楊慧萍 劉雅莉 婁 倩 劉妮妮

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，林學(xué)院，楊凌 712100)

葡萄風(fēng)信子谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因克隆與表達(dá)分析

楊慧萍 劉雅莉*婁 倩 劉妮妮

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，林學(xué)院，楊凌 712100)

以亞美尼亞葡萄風(fēng)信子為材料，利用本課題組前期獲得的葡萄風(fēng)信子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，根據(jù)已經(jīng)獲得的葡萄風(fēng)信子GST基因片段，通過PCR技術(shù)克隆得到葡萄風(fēng)信子GST基因的cDNA序列，命名為MaGST。MaGST的cDNA全長為711 bp，開放閱讀框為666 bp，編碼221個氨基酸，推測蛋白質(zhì)分子量為54.1 kD，理論等電點pI為5.13。利用生物信息分析軟件對MaGST基因進(jìn)行同源性比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，結(jié)果顯示該基因編碼的氨基酸具有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶典型的C端與N端雙結(jié)構(gòu)域，屬于GST Tau家族蛋白；與洋蔥和小麥GST基因的一致性分別為76.72%和62.50%。實時定量PCR結(jié)果顯示MaGST在葡萄風(fēng)信子各組織器官表達(dá)強(qiáng)度相似，屬于組成型表達(dá)；水楊酸(SA)可以明顯誘導(dǎo)MaGST表達(dá)，MaGST對氯化鈉(NaCl)應(yīng)答不是很明顯，甚至表達(dá)量有稍微的下調(diào)。

亞美尼亞葡萄風(fēng)信子；谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶；克??；熒光實時定量PCR；脅迫

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(gultathione S transferase,GST)作為一組由多基因編碼的多功能蛋白酶，參與到許多內(nèi)源性或外源性毒素的解毒過程[1]。GST可以催化還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)與各種親電化合物進(jìn)行親核加成反應(yīng)[2]，然后將代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到液泡內(nèi)從而起到解毒的作用。根據(jù)GST所編碼氨基酸序列的結(jié)構(gòu)、底物的特異性以及免疫的特異性，可以分為lambda、phi、tau、dhar、theta和zeta六類[3]，而lambda、phi、tau三類為植物所特有。GST蛋白參與到細(xì)胞內(nèi)一些生長激素、花青素的運輸，代謝物質(zhì)的合成，也受多種環(huán)境因子的脅迫誘導(dǎo)，在植物的生長發(fā)育、次生代謝中有很重要的作用[4]。在模擬酸雨脅迫下，青花菜GST基因的表達(dá)量在脅迫初期顯著增大，隨時間延長開始下降表明其參與了青花菜抗酸雨的應(yīng)答反應(yīng)[5]；周向紅在對條斑紫菜的研究中發(fā)現(xiàn)GST基因可以參與對鉛的解毒過程[6]；橡膠樹HbGSTU1的表達(dá)受割膠、傷害、低溫、2,4-D、乙烯利和死皮病等因素調(diào)控，但對JA、SA和ABA處理的應(yīng)答不明顯[7]。另外Nobuhiro Sasaki在對康乃馨的研究中發(fā)現(xiàn)DcGST在花色素積累運輸中起著重要作用[8]；基因敲除和互補(bǔ)實驗證明仙客來CkmGST3參與花青素的運輸[9]。

葡萄風(fēng)信子(Muscariarmeniacum)是風(fēng)信子科(Hyacinthaceae)葡萄風(fēng)信子(Muscari)屬春季球根花卉，具有很重要的觀賞、生態(tài)與科研價值。目前關(guān)于葡萄風(fēng)信子的研究主要集中于組織培養(yǎng)[10]，色素成分分析[11]方面，但是關(guān)于葡萄風(fēng)信子屬植物有關(guān)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的基因研究還未見報道，一定程度上限制了對葡萄風(fēng)信子屬植物更加廣泛深入的研究。

本實驗室前期結(jié)合轉(zhuǎn)錄譜和代謝組學(xué)技術(shù)從葡萄風(fēng)信子花組織器官數(shù)據(jù)庫中篩選到了一條GST候選基因序列。本研究利用PCR技術(shù)克隆到了葡萄風(fēng)信子的這條GST基因，熒光實時定量PCR分檢測其在根、莖、葉和不同發(fā)育時期花器官中的表達(dá)情況，并對其進(jìn)行了脅迫分析，為進(jìn)一步研究該基因調(diào)控機(jī)理和功能奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA第一條鏈的合成

