紀(jì)曉方　李麗英　?！∧?

(1.首都醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系 肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

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· 基礎(chǔ)研究 ·

高內(nèi)涵分析及Western blotting法在蛋白質(zhì)核質(zhì)分布研究中的應(yīng)用及比較研究

紀(jì)曉方1李麗英2常娜2*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系 肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

目的使用不同方法對(duì)蛋白質(zhì)的核質(zhì)分布進(jìn)行檢測(cè)并比較差異。方法細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色后使用高內(nèi)涵分析(high content analysis, HCA)對(duì)蛋白質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核總熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析；分別提取胞質(zhì)及胞核蛋白，使用Western blotting法對(duì)核質(zhì)組分中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行鑒定。結(jié)果兩種方法均可檢測(cè)到蛋白質(zhì)的出核轉(zhuǎn)運(yùn)；經(jīng)定量分析，HCA法檢測(cè)到的HuR蛋白質(zhì)/核比升高倍數(shù)小于Western blotting法。結(jié)論使用HCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)核質(zhì)定位具有準(zhǔn)確、客觀(guān)、成本低、快捷、多參數(shù)等特點(diǎn)，不失為Western blotting的有效補(bǔ)充及替代方法。

高內(nèi)涵分析；Western blotting；蛋白質(zhì)核質(zhì)分布

蛋白質(zhì)作為一種生物大分子，是組成一切細(xì)胞、組織的基本有機(jī)物，同時(shí)也是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者和各種生物學(xué)功能的重要行使者。在細(xì)胞中，蛋白質(zhì)的核質(zhì)定位是其發(fā)揮生物學(xué)功能的重要前提之一。因此，如何分析鑒定蛋白質(zhì)在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中的分布對(duì)于蛋白質(zhì)功能的研究有著十分重要的意義。

高內(nèi)涵分析(high content analysis, HCA)技術(shù)是一種基于成像的單細(xì)胞水平的多參數(shù)細(xì)胞分析方法。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，近年來(lái)，HCA在生命科學(xué)研究中開(kāi)始得到了愈發(fā)廣泛的應(yīng)用[1-3]。本實(shí)驗(yàn)以RNA結(jié)合蛋白HuR為研究對(duì)象，探索了使用HCA研究蛋白質(zhì)核質(zhì)分布的實(shí)驗(yàn)方法，并與Western blotting法進(jìn)行比較。

1　材料與方法

1.1材料

1)細(xì)胞：人的肝星形細(xì)胞系(LX-2)，來(lái)源于美國(guó)Scott L Friedman教授實(shí)驗(yàn)室。

2)主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó) Thermo 公司)，離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf 公司)，高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)(美國(guó) Thermo 公司)，Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國(guó) LI-COR 公司)，垂直電泳裝置及蛋白轉(zhuǎn)印裝置(美國(guó) Bio-Rad 公司)。

3)主要試劑：DMEM 培養(yǎng)基(美國(guó) Gibco 公司)，胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)(美國(guó) Hyclone 公司)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)(美國(guó) PeproTech 公司)，來(lái)普霉素B (lemptomycin B, LMB)及其他生化試劑(美國(guó) Sigma 公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將LX-2接種于100 mm培養(yǎng)皿中，加入10 mL完全培養(yǎng)基[含DMEM + 10 %(體積分?jǐn)?shù)) FBS + 1 %(體積分?jǐn)?shù)) 青霉素/鏈霉素 + 1 %(體積分?jǐn)?shù)) 的谷氨酰胺]，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱[37 ℃、5 %(體積分?jǐn)?shù))CO2]中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞在達(dá)70%～80% 匯合時(shí)，更換培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，加TGF-β1 (10 ng/mL) 刺激24 h，收集細(xì)胞。此外， LMB (10 nmol/L) 在TGF-β1處理前2 h刺激細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞免疫熒光及高內(nèi)涵分析

將細(xì)胞接種至96孔板中，接種密度為4×103個(gè)/孔；細(xì)胞過(guò)夜貼壁后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 多聚甲醛 4 ℃ 固定細(xì)胞(30 min)；PBS洗3次，每次5 min；使用含0.5%(體積分?jǐn)?shù)) Triton X-100 的PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破膜處理(15 min)；經(jīng)PBS洗3次×5 min后，使用 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 牛血清白蛋白于 37 ℃ 封閉30 min；HuR單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，1∶200)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育(4 ℃ 過(guò)夜)，同時(shí)設(shè)置不加抗體組作為陰性對(duì)照組；用PBS洗3次×5 min后加入Cy3標(biāo)記的兔抗小鼠 IgG(美國(guó)Jackson Immunoresearch公司，1∶100)于 37 ℃ 孵育1 h；使用核酸染料DAPI(10 μg/mL)染色5 min后，PBS洗3次×5 min；將96孔板用高內(nèi)涵分析儀(Cell Insight Personal Cell Imager)10×物鏡觀(guān)察并拍照；最后采用分析軟件(Thermo Scientific Cellomics iDEV Software)分析所獲取的圖像結(jié)果。

