徐平湘　齊　特　陸　莉　薛　明　肇玉明

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理系，北京 100069)

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· 技術(shù)與方法 ·

原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法的改進(jìn)

徐平湘齊特陸莉薛明肇玉明*

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理系，北京 100069)

血腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)是機(jī)體的內(nèi)部屏障之一，由介于血循環(huán)與腦實(shí)質(zhì)間的軟腦膜、脈絡(luò)叢的腦毛細(xì)血管壁和包于壁外的膠質(zhì)膜所組成，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要解剖結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[1]。血腦脊液屏障主要是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)和周細(xì)胞構(gòu)成，星形膠質(zhì)足突包繞毛細(xì)血管的外周，覆蓋其95%～99%的表面積。其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血腦脊液屏障的關(guān)鍵組織細(xì)胞位點(diǎn)，存在結(jié)構(gòu)復(fù)雜的緊密連接，且相對(duì)缺乏胞飲囊泡及窗孔，其能夠阻止大多數(shù)內(nèi)外源性物質(zhì)透過血腦脊液屏障，BBB的通透性是藥物分子發(fā)揮其中樞活性的決定性因素之一。藥物是否能夠在BBB上進(jìn)行有效轉(zhuǎn)運(yùn)是藥物進(jìn)入腦組織和治療腦部疾病的主要制約因素[2]。

內(nèi)皮細(xì)胞在血腦脊液屏障中的重要性決定了其是構(gòu)建藥代動(dòng)力學(xué)血腦脊液屏障體外藥物評(píng)價(jià)模型時(shí)的關(guān)鍵因素[3]。目前，國內(nèi)外BBB模型多采用腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)建立。因此，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與方法是構(gòu)建該模型的關(guān)鍵因素之一。目前國內(nèi)外關(guān)于BMECs的分離方法有篩網(wǎng)法、酶消化法及組織塊法等[4-6]，在提取的過程中常常需要Percoll梯度離心法，方法繁瑣，而且由于Percoll液為無機(jī)溶液，會(huì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成損害，影響細(xì)胞的活性。同時(shí)，從組織中提取微血管段后，培養(yǎng)的包被劑也會(huì)對(duì)細(xì)胞的活性及形態(tài)產(chǎn)生影響。因此，BMECs在組織分離、提取及接種的過程中還有優(yōu)化和改進(jìn)的必要性。本實(shí)驗(yàn)室人員結(jié)合國內(nèi)外報(bào)道[4-6]，在已有方法的基礎(chǔ)上，在組織分離過程中采用3種酶聯(lián)合消化法(膠原酶Ⅱ型、膠原酶/分散酶及DNA酶Ⅰ)，提取過程中利用差速離心替代Percoll梯度離心，采用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液(endothelial cell medium，ECM)，對(duì)培養(yǎng)方法進(jìn)行優(yōu)化。并對(duì)比了鼠尾膠原與多聚賴氨酸作為包被劑下細(xì)胞的形態(tài)，為藥代動(dòng)力學(xué)血腦脊液屏障模型提供細(xì)胞平臺(tái)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12只雄性SD大鼠，鼠齡16 d，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-(軍)2012-0004。

1.2藥品與試劑

牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)購自美國Amresco公司，ECM、內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(endothelial cell growth supplement, ECGS)、青霉素/鏈霉素混合液和胎牛血清均購自美國Sciencell公司，DMEM培養(yǎng)基及其他培養(yǎng)試劑購自美國Invitrogen公司。膠原酶Ⅱ型購自美國Gibico公司，膠原酶/分散酶及DNA酶Ⅰ(DNAse Ⅰ)購自美國Roche公司，0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鼠尾膠原由本實(shí)驗(yàn)室自行提取。 0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚賴氨酸(poly-L-lysine，相對(duì)分子質(zhì)量70 000～150 000)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT] 購自美國Sigma公司。 CD31(PECAM-1)抗體購自美國Millipore公司(稀釋比例 1∶250)，vWF抗體購自美國Santa Cruz公司(稀釋比例1∶100)， Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG (稀釋比例 1∶200)購自美國Invitrogen公司，Alexa Fluor 488標(biāo)記抗小鼠IgG(稀釋比例1∶200)、封閉用羊血清及免疫組織化學(xué)染色所用其他試劑均購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3常用儀器