根據(jù)北京百泰克生物技術(shù)有限公司的多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒說明書(BioTeKe)操作說明分別提取不同組織及花中的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的完整性，并用NanoDrop微量紫外分光光度計(Nanodrop Technologies Inc,Delaware,USA)檢測樣品純度和濃度。

使用Prime Script RT reagent Kit(TaKaRa公司)，以提取的RNA為模板，Oligo(dT)為引物，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2.2 葡萄風(fēng)信子MaGST基因全長克隆

利用葡萄風(fēng)信子轉(zhuǎn)錄普測序獲得的GST基因序列設(shè)計特異性引物MaGST-1/MaGST-2擴(kuò)增其全長。引物設(shè)計采用軟件Primer 5.0進(jìn)行，合成由北京奧科鼎盛生物科技有限公司負(fù)責(zé)。以反轉(zhuǎn)錄的‘亞美尼亞’花瓣cDNA為模板進(jìn)行PCR全長擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。電泳檢測后回收與預(yù)期片段大小一致的條帶，連接到克隆載體pMD18-T Vector(TaKaRa公司)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliTop10(天根生化科技有限公司)，經(jīng)藍(lán)、白斑篩選陽性克隆后送交北京奧科生物科技有限公司進(jìn)行測序分析。

1.2.3 葡萄風(fēng)信子MaGST基因生物信息學(xué)分析

將獲得的MaGST基因序列在NCBI的ORF finder預(yù)測開放讀碼框，并進(jìn)行BLAST搜索，對葡萄風(fēng)信子MaGST基因序列及其編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析；利用DNAMAN軟件對MaGST基因全長cDNA序列進(jìn)行分析，獲得該序列的氨基酸序列、分子量和等電點等，并且根據(jù)獲得的氨基酸序列進(jìn)行同源比對分析；利用Predict Protein對蛋白質(zhì)的二維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 葡萄風(fēng)信子MaGST基因時空表達(dá)模式分析

根據(jù)MaGST基因序列設(shè)計實時定量引物MaGST-3/MaGST-4，內(nèi)參基因為Actin。分別取亞美尼亞葡萄風(fēng)信子根、莖、葉以及不同發(fā)育時期花蕾的總RNA各1 μL，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)(TaKaRa公司)實時熒光定量操作說明書進(jìn)行操作，利用IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System實時定量PCR儀檢測花蕾不同發(fā)育時期與不同組織部位MaGST的相對表達(dá)量，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。RT-PCR擴(kuò)增體系為10 μL SYBR Premix EX TaqTMⅡ(2×)，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 1 μL，無菌水8.4 μL。RT-PCR擴(kuò)增程序為95℃變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。Excel 2010和Origin 8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行計算和處理，采用2-ΔΔCT法[12]分析該基因的相對表達(dá)情況。

1.2.5 脅迫條件下MaGST基因的表達(dá)分析

分別以反轉(zhuǎn)錄的亞美尼亞葡萄風(fēng)信子根、莖、葉以及水楊酸(SA)和氯化鈉(NaCl)處理的5個發(fā)育時期的花瓣混合物、根、莖、葉的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR分析。RT-PCR擴(kuò)增體系為10 μL SYBR Premix EX TaqTMⅡ(2×)，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 1 μL，無菌水8.4 μL。RT-PCR擴(kuò)增程序為95℃變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。Excel 2010和Origin 8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行計算和處理，采用2-ΔΔCT法分析該基因的相對表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄風(fēng)信子MaGST基因全長cDNA克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄普測序所得到的基因序列設(shè)計引物MaGST-1/MaGST-2，以亞美尼亞葡萄風(fēng)信子花瓣cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到一條長為711 bp的cDNA片段(圖1:B)。測序結(jié)果表明其開放閱讀框長666 bp，編碼221個氨基酸，命名為MaGST。

