第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院腫瘤科(西安710038)

尤向輝 蘭 飛 宋 揚 賀 新 蘇海川▲

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▲通訊作者

Raf-1對人血管內皮細胞增殖及細胞周期的影響

第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院腫瘤科(西安710038)

尤向輝 蘭 飛 宋 揚 賀 新 蘇海川▲

目的：探討Raf-1蛋白激酶在血管內皮細胞生長增殖中的作用。方法：分別應用Raf-1蛋白激酶的真核表達載體pCDNA3-raf-1及干涉核苷酸片段Raf-1-siRNA轉染人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，進而應用MTT法繪制HUVECs生長曲線，應用流式細胞儀分析細胞周期。結果：HUVECs轉染真核表達載體后，細胞內Raf-1明顯增高，與對照組比較，細胞增殖速度明顯加快；而轉染Raf-1-siRNA后，HUVECs細胞中Raf-1表達水平降低，與對照組比較，細胞增殖速度明顯減慢，阻滯于G1期。結論：Raf-1蛋白激酶在血管內皮細胞生長增殖中發(fā)揮重要作用。

腫瘤新生血管的生成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色,其一方面為腫瘤生長提供必要的營養(yǎng),另一方面與腫瘤的侵襲及轉移密切相關[1]。因此以新生血管為靶向的腫瘤生物治療近年來得到了快速發(fā)展[2]。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號轉導通路參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,其中Raf-1蛋白作為該通路中的一個分子發(fā)揮著重要作用[3]。研究顯示,在多種惡性腫瘤中,Raf-1表達明顯上調,并與患者的預后密切相關[4]。因此針對Raf-1的抗腫瘤靶向藥物研究一直是腫瘤生物治療的熱點之一[5]。但當前研究主要集中于通過抑制腫瘤細胞RAF-MEK-ERK信號轉導通路,達到靶向治療腫瘤的目的,而關于Raf-1與腫瘤血管形成、增殖之間的關系還不十分明確。在本研究中,我們通過探討血管內皮細胞Raf-1對人血管內皮細胞增殖、細胞周期的影響,為Raf-1在腫瘤血管形成、增殖中作用研究打下基礎。

材料與方法

1 實驗材料 Raf-1真核表達載體pCDNA3-raf-1由本室保存；針對Raf-1的siRNA核苷酸片段Raf-1-siRNA：5’-CCU CAC GCC UUC ACC UUU Adtdt及不相關對照均由上海吉瑪公司合成；人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)取自新鮮臍帶,原代培養(yǎng)?？雇每谷薘af-1抗體、兔抗人phosph-c-Raf(ser388)抗體均購自Cell signaling公司；流式細胞儀(FACSCalibur)購自BD公司；脂質體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。

2 細胞轉染及鑒定 依據(jù)脂質體轉染試劑盒說明書,分別將真核表達載體pCDNA3-raf-1及小分子干擾RNA(Raf-1-siRNA)轉染HUVECs,同時設置空載體(pCDNA3)及空白對照；48 h后,收集HUVECs細胞并進行細胞裂解，Western Blot檢測HUVECs細胞中Raf-1及磷酸化Raf-1蛋白表達水平,一抗分別為兔抗人Raf-1抗體、兔抗人phosph-c-Raf(ser388)抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG,同時設置β-Actin對照。

3 MTT檢測細胞增殖 調整細胞濃度,以5×105/孔接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后,連續(xù)7 d進行MTT檢測并繪制生長曲線,簡述步驟如下：每天測定8孔,每孔中加入20 μl四甲基偶氮唑鹽(MTT)液(5 mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),充分震蕩后,490 nm波長測定吸光值,計算吸光度平均值,以時間為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制細胞生長曲線。

4 細胞周期檢測 胰酶消化細胞后,應用預冷PBS洗滌2次,加入預冷70%乙醇溶液重懸細胞,于4 ℃過夜,應用預冷PBS洗滌2次后,加入含有50 μg/ml溴化乙錠(PI)、0.2% Triton X-100及100 μg/ml RNase A的PBS 500 μl 4 ℃避光孵育30 min,流式細胞分析儀進行細胞周期檢測。

結 果

1 HUVECs細胞Raf-1蛋白水平測定 見圖1。HUVECs分別轉染pCDNA3-raf-1、Raf-1-siRNA后,Western-blot檢測結果顯示：轉染真核表達載體pCDNA3-raf-1的HUVECs細胞中Raf-1蛋白水平及磷酸化水平較空載體對照組(pCDNA3)、脂質體對照組(lipofectin control)均明顯增高(P<0.05)；而HUVECs在轉染干涉小分子RNA(Raf-1-siRNA)后，Raf-1蛋白水平及磷酸化水平均明顯降低(P<0.05)。