高性能無菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱和便攜式液氮生物容器(美國Thermo Fisher公司)，高壓消毒鍋(日本SANYO公司)，熒光顯微鏡Eclipse 80i(日本尼康公司)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)液的配制

ECM完全培養(yǎng)基：按照培養(yǎng)基說明書，配制含5%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青霉素/鏈霉素混合液和1%(體積分?jǐn)?shù))ECGS液的專業(yè)內(nèi)皮細(xì)胞ECM完全培養(yǎng)基。

普通DMEM完全培養(yǎng)基：按照文獻(xiàn)[5]報(bào)道方法，配制含20%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清，2 ng/mL 成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、100 μg/L肝素鈉和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 青霉素/鏈霉素混合液的普通DMEM高糖培養(yǎng)基。

1.5鼠尾膠原制備

取大鼠尾1條,75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇消毒,剖開取出中間的尾腱,泡在0.1%(體積分?jǐn)?shù))醋酸中，4 ℃放置，并不時(shí)振蕩，48 h后取上清，離心1 789(×g) 30 min,取上清,棄沉淀。分裝上清(鼠尾膠原)4 ℃保存，用時(shí)以滅菌蒸餾水1∶20稀釋。

1.6原代內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

1.6.1腦微血管段的分離

大鼠脫臼處死，無菌條件下剪開顱骨，將取出的大腦放入盛有冰冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)培養(yǎng)皿中，解剖去除間腦、海馬、白質(zhì)、灰質(zhì)等，僅余大腦皮質(zhì)，隨后將大腦皮質(zhì)在干燥的滅菌濾紙上滾動(dòng)，粘除軟腦膜及腦膜大血管后，用PBS漂洗3次，用剪刀剪成1 mm3大小糜狀物，0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膠原酶Ⅱ型混勻后置于37 ℃孵箱中消化90 min，消化過程中每10 min晃動(dòng)1次，以確保消化完全；常溫離心111.8(×g)，離心8 min，棄掉上清液；消化產(chǎn)物加入2倍體積的20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA輕柔吹打10次左右，4 ℃ 1 000(×g)離心20 min，棄去中上層神經(jīng)組織及大血管，保留底部沉淀。沉淀聚集物中加入2 mL DMEM培養(yǎng)基輕柔吹打洗滌，常溫111.8(×g)離心5 min，棄掉上清液，加入0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膠原酶/分散酶2 mL和2 kU/mL DNAse酶Ⅰ 30 μL分散沉淀物。產(chǎn)物放入37 ℃孵箱中消化1 h，常溫55(×g)離心6 min，棄掉上清液。再次加入2 mL DMEM洗滌，輕柔吹打5次，常溫離心111.8(×g)5 min，棄掉上清液，加入20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))血清白蛋白2 mL輕柔吹打10次，4 ℃ 1 000(×g)離心20 min，棄掉上清液，獲得微血管段。

1.6.2微血管段的純化

微血管段提取后，加入12 mL ECM完全培養(yǎng)基輕柔吹打10次，在2個(gè)未經(jīng)包被處理的60 mm培養(yǎng)皿中差速培養(yǎng)1 h，之后接種在經(jīng)過0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膠原包被的25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)5～6 d后，以1∶3傳代培養(yǎng)。

1.7原代內(nèi)皮細(xì)胞鑒定

原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞及第三段培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞分別種植在經(jīng)過膠原包被的玻璃片上，用0.01 mol/LPBS洗滌細(xì)胞3次，4% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛室溫固定15 min，固定后的培養(yǎng)細(xì)胞用0.01 mol/L PBS洗滌3次，用內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物CD31及vWF抗體進(jìn)行免疫熒光共染色鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。染色步驟如下：5%(體積分?jǐn)?shù))的山羊血清室溫封閉半小時(shí)，加入CD11b及vWF一抗混合液，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，加入Alexa Fluor 594及Alexa Fluor 488二抗混合液室溫孵育1 h，PBS洗滌3次；將玻片扣于預(yù)先滴有含DAPI的封片劑的載玻片上，封片。