表1亞美尼亞葡萄風(fēng)信子MaGST基因克隆與表達(dá)分析所用序列

Table1PrimersequencesingenecloningandexpressionanalysisofM.armeniacum

名稱Name序列Sequence用途UsageMaGST?1AGAGAAGCAGAAAGCATAGATAGTCAGMaGST?2GGTATGGAGTGGAGTAGAGCATGAAAATG全長克隆cDNAcloningMaGST?3CCCGTCTGCGAGTCCCTCATCAMaGST?4CGACAAACCCGAATGAATCGCCAC熒光實時定量Real?timePCR

圖1 葡萄風(fēng)信子MaGST基因PCR電泳檢測 A.葡萄風(fēng)信子花瓣RNA電泳檢測；B.葡萄風(fēng)信子MaGST基因全長擴(kuò)增結(jié)果；M. DL5000 DNA Maker；1～2. PCR全長擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of MaGST genes fragments from M.armeniacum A.Agarose gel electrophoresis analysis of RNA from M.armeniacum petals; B.The full length of MaGST cDNA amplification; M.DL5000 DNA Maker; 1-2. Represent two replications

2.2 葡萄風(fēng)信子MaGST基因生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN軟件對MaGST基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示MaGST理論分子量為54.10 kD，理論等電點pI為5.13。在溶液中MaGST的不穩(wěn)定指數(shù)為39.66，略低于域值40，可能屬于穩(wěn)定蛋白。此外，MaGST的脂肪族系數(shù)為23.87，總疏水系數(shù)為0.775，蛋白質(zhì)總體疏水性較強(qiáng)，并且發(fā)現(xiàn)在水溶液中MaGST可能折疊成一個緊密的的球狀分子。

TMHMM2.0預(yù)測該蛋白不具跨膜區(qū)，蛋白全部在膜外，屬于胞外蛋白。SignalP 4.1分析顯示該序列N端無信號肽，屬于非分泌性蛋白。利用PSORT Ⅱ Prediction對MaGST進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，定位信號主要集中在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在細(xì)胞壁內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了定位信號。用NetPhos 2.0預(yù)測MaGST磷酸化位點，MaGST有11個Thr磷酸化位點。PredictProtein預(yù)測MaGST的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白包含了50.68%的α螺旋和3.17%的延伸鏈，其cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列如圖2所示。使用SWISS-MODEL在線預(yù)測MaGST蛋白的三級結(jié)構(gòu)，并以水稻OsGST1的編碼的蛋白為模型，發(fā)現(xiàn)MaGST蛋白具有明顯的雙結(jié)構(gòu)域，C端結(jié)構(gòu)域有7個α螺旋，而N端結(jié)構(gòu)域具有3個α螺旋和4個β折疊(圖3)。

圖2 MaGST基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of MaGST

利用Blastp在線分析MaGST的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)該蛋白7～80位置為GST-N-Tau結(jié)構(gòu)域，具有3個保守結(jié)構(gòu)域或活性結(jié)合位點：谷胱甘肽(GSH)結(jié)合位點(G-site)；一個可結(jié)合多肽的二聚體面，一個C端多肽結(jié)合域。位于91～214的部分為GST-C-Tau結(jié)構(gòu)域，屬于GST-C-Phi亞家族GST-C家族，該段蛋白序列包含一個結(jié)合多肽的二聚體面，一個底物結(jié)合位點(H-site)和一個N端多肽結(jié)合域(圖4)。

將葡萄風(fēng)信子MaGST與NCBI檢索到的其他物種GST蛋白進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖5顯示MaGST蛋白與洋蔥(AlliumcepaBAK222528.1)聚為一類親緣關(guān)系較近為76.72%，與粟(SetariaitalicaXP004981530.1)、玉米(ZeamaysNP001146786.1)、小麥(TriticumaestivumXP002532823.1)聚類較近，分別為65.95%、62.07%、62.50%，與煙草(NicotianatabacumP25317)、葡萄(VitisviniferaABL84692.1)等雖然有同源性但是聚類較遠(yuǎn)。

2.3 葡萄風(fēng)信子MaGST基因的時空表達(dá)模式分析

為了研究MaGST在不同組織器官以及不同花發(fā)育時期中的時空表達(dá)，進(jìn)行了熒光實時定量分析。結(jié)果顯示(圖6)，MaGST基因在各組織器官都有表達(dá)。在花發(fā)育中除了S1與S3時期，其他時期表達(dá)量基本相近；在營養(yǎng)組織中根的表達(dá)量最高，其次是葉，而莖中的表達(dá)量最低且低于花器官S1與S3時期。由此可見MaGST在亞美尼亞葡萄風(fēng)信子中的表達(dá)不具有組織特異性屬于組成型表達(dá)。