圖1 Western-blot檢測蛋白水平

2 細胞增殖曲線 見圖2。應用MTT法分析HUVECs細胞轉染pCDNA3-raf-1、Raf-1-siRNA后,細胞生長增殖情況并繪制曲線。轉染真核表達載體pCDNA3-raf-1后,HUVECs細胞生長增殖速度與對照組相比較明顯增加(P<0.05)；而轉染干涉RNA小分子Raf-1-siRNA后,細胞增殖速度降低(P<0.05)。

3 細胞周期變化 見附表。應用流式細胞技術分析細胞周期分布情況：HUVECs細胞轉染真核表達載體pCDNA3-raf-1后,S期細胞比例與空載體對照組相比較明顯增加；相反,轉染干涉RNA小分子Raf-1-siRNA后,G1期的HUVECs細胞比例明顯增加(P<0.05)。

圖2 HUVECs細胞增殖曲線

附表 流式細胞技術分析HUVECs細胞周期

討 論

惡性腫瘤的有效治療仍舊是人類面臨的巨大挑戰(zhàn)之一，傳統(tǒng)的化療具有治療效果差、副作用大、特異性低等缺點。腫瘤微血管的生成在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉移中扮演著重要角色，因此針對腫瘤血管的生物治療研究越來越受到人們重視[6]。腫瘤微血管的生成是由多種因素、多種步驟參與的過程,多種細胞如腫瘤細胞、成纖維細胞、內皮細胞均參與了腫瘤微血管的生成。我們在本實驗應用HUVECs細胞作為研究對象，HUVECs細胞在體外培養(yǎng)后,可以建立體外人造血管模型,形成網(wǎng)狀結構，為以后抗腫瘤血管藥物篩選、血管形成機制研究奠定基礎[7]。

腫瘤血管生成受到腫瘤微環(huán)境中多種信號分子和通路的影響。目前已經(jīng)有多種靶向腫瘤血管生成的藥物進入臨床，這些治療靶標包括：抗血管生成因子、血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子受體(EGFR)等[8]。Ras/Raf-1/ERK信號轉導通路在調控細胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[9]。在本實驗中,為了驗證Raf-1在血管內皮細胞增殖中的作用,我們構建了Raf-1真核表達載體并轉染HUVECs細胞，結果顯示，隨著細胞內Raf-1表達增加，其磷酸化水平也明顯增加,細胞增殖速度加快；同時,我們設計了針對Raf-1的干涉小RNA,轉染HUVECs細胞后,細胞總Raf-1及磷酸化Raf-1水平均明顯降低,細胞增殖速度也明顯減慢。這些結果進一步明確了Raf-1在血管內皮增殖中具有重要作用,和其在腫瘤細胞中的作用相似，可以促進細胞增殖，為以后腫瘤治療中以Raf-1為靶點的研究提供了新的實驗基礎。因此，抗Raf-1靶向藥物一方面可通過抑制(降低)腫瘤細胞內Raf-1表達抑制腫瘤細胞生長，另一方面，也可抑制(降低)腫瘤血管內皮細胞內Raf-1表達，抑制腫瘤血管的生成,進而抑制腫瘤的增殖、侵潤、轉移等。

綜上所述,本研究通過研究Raf-1對HUVECs細胞周期及增殖速度的影響,初步證實了其在新生血管內皮細胞中的作用,為進一步研究Raf-1在血管生成、腫瘤微循環(huán)中發(fā)揮的作用研究奠定了基礎，也為腫瘤治療靶點Raf-1在抗腫瘤血管治療中的應用提供了新的實驗依據(jù)。

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(收稿：2016-01-27)

The function of raf-1 in proliferation，cell cycle of human vascular endothelial cells

Department of Oncology,Tangdu Hospital of FMMU(Xi’an 710038)

You Xianghui Lan Fei Song Yang et al

Objective: To investigate the function of Raf-1 in cell proliferation and cell cycles in vascular endothelial cells. Methods: The Human Umbilical Vein Endothelial Cells(HUVECs) were transfected with the eukaryotic expression vector pCDNA3-raf-1 or Small interference RNA Raf-1-siRNA.Then, the cells growth curves were draw according of MTT, and cell cycles were detected by FACs. Results: After the HUVECs were transfected with the eukaryotic expression vector pCDNA3-raf-1,the proliferation of HUVECs increased significantly than the control. Vice versa, after the HUVECs were transfected with Raf-1-siRNA, the Raf-1 expression decreased, and the amplification of HUVECs was slower down than the control, the cell cycles were arrested at G1phase. Conclusion: The raf-1 plays an important role in the growth of vascular endothelial cells.

Mitogen-activated protein kinase kinases Human umbilical vein endothelial cells Neoplasm metastasis @Vascular endothelial cells

絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶 人臍靜脈內皮細胞 腫瘤轉移 @腫瘤血管生成

R73-37

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.004