1.8內(nèi)皮細(xì)胞純度計(jì)算

在熒光顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野以100倍放大情況下觀察、拍照，鏡下計(jì)數(shù)CD31與vWF雙陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。

1.9不同培養(yǎng)包被劑對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響

分別以0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膠原及0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚賴氨酸包被的25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)6 d，觀察內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)，比較包被劑對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響。

1.10DNA酶在實(shí)驗(yàn)中的作用

在分離血管段的過程中，斷裂的DNA與破碎的細(xì)胞交雜在一起，形成難以吹打的細(xì)胞團(tuán)塊，導(dǎo)致血管得率低下，影響血管段的提取及接種后內(nèi)皮細(xì)胞從血管段爬出。目前文獻(xiàn)[6]報(bào)道的分離腦微血管內(nèi)皮血管段的方法多為不加DNA酶的膠原酶Ⅱ型和膠原酶/分散酶的兩種酶消化方法。借鑒本團(tuán)隊(duì)之前原代神經(jīng)元培養(yǎng)方法[7]，本研究在分離過程中加入了DNA酶Ⅰ，以降解斷裂的DNA。同時(shí)，為了驗(yàn)證DNA酶在組織取材中的作用，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定了不加DNA酶Ⅰ的處理組，對(duì)比觀察原代培養(yǎng) 6 d之后的2種處理下細(xì)胞形態(tài)的差異。

1.11內(nèi)皮細(xì)胞在ECM培養(yǎng)基與在DMEM培養(yǎng)基中生長情況的比較

將第3代內(nèi)皮細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，每孔5×102個(gè)細(xì)胞，用ECM培養(yǎng)基與DMEM培養(yǎng)基對(duì)比培養(yǎng)，利用光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)及MTT比色法觀察細(xì)胞增生情況。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)觀察

經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分離獲取的微血管段長短不一，表面光滑，折光性好，細(xì)胞呈現(xiàn)串珠樣(圖1A)；培養(yǎng)3 d后，在接種部位圍繞微血管長出細(xì)胞，微血管段呈現(xiàn)“蜈蚣樣”形態(tài),細(xì)胞為短梭形(圖1B)；培養(yǎng)5 d時(shí)，細(xì)胞以接種部位為中心不斷增生形成聚體群，不同群落之間不重疊，呈現(xiàn)鋪路石樣(又稱為“漩渦樣”)形態(tài)(圖1C)。

2.2內(nèi)皮細(xì)胞純度鑒定

利用CD31與vWF的抗體進(jìn)行免疫熒光共染色(圖2)，計(jì)數(shù)鏡下雙陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。原代(圖2A～2D)與第3代細(xì)胞(圖2E～2H)陽性率均>99%，證明培養(yǎng)細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。第3代細(xì)胞在形態(tài)上保留了內(nèi)皮細(xì)胞的短梭形，細(xì)胞聚合呈現(xiàn)“鋪路石樣”或“漩渦樣”形態(tài)，表明經(jīng)過傳代后保留了內(nèi)皮的特性。

2.3不同培養(yǎng)包被劑對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響

分別以0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膠原及0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚賴氨酸包被的25 cm2的培養(yǎng)瓶，接種24 h(1d)時(shí)，2種包被基質(zhì)均可支持內(nèi)皮細(xì)胞生長，且形態(tài)區(qū)別不明顯(圖3A和3C)；細(xì)胞培養(yǎng)6 d后，膠原包被的內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)漩渦態(tài)(圖3B)，而多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中細(xì)胞未見典型漩渦態(tài)(圖3D),表明膠原作為包被材料更有利于內(nèi)皮細(xì)胞保持固有細(xì)胞形狀。

圖1　原代培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

On day 1, micro-vessels(→)were in different length while BMECs accumulated in bead-like (A). On day 3, surrounding the seeding site, BMECs proliferated from the micro-vessels (→)as centipede-like (B). On day 5, BMECs formed the typical curved ‘paving stone’ (→)(C). Magnification: 100 fold； BMECs：brain microvascular endothelial cells.