圖4 葡萄風(fēng)信子MaGST與其他植物GST同源性比對 —.N端和C端保守結(jié)構(gòu)域；▽.GSH結(jié)合殘基；▼.底物結(jié)合位點；☆.位于G位點或H位點的保守氨基酸殘基Fig.4 Alignment of MaGST with other GSTs —.The N-terminal and C-terminal domain; ▽.The GSH binding sites; ▼.The substrate binding pocket; ☆.Amino acids with asterisks indicate the conserved residues of the G-site or H-site

2.4不同處理對葡萄風(fēng)信子MaGST基因的表達(dá)分析

以未處理的植株為對照組，利用不同處理形成人為的環(huán)境脅迫研究MaGST的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，在高鹽和激素處理條件下，MaGST在轉(zhuǎn)錄水平上呈現(xiàn)出不同程度的差異表達(dá)。2 mmol·L-1水楊酸(SA)處理植株明顯提高植株根和莖組織器官中MaGST的表達(dá)量，分別是對照組的8.36倍、5.87倍，但是在處理組花瓣和葉片中MaGST的表達(dá)量有所降低。氯化鈉(NaCl)對亞美尼亞植株進(jìn)行處理結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了在花器官MaGST表達(dá)量增加外其他組織部位表達(dá)量均是小幅度的下調(diào)。以上結(jié)果說明MaGST基因使誘導(dǎo)型表達(dá)，并且具有組織表達(dá)差異，水楊酸(SA)能夠在轉(zhuǎn)錄水平激起MaGST的相應(yīng)信號，保護(hù)組織免受傷害。

圖5 幾種植物GST氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹 標(biāo)尺代表遺傳距離；數(shù)值代表從1000次重復(fù)計算得到的bootstrap百分比值Fig.5 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequence of flavonol synthase in different plants The scale bar represents genetic distance; Numbers represent the bootstrap percentage values calculated from 1 000 replicates.

圖6 MaGST在亞美尼亞葡萄風(fēng)信子不同組織部位的表達(dá)Fig.6 Different expression level of MaGST gene in different organs of M.armeniacum

圖7 亞美尼亞MaGST在脅迫下的相對表達(dá)量Fig.7 Different expression level of MaGST gene in of M.armeniacum under environment stress

3 討論

早期關(guān)于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因GST的研究表明，GST對于底物的特異性選擇是由兩個基本的功能域決定，分別是位于N端的GSH結(jié)合位點(G-site)和位于C端的結(jié)合親電化合物底物的作用位點(H-site)[13]。Frear D S最早在玉米中發(fā)現(xiàn)GST基因，并且發(fā)現(xiàn)其參與了花青素的運輸[14]，隨后在擬南芥[15]、康乃馨[16]、棉花[17]、瓜葉菊[18]等物種中分離到了GST基因。本研究首次從葡萄風(fēng)信子‘亞美尼亞’中獲得GST基因，對MaGST進(jìn)行序列和理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明MaGST與其他植物的GST高度一致，具有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶典型的雙保守域以及G-site和H-site保守的氨基酸殘基。同源比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，葡萄風(fēng)信子MaGST與洋蔥AcGST親緣關(guān)系最近，且屬于Tau類GST。

對亞美尼亞葡萄風(fēng)信子各個組織器官與不同花瓣發(fā)育時期進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果在各個部位都檢測到了MaGST表達(dá)，為組成型表達(dá)基因。值得注意的是，在花瓣發(fā)育S2時期即花瓣開始著色時期，MaGST的表達(dá)水平出現(xiàn)了一個明顯的上升。已有研究發(fā)現(xiàn)瓜葉菊ScGST3[19]、山葡萄VAmGST4[20]等植物的GST基因與花色苷的合成密切相關(guān)，參與到花色苷的積累運輸過程。因此S2時期引起MaGST高表達(dá)的原因推測可能是因為S2時期是花青素合成最旺盛的時期，花青素開始大量積累，由于花青苷高的生物化學(xué)活性會對細(xì)胞造成一定程度的傷害，因此需要MaGST將花青苷轉(zhuǎn)移到液泡和細(xì)胞壁內(nèi)，導(dǎo)致MaGST表達(dá)量明顯增加。S3時期MaGST表達(dá)量相較于S2時期有所下降，到了S4時期又大量增加，原因可能是因為在花瓣著色結(jié)束之后花瓣開放過程中受到授粉、紫外線等的影響誘導(dǎo)MaGST的表達(dá)。另外在本研究中水楊酸(SA)對MaGST的上調(diào)作用其原因也可能是因為環(huán)境脅迫引起花色苷在細(xì)胞質(zhì)中大量合成，細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，引起MaGST等相關(guān)酶的合成，將花色苷運輸?shù)揭号葜?，然后在液泡中固定、貯存，從而達(dá)到穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的目的。

