炎因子的變化規(guī)律及其在脊髓缺血再灌注損傷中的作用。

材料與方法

1 動(dòng)物分組及模型建立 120只健康成年SD大鼠(由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),雄雌不限，體重200～250 g,隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、缺血30 min(B組)、缺血45 min(C組)及缺血60 min(D組),每組均為30只。各組再分為造模后2、4、8、16、24 h共5個(gè)時(shí)相組(亞組),每個(gè)時(shí)相6只。用10 %的水合氯醛(0.4 ml/100g)腹腔注射麻醉，麻醉后腹部、背部剪毛,將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上,加熱墊維持直腸體溫在37～38 ℃。對B、C及D組大鼠參照Zivin法[1]建立SCII動(dòng)物模型,常規(guī)消毒,采用腹部正中切口,仔細(xì)分離暴露腹主動(dòng)脈至腎動(dòng)脈水平,于左腎動(dòng)脈起點(diǎn)下方約0.5 cm處用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈,并證實(shí)遠(yuǎn)端動(dòng)脈搏動(dòng)消失,以上各組分別夾閉30 min、45 min及60 min后開放,制作脊髓缺血再灌注損傷模型,假手術(shù)組除不夾閉腹主動(dòng)脈外所有操作相同。每組在2、4、8、16、24 h各時(shí)相點(diǎn)分別采用改良Tarlov評分評估大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能后立即處死動(dòng)物,取L2～L5節(jié)段脊髓,重80～100 mg,剝離脊髓組織外膜,-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 檢測指標(biāo)及方法 ①后肢運(yùn)動(dòng)功能觀察：評分采用改良Tarlov評分[2]標(biāo)準(zhǔn): 下肢無運(yùn)動(dòng),不能負(fù)重為0分；下肢有可觀察到的運(yùn)動(dòng),但不能負(fù)重為1分；后肢活動(dòng)頻繁或有力,不能負(fù)重為2分；下肢可承受體重,能走1～2步為3分；可行走，僅有輕度障礙為4；行走正常為5分。②脊髓組織內(nèi)促炎因子及抗炎因子檢測：將凍存的脊髓組織解凍、勻漿，分別采用大鼠TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(美國R﹠D公司分裝)，按說明書步驟進(jìn)行操作。

結(jié) 果

1 改良Tarlov評分比較 見表1。在各個(gè)時(shí)間觀察點(diǎn)，假手術(shù)組中的大部分動(dòng)物后肢功能正常，各缺血組的動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)功能不同程度減退。后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙嚴(yán)重程度：缺血60 min組>缺血45 min組>缺血30 min組>假手術(shù)組(P<0.05)。

表1 各時(shí)相點(diǎn)動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)功能評分

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血30min組比較，#P<0.05；與缺血45min組比較，△P<0.05

2 TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10含量比較 見表2～5。促炎因子TNF-α、IL-6在2 h時(shí)相組即有明顯升高,8 h達(dá)到高峰,24 h仍維持在較高水平；抗炎因子IL-4、IL-10亦具有近似的變化規(guī)律。

表2 4組動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)脊髓組織內(nèi)TNF-α含量比較(ng/g, n=6)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血30 min組比較，#P<0.05；與缺血45min組比較，△P<0.05

表3 4組動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)脊髓組織內(nèi)IL-6含量比較(ng/g,n=6)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血30 min組比較，#P<0.05；與缺血45 min組比較，△P<0.05

表4 4組動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)脊髓組織內(nèi)IL-4含量比較(ng/g,n=6)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血30 min組比較，#P<0.05；與缺血45 min組比較，△P<0.05

表5 4組動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)脊髓組織內(nèi)IL-10含量比較(ng/g,n=6)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血30 min組比較，#P<0.05；與缺血45 min組比較，△P<0.05

討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的神經(jīng)元對缺血缺氧因素極其敏感，缺血30 min脊髓組織就會(huì)出現(xiàn)明顯的病理變化，即使短時(shí)間內(nèi)血流恢復(fù),其病理變化在原缺血損傷的基礎(chǔ)進(jìn)一步加重，甚至出現(xiàn)遲發(fā)性癱瘓。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在缺血再灌注2 h TNF-α、IL- 6即有明顯的表達(dá),并隨灌注時(shí)間逐漸上升,8 h時(shí)達(dá)到高峰,隨后逐漸下降。脊髓缺血再灌注后早期TNF-α的大量表達(dá)并作為一種重要的炎癥介質(zhì)參與脊髓炎癥反應(yīng)的發(fā)生,同時(shí)TNF-α可上調(diào)其它細(xì)胞因子IL-1、IL-6等的產(chǎn)生,TNF-α可能是眾多細(xì)胞因子的重要啟動(dòng)因子[3]。NF-κB可被缺血、缺氧等因素激活,并可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá),TNF-α、IL-1及IL-6等細(xì)胞因子活化后可增強(qiáng)NF-κB的表達(dá)形成一個(gè)正反饋機(jī)制,產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),形成惡性循環(huán)。此外,NF-κB的激活可導(dǎo)致大量細(xì)胞粘附分子的釋放,NF-κB的信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),而這些均參與脊髓缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制。創(chuàng)傷、缺血及感染等因素可激活CNS中的巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元等細(xì)胞并由這些細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6及其它炎性因子[4]。TNF-α及IL- 6作為炎癥反應(yīng)的信號(hào)分子，其水平往往反應(yīng)炎癥反應(yīng)的程度，而炎癥反應(yīng)與組織損傷密切相關(guān)。于是我們認(rèn)為缺血再灌注后8 h內(nèi)是脊髓里炎癥反應(yīng)逐漸加劇的階段,在這個(gè)時(shí)間段內(nèi)神經(jīng)組織遭受的損害比較嚴(yán)重。缺血時(shí)間延長,各時(shí)相點(diǎn)的促炎因子及抗炎因子表達(dá)量越高,即炎癥反應(yīng)程度約嚴(yán)重,缺血缺氧是脊髓缺血再灌注后脊髓炎癥反應(yīng)程度的決定性因素,TNF-α和IL- 6可敏感反應(yīng)脊髓組織損傷的嚴(yán)重程度。