圖2　利用CD31與vWF的抗體進(jìn)行免疫熒光共染色鑒定內(nèi)皮細(xì)胞純度

A-D:images of primary cultured BMECs; E-H: images of third passage of BMECs; A， E: vWF; B，F(xiàn)：CD31; C，G：DAPI； Magnification: 100 fold；BMECs：brain microvascular endothelial cells.

圖3　不同培養(yǎng)包被介質(zhì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響

Cells with the support of 0.2% collagen (upper panel) and 0.1% poly-l-lysine (lower panel), respectively. Morphology changes of BMECs on day 1 (A, C) and on day 6 (B, D). Magnification: 100 fold； BMECs：brain microvascular endothelial cells.

2.4DNA酶在實(shí)驗(yàn)中的作用

本研究發(fā)現(xiàn)，不加DNA酶Ⅰ的處理組，提取的微血管段明顯少于經(jīng)過DNA酶Ⅰ的處理組，并且在培養(yǎng)6 d后細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞最初接種位置部分細(xì)胞成團(tuán)生長(圖4A)；而經(jīng)過DNA酶Ⅰ的處理，細(xì)胞相對(duì)排列有序(圖4B)。證明在取材時(shí)候，DNA酶Ⅰ將斷裂的DNA分解，便于消化物的吹打，有利于血管段的提取及后期細(xì)胞爬出并有序生長。細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，未加DNA酶Ⅰ的兩種酶法，每個(gè)25 cm2的培養(yǎng)瓶可得到4.2×105個(gè)細(xì)胞，而經(jīng)過DNA酶Ⅰ處理的細(xì)胞組可得到2.5×106個(gè)細(xì)胞，即經(jīng)過DNA酶Ⅰ處理后細(xì)胞收率可提高至未處理的5.95倍，說明經(jīng)過處理對(duì)培養(yǎng)方法的改進(jìn)是有效的。

2.5內(nèi)皮細(xì)胞在ECM培養(yǎng)基及DMEM培養(yǎng)基中生長情況的比較

如圖5所示，在2種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞，從第2天開始，生長速度與第1天相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。兩種培養(yǎng)基相比較，在DMEM普通培養(yǎng)基中，內(nèi)皮細(xì)胞生長緩慢；在ECM培養(yǎng)基中，內(nèi)皮細(xì)胞從第2天開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，5天后達(dá)到增生高峰，且第5天時(shí)細(xì)胞融合度已經(jīng)約為90%。并且與DMEM培養(yǎng)基相比，ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞在第2天、第3天、第5天和第6天增生速度分別為在DMEM培養(yǎng)基中的1.82、1.96、2.36、2.32倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明作為內(nèi)皮細(xì)胞的專用培養(yǎng)基，ECM培養(yǎng)基確實(shí)可顯著增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞活性及增生能力。

圖4　DNAse Ⅰ在提取微血管段中的作用

Morphology changes of brain microvascular endothelial on day 6 with DNAse I (A) and with DNAse I treatment (B). Magnification: 100 fold.