1.2.3細(xì)胞質(zhì)/胞核蛋白的分離提取

將細(xì)胞接種至60 mm培養(yǎng)皿中，接種密度為4×105個(gè)/皿；細(xì)胞過(guò)夜貼壁后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。收集細(xì)胞；每樣品加入100 μL Buffer A (pH=7.9 10 mmol/L HEPES，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，2 mmol/L PMSF，1 μg/mL Aprotinin，1 μg/mL Leupetin)，冰浴15 min；加入12.5 μL 2.5%(體積分?jǐn)?shù))NP-40，輕彈混勻；4 ℃，4 000 r/min 離心5 min，小心吸取上清液即為胞質(zhì)蛋白。將提取胞質(zhì)蛋白所余沉淀用Buffer A洗2～3次以除去殘留的胞質(zhì)蛋白；加入50 μL Buffer C (pH=7.9 20 mmol/L HEPES，0.45 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，2 mmol/L PMSF，1 μg/mL Aprotinin，1 μg/mL Leupetin)，4 ℃ 混懸15 min；4 ℃，14 000 r/min 離心10 min，上清即為胞核蛋白。

1.2.4Western blotting及定量分析

對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量后，分別取50 μg胞質(zhì)蛋白及5 μg胞核蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)變性處理(99℃，10 min)；隨后進(jìn)行聚丙稀酰胺凝膠電泳(80 V，2 h)及濕式轉(zhuǎn)印(250 mA，1.5 h)；將PVDF膜用含5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 脫脂奶粉的TBS(20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5，150 mmol/L NaCl)室溫封閉1 h；使用HuR抗體(1∶1 000)、Tubulin抗體(美國(guó)Cell Signaling公司，1∶1 000)或HDAC1抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，1∶250)4℃ 孵育過(guò)夜；TBS漂洗3次，每次5 min；加入IRDyeTM 800標(biāo)記的二抗(美國(guó) LI-COR 公司，1∶10 000)于室溫孵育1 h；TBS漂洗3次，每次5 min；使用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)直接對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描成像。最后對(duì)Western blotting 條帶進(jìn)行定量分析：將Western blotting結(jié)果的圖像文件，用Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)計(jì)算單位吸光度值和條帶面積，將各實(shí)驗(yàn)樣品的總吸光度值與內(nèi)參照 β-Tubulin或HDAC1進(jìn)行比較，得到相對(duì)百分?jǐn)?shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1HuR在LX-2中的表達(dá)

免疫熒光結(jié)果顯示，在LX-2中有HuR蛋白表達(dá)，且主要定位于細(xì)胞核中(圖1)。

2.2使用HCA對(duì)HuR的核質(zhì)分布進(jìn)行鑒定

使用TGF-β1對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后進(jìn)行免疫熒光染色，可見(jiàn)HuR蛋白從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)中。同時(shí)使用核轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制物L(fēng)MB對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，可明顯阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的HuR蛋白出核(圖2A)。使用HCA對(duì)細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中的總熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析也得到了同樣的結(jié)果，經(jīng)TGF-β1處理后，HuR蛋白的質(zhì)/核比為對(duì)照組的1.47倍，而在LMB預(yù)處理細(xì)胞中，HuR蛋白的質(zhì)/核比基本沒(méi)有改變(1.06倍)(圖2B，表1)。

圖1　HuR蛋白在LX-2中的表達(dá)

The representative images of immunostaining for HuR (red) in LX-2. Cells were co-stained with DAPI to identify nuclei (blue). Scale bars=25 μm. Ctrl: control.

圖2　高內(nèi)涵分析方法分析HuR蛋白在LX-2中的核質(zhì)分布

A：representative images of immunofluorescence； B：immunostaining for HuR (Red) counted by high content analysis.*P<0.05vscontrol group,n=3;#P<0.05vsTGF-β1 group,n=3. Ctrl: control; TGF-β1: transforming growth factor-β1; LMB: lemptomycin B；HCA：high content analysis.