IL-10是一個(gè)典型的抗炎因子,主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，同時(shí)也是一種有效的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞減活化劑，減少單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞對促炎細(xì)胞的合成[5]。在炎癥過程中，IL-10抑制促炎因子IL-6、TNF-α以及COX-2的作用產(chǎn)物前列腺素的分泌。另外,還可通過激活巨噬細(xì)胞并減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活,抑制細(xì)胞免疫和抑制TNF-α、IL-6等促炎因子的合成和釋放,下調(diào)組織損傷引起的繼發(fā)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子表達(dá),在脊髓缺血再灌注后早期發(fā)揮關(guān)鍵的作用[6]。IL-4是一種屬于白介素家族的免疫介質(zhì)，是參與體液免疫最重要的因子之一，主要調(diào)節(jié)Th淋巴細(xì)胞向Th2方向分化及提高細(xì)胞活性。在其它領(lǐng)域的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-4與IL-10同樣具有免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用,并且IL-4及IL-10具有協(xié)同作用,在血液誘導(dǎo)的軟骨損傷實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合應(yīng)用IL-4及IL-10比單獨(dú)應(yīng)用IL-10更好的抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)[7]。我們的研究發(fā)現(xiàn)脊髓缺血再灌注后IL-4的表達(dá)變化與IL-10相似，這表明IL-4是脊髓缺血再灌注后脊髓內(nèi)的炎癥反應(yīng)中同樣是一個(gè)重要的炎性因子并在脊髓損傷的病理生理過程發(fā)揮重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn),脊髓缺血再灌注后引起促炎因子TNF-α、IL-6在再灌注2h即有明顯的升高，抗炎因子IL-10在再灌注2h同樣有明顯的升高，IL-4在再灌注4h開始有明顯的升高，且促炎因子及抗炎因子具有相似的變化規(guī)律。促炎因子升高，隨后誘發(fā)抗炎因子迅速的上升，抗炎因子抑制促炎因子,使其下降，隨后抗炎因子也隨之下降。Van Meegeren等[8]認(rèn)為，在脊髓損傷里存在一個(gè)促炎因子/因素與抗炎因子/因素之間的相互平衡的網(wǎng)絡(luò)。本研究發(fā)現(xiàn),在脊髓缺血組動(dòng)物的脊髓組織里,促炎因子TNF-α和IL-6與抗炎因子IL-4和IL-10呈正相關(guān)，且脊髓缺血時(shí)間越長,炎性因子的表達(dá)量越高,于是我們認(rèn)為,TNF-α、IL-6、IL-4及IL-10均參與脊髓缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)，且與脊髓組織的損傷程度密切相關(guān)。促炎因子與抗炎因子之間存在一個(gè)直接或間接的相互平衡關(guān)系，脊髓缺血再灌注后損傷后的炎癥反應(yīng)是一個(gè)“自身調(diào)節(jié)”和“自我修復(fù)”的過程。

脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)是一把“雙刃劍”，它同時(shí)具有細(xì)胞毒性和細(xì)胞保護(hù)的雙重作用。適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)可以清除損傷因子、組織碎片并可分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子,甚至對于脊髓組織的修復(fù)是必需的,但過度的炎癥反應(yīng)可引起重要組織結(jié)構(gòu)與功能的損害,對于不可再生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)來說是毀滅性的[9]。因此,如何利用這把“雙刃劍”使其既要充分發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用的一面同時(shí)給予適當(dāng)?shù)母深A(yù)使其盡可能避免細(xì)胞毒性作用是我們繼續(xù)努力探索的方向。本研究明確了SCII后早期脊髓組織內(nèi)炎性因子自身變化情況,但沒有觀察到炎性因子表達(dá)水平恢復(fù)至正常水平,這與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的觀察時(shí)間過短有關(guān)。另外,通過抑制炎性因子的表達(dá)來防治脊髓缺血再灌注損傷尚待進(jìn)一步研究。

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(收稿：2016-03-18)

△西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨一科

▲通訊作者

脊髓 再灌注損傷 腫瘤壞死因子-α 白細(xì)胞介素類 大鼠

R651.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.005