圖5　內(nèi)皮細(xì)胞在普通DMEM完全培養(yǎng)基和ECM完全培養(yǎng)基中的生長差異

3　討論

目前，國內(nèi)外分離腦微血管段的方法主要為篩網(wǎng)法和兩次酶分步消化法。通過篩網(wǎng)法細(xì)胞得率較低，且勻漿過程對(duì)細(xì)胞損傷較大，接種后難以存活；兩次酶分步消化法所分離的細(xì)胞雖存活率和細(xì)胞得率都有所提高，但在血管段分離提取過程中，由于斷裂的DNA與破碎的組織、細(xì)胞容易形成團(tuán)塊，一方面降低細(xì)胞的得率，另一方面接種后細(xì)胞容易成簇生長，影響細(xì)胞的狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)根據(jù)文獻(xiàn)[4]報(bào)道，摸索過篩網(wǎng)法，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率僅為30%，并且微血管段提取過程中容易形成不易吹打的團(tuán)塊，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的現(xiàn)象一致。因此，本研究借鑒本團(tuán)隊(duì)原代神經(jīng)元培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)，在血管段分離過程中，加入DNA酶Ⅰ優(yōu)化分離方法。結(jié)果表明，經(jīng)過DNA酶Ⅰ處理的消化產(chǎn)物，不易成團(tuán)，容易吹打，接種后細(xì)胞排列有序，證實(shí)DNA酶Ⅰ的優(yōu)化是必須且切實(shí)可行的。

經(jīng)典的原代培養(yǎng)方法是利用Percoll液分離血管段。而Percoll液是無機(jī)鹽溶液，這種方法會(huì)對(duì)血管段造成一定的損傷。本研究用差速貼壁法代替Percoll液，以完全培養(yǎng)基在未經(jīng)包被的培養(yǎng)皿內(nèi)，經(jīng)過1 h的差速貼壁培養(yǎng)，利用血管段與成纖維及腦膜等雜細(xì)胞的貼壁速度與貼壁能力的不同，可達(dá)到雜細(xì)胞貼壁而血管段不貼壁的目的。并且差速培養(yǎng)過程對(duì)血管段并無損傷，之后轉(zhuǎn)為包被后的培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，可提高細(xì)胞活性與純度。

本研究使用了內(nèi)皮細(xì)胞專用ECM培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基含有內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)所需的微量元素、氨基酸、生長因子等。同時(shí)，本研究所用的胎牛血清和青/鏈霉素均為該公司產(chǎn)品，用上述試劑按照說明書要求的比例配制的完全培養(yǎng)基為優(yōu)化培養(yǎng)基，可保證內(nèi)皮細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)生長。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果用普通的DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清配制的培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d時(shí)所得到的內(nèi)皮細(xì)胞純度僅為80%，而用ECM培養(yǎng)基則可大于99%；同時(shí)，生長曲線表明，用ECM完全培養(yǎng)基比普通培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)的細(xì)胞生長速度顯著增快，證明選用此培養(yǎng)基對(duì)方法的優(yōu)化是必要的。

除了對(duì)培養(yǎng)方法的優(yōu)化，本研究還比較了培養(yǎng)包被介質(zhì)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。研究顯示，膠原作為支持介質(zhì)，內(nèi)皮細(xì)胞更容易形成典型的鋪路石樣及“漩渦樣”形態(tài)；而多聚賴氨酸生長的細(xì)胞相對(duì)雜亂，證實(shí)膠原更適合內(nèi)皮的生長。

綜上所述，本研究以膠原為包被介質(zhì)，3種酶聯(lián)合消化法(膠原酶Ⅱ型、膠原酶/分散酶及DNA酶Ⅰ)分離腦微血管段，利用差速貼壁法去除雜細(xì)胞并采用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基的優(yōu)化培養(yǎng)細(xì)胞的方法，可獲得高純度與高存活率細(xì)胞，為建立血腦脊液屏障模型提供了可靠有效的技術(shù)方法，為中樞系統(tǒng)的藥理毒理學(xué)研究和藥物評(píng)篩提供了技術(shù)支撐[8]。

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編輯孫超淵

國家自然科學(xué)基金(31570856，3157040726)，北京市自然科學(xué)基金(5152005)，北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃一般項(xiàng)目基金(KM201610025003)，首都醫(yī)科大學(xué)校長基金(2015JS13)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(31570856，3157040726), Natural Science Foundation of Beijing (5152005), Scientific Research Project of Beijing Educational Committee(KM201610025003), Capital Medical University Principal Foundation(2015JS13).

時(shí)間：2016-10-1610∶55

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1055.018.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.026]

2016-05-20)