本研究通過熒光定量發(fā)現(xiàn)MaGST經(jīng)水楊酸(SA)處理過后MaGST的表達(dá)量明顯升高，尤其在根部表達(dá)量達(dá)到對照組的8.36倍，高于莖和葉片中的表達(dá)量，而在非誘導(dǎo)條件下以及氯化鈉(NaCl)處理下根、莖、葉中的表達(dá)量相近，這說明MaGST參與亞美尼亞葡萄風(fēng)信子對水楊酸(SA)的脅迫應(yīng)答。早在1994年就有研究指出水楊酸并不是系統(tǒng)獲得抗性的信號分子[21]，而是由水楊酸結(jié)合蛋白(salicylic-acid-binding protein SABP2)與水楊酸結(jié)合后形成脂溶性分子，表現(xiàn)出脂酶活性，繼而引發(fā)一系列的抗性反應(yīng)[22]。另外我們推測該基因的啟動子區(qū)域可能含有調(diào)控順式元件，受水楊酸(SA)的誘導(dǎo)。Wenqiong Chen等發(fā)現(xiàn)擬南芥GST6基因的啟動子區(qū)域含有ocs元件，在水楊酸和過氧化氫誘導(dǎo)下其表達(dá)活性明顯升高，且主要在根部表達(dá)[23]。

GST基因是一份具有多功能的基因，涉及到許多生化反應(yīng)，目前對于GST在植物中功能以及如何進(jìn)行抗逆的分子機(jī)制不是很清楚，本研究克隆了一個MaGST基因，為深入研究該基因功能和遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)，并且對于葡萄風(fēng)信子抗逆分子育種提供一個新的方向進(jìn)行深入研究。鑒于GST是一個多基因的家族，因此對其他GST基因的克隆與表達(dá)分析，全面分析其理化性質(zhì)和作用機(jī)理將是我們下一步工作的內(nèi)容。

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CloneandCharacterizationofAGlutathione-s-transferaseGeneinMuscariarmeniacum

YANG Hui-Ping LIU Ya-Li*LOU Qian LIU Ni-Ni

(State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas,Key Laboratory of Horticultural Plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest China,Ministry of Agriculture,College of Forestry,Northwest A&F University,Yangling 712100)

Based on the latex the transcriptome database, the full length cDNA of glutathione-S-transferase(GST) fromMuscariarmeniacumwas cloned by reverse-PCR and PCR, designated asMaGST. The full length cDNA ofMaGSTwas 711 bp, and the ORF(Open Reading Frame) length was 666 bp, encoding a protein polypeptide of 221 amino acids with a predicted molecular weight of 54.1 kD and pI of 5.13. By phylogenetic tree analysis, the putativeMaGSTprotein displayed identities to the GSTs ofAlliumcepaandTriticumaestivumof 76.72% and 62.50%, respectively, and contained the Tau GST-specific N-terminal domain(G site) and the C-terminal domain(H site), belonging to the family of GST Tau. By real-time PCR, the expression pattern ofMaGSTin different organs were similar, belonging to constitutive expression. The expression ofMaGSTwas regulated by salicylic acid, but not by the NaCl.

Muscariarmeniacum;glutathione-s-transferase;clone;florescent real-time quantitative PCR;environment stress

國家自然科學(xué)基金(31170652)

楊慧萍(1990—)，女，碩士研究生，主要從事園林植物分子育種的研究。

* 通信作者：E-mail:lyl6151@126.com

2015-01-13

S330

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.019