表1HCA法檢測(cè)不同處理組細(xì)胞中HuR蛋白的質(zhì)/核比分析

GroupCytoplasmicfluorescenceintensityNuclearfluorescenceintensityCytoplasmic/nuclearControl22080．29±255．9664944．32±5217．760．34±0．03TGF?β129235．23±1953．1158130．17±3299．440．50±0．05?LMB22022．61±1900．6170800．96±4461．740．31±0．03HGF?β1/LMB24034．80±260．8765998．65±3046．500．36±0．02Δ　　Dataarepresentedasthex±SEderivedfromatleastthreeindependentexperiments．?P<0．05vscon?trolgroup，n=3；△P<0．05vsTGF?β1group，n=3．HCA：highcontentanalysis；TGF?β1：transforminggrowthfactor?β1；LMB：lemptomycinB．

2.3使用Western blotting法對(duì)HuR的核質(zhì)分布進(jìn)行鑒定

使用TGF-β1及LMB對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理后，分別提取胞質(zhì)及胞核蛋白進(jìn)行Western blotting法分析，TGF-β1誘導(dǎo)了HuR蛋白出核(4.18倍)而LMB可明顯阻斷此過(guò)程(0.96倍)(圖3,表2)。

圖3　Western blotting法分析HuR蛋白在LX-2中的核質(zhì)分布

LX-2 were pre-treated with LMB (10 nmol/L) for 2 hours and followed by TGF-b1 treatment for 24 hours. Cytoplasmic or nuclear HuR (cyto-HuR or nuc-HuR) protein expressions were evaluated by Western blotting analysis. The intensity of each band was quantified and normalized to b-Tubulin or HDAC1. TGF-β1: transforming growth factor-β1; LMB: lemptomycin B; HDAC1: histone deacetylase 1; Cyto-HuR: cytoplasmic HuR protein; Nuc-HuR: nuclear HuR protein.

表2Western blotting法檢測(cè)不同處理組細(xì)胞中HuR蛋白的質(zhì)/核比分析

GroupCytoplasmicHuRNuclearHuRCytoplasmic/nuclearControl1．00±0．001．00±0．001．00±0．00TGF?β11．96±0．13?0．47±0．05?4．18±0．14?LMB1．01±0．111．02±0．120．99±0．08TGF?β1/LMB0．99±0．09△1．03±0．05△0．96±0．12△

*P<0.05vscontrol group,n=3；△P<0.05vsTGF-β1 group,n=3; TGF-β1: transforming growth factor-β1; LMB: lemptomycin B.

3　討論

RNA結(jié)合蛋白HuR，又被稱(chēng)為HuA，是胚胎致死異常視覺(jué)樣蛋白家族的重要成員，幾乎可以在所有的組織中表達(dá)[4]。通過(guò)識(shí)別并結(jié)合位于mRNA上的AU-富集元件，HuR可以調(diào)節(jié)靶mRNA的剪接加工、成熟mRNA向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移、mRNA的穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程[5-8]。細(xì)胞中，HuR既可以位于細(xì)胞核內(nèi)，也可以出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，且其不同的核質(zhì)定位賦予了HuR不同的生物學(xué)功能[9]。因此，如何分析鑒定HuR蛋白在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中的分布對(duì)于研究其功能有著至關(guān)重要的作用。目前已有報(bào)道[10]指出，TGF-β1可誘導(dǎo)HuR蛋白向細(xì)胞質(zhì)中富集，因此本實(shí)驗(yàn)使用TGF-β1誘導(dǎo)HuR的出核，并使用核轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制物L(fēng)MB對(duì)此過(guò)程進(jìn)行阻斷。結(jié)果證實(shí)，TGF-β1可誘導(dǎo)HuR蛋白由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，而LMB可阻斷此過(guò)程。

高內(nèi)涵分析以微板(96孔板)作為實(shí)驗(yàn)載體，細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色后，通過(guò)熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行信息采集，并經(jīng)專(zhuān)用分析系統(tǒng)進(jìn)行多指標(biāo)數(shù)據(jù)分析，最終可高效率地獲取細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的綜合細(xì)胞學(xué)信息。HCA具有全自動(dòng)、多靶點(diǎn)、可定量、靈敏、多參數(shù)等特點(diǎn)。目前，HCA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于藥物篩選、細(xì)胞信號(hào)通路研究、腫瘤學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、干細(xì)胞研究等諸多領(lǐng)域[1-3, 11]。本實(shí)驗(yàn)使用HCA法及Western blotting法對(duì)蛋白質(zhì)的出核轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法均可檢測(cè)到HuR蛋白的出核轉(zhuǎn)運(yùn)。經(jīng)定量分析，HCA法檢測(cè)到的HuR蛋白質(zhì)/核比升高倍數(shù)小于Western blotting法。但與Western blotting法相比，HCA法依然具有極大優(yōu)勢(shì)：

1)定量分析準(zhǔn)確、客觀(guān)：使用Western blotting法進(jìn)行定量分析時(shí)，需要分別計(jì)算條帶的單位吸光度值和條帶面積，將各實(shí)驗(yàn)樣品的吸光度值與內(nèi)參照b-Tubulin或HDAC1進(jìn)行比較，繼而得到相對(duì)百分?jǐn)?shù)，在此過(guò)程中容易產(chǎn)生較大的誤差，且在計(jì)算時(shí)，人為因素也會(huì)對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生較大影響，因此Western blotting法并不能對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行完全準(zhǔn)確的定量分析；而HCA法最大限度的排除了人為偏差，由儀器自動(dòng)、客觀(guān)的按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大量細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行觀(guān)察和分析，從圖像中得到細(xì)胞群體的定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果，因此結(jié)論更為精確。

2)實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短：當(dāng)使用傳統(tǒng)的Western blotting法對(duì)蛋白質(zhì)的核質(zhì)定位進(jìn)行分析時(shí)，需要分別提取胞質(zhì)蛋白及胞核蛋白，全部實(shí)驗(yàn)需要耗時(shí)3～4 d完成；而HCA法僅需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，之后的信息采集及數(shù)據(jù)分析可由儀器全自動(dòng)完成，實(shí)驗(yàn)操作減少，在2 d內(nèi)即可完成全部實(shí)驗(yàn)。

3)高通量，節(jié)約成本:除操作簡(jiǎn)單且實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短以外，HCA法可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。以96孔板為例，使用HCA法分析蛋白質(zhì)核質(zhì)分布時(shí)，一次實(shí)驗(yàn)可最多完成32種不同處理(每組設(shè)3個(gè)平行樣本)的檢測(cè)；若使用Western blotting法完成同樣數(shù)量的樣品檢測(cè)，工作量將大大增加。同時(shí)，使用Western blotting法檢測(cè)蛋白質(zhì)核質(zhì)定位時(shí)，需要4×105～1×106個(gè)細(xì)胞才可保證蛋白濃度足以完成實(shí)驗(yàn)，而HCA法僅需2×103～4×103個(gè)細(xì)胞即可，所需細(xì)胞量的減少及培養(yǎng)體系的縮小可極大的節(jié)約實(shí)驗(yàn)耗材及試劑用量,最大限度地減少了實(shí)驗(yàn)成本。

4)可進(jìn)行多參數(shù)分析:當(dāng)使用HCA法對(duì)蛋白質(zhì)核質(zhì)定位進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，除分析細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)熒光染色強(qiáng)度以外，還可獲取蛋白質(zhì)的免疫熒光染色圖片。經(jīng)不同的程序設(shè)定，HCA法可完成對(duì)同一批細(xì)胞樣品其他生物學(xué)參數(shù)的分析，例如單個(gè)細(xì)胞圖像和各項(xiàng)指標(biāo)、細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的改變、核質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化等。而Western blotting法僅可完成對(duì)蛋白質(zhì)含量的定性及半定量分析，顯然無(wú)法在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)完成上述內(nèi)容。

綜上所述，使用HCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)核質(zhì)定位具有定量準(zhǔn)確、客觀(guān)、成本低、操作簡(jiǎn)便、快捷、多參數(shù)等特點(diǎn)，不失為傳統(tǒng)Western blotting法的有效補(bǔ)充及替代方法。

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編輯慕萌

， E-mail：changna@ccmu.edu.cn

Comparison between different methods to detect the subcellular localization of proteins

Ji Xiaofang1, Li Liying2, Chang Na2*

(1.Grade2011inDepartmentofBasicMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China; 2.DepartmentofCellBiology,SchoolofBasicMedicalSciences,MunicipalLaboratoryforLiverProtectionandRegulationofRegeneration,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo compare different methods for detecting the subcellular localization of proteins. MethodsUsing high content analysis to count the cytoplasmic or nuclear fluorescence intensity of proteins. ResultsCytoplasmic or nuclear proteins were separated and detected by Western blotting. ConclusionThe cytoplasmic translocation of protein was detected by these two different methods conclusion high content analysis is better than Western blotting for detecting the subcellular localization of proteins.

high content analysis; Western blotting; subcellular localization of protein

國(guó)家自然科學(xué)基金(31301154)，北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IDHT20150502)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (31301154), Project of Construction of Innovative Teams and Teacher Career Development for Universities and Colleges Under Beijing Municipality (IDHT20150502).

時(shí)間：2016-10-1611∶00

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1100.046.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.012]

Q 26

2016-03-01)