王夢亮 焦 晉,2 邢 婕 田俊生 崔晉龍* 王俊宏

(1.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，太原 030006； 2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，太原 030006； 3.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原 030006)

內(nèi)生真菌ZPRa-R-1對紅景天中關(guān)鍵信號分子及主要次生代謝物的影響

王夢亮1焦 晉1,2邢 婕3田俊生3崔晉龍1*王俊宏1

(1.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，太原 030006；2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，太原 030006；3.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原 030006)

研究內(nèi)生真菌ZPRa-R-1對大花紅景天組培苗中信號分子NO,SA和H2O2,及主要次生代謝物酪醇(p-tyrosol)和紅景天苷(salidroside)積累的影響。分別采用Greiss試劑法、RP-HPLC熒光法、硫酸鈦法檢測NO,SA和H2O2等信號分子；采用分光光度法檢測關(guān)鍵酶PAL和CA4H的活性；采用RP-HPLC檢測酪醇和紅景天苷。ZPRa-R-1接種于紅景天,首先引起宿主信號分子NO含量增高,其次是SA和H2O2,它們達(dá)到最大值的時間分別是共生后第8,10和12 d,含量分別為0.193 μmol·g-1,0.062 μg·g-1,0.092 μmol·g-1；關(guān)鍵酶PAL和CA4H活性最大值分別為166.400 U·g-1和0.625 U·g-1·h-1，分別是對照組的8和1.5倍，最終引起酪醇和紅景天苷的積累效應(yīng),在第8和10 d達(dá)到最大值,含量分別為8.656和0.498 mg·g-1，是對照組的7和2.8倍。研究結(jié)果表明內(nèi)生真菌ZPRa-R-1能通過誘導(dǎo)激活宿主信號分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，引起關(guān)鍵酶活性的變化，進(jìn)而調(diào)控酪醇和紅景天苷等次生代謝物的積累。

紅景天；內(nèi)生真菌；信號分子；酪醇；紅景天苷

大花紅景天(Rhodiolacrenulata)是我國《藥典》收錄的中藥紅景天指定的唯一基原植物，其主要功效為“益氣活血，通脈平喘”，用于治療“氣虛血瘀，胸痹心痛，中風(fēng)偏癱，倦怠氣喘”[1]；也是近年來用于具有“適應(yīng)原性”化妝品、保健食品的新興植物藥[2]。

自從1993年Stierle等[3]首次報(bào)道了從短葉紫杉(Taxusbrevifolia)樹皮中得到一株能夠產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌(Taxomycesandreanae)以來，內(nèi)生真菌的功能多樣性引起了國內(nèi)外研究人員的高度關(guān)注。近年來，大量研究開始通過真菌誘導(dǎo)子處理植物細(xì)胞培養(yǎng)物，調(diào)控并提高目標(biāo)產(chǎn)物含量，并研究誘導(dǎo)子的作用機(jī)制。文獻(xiàn)表明，內(nèi)生真菌與植物相互作用的過程中，能夠激活許多與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的生理生化反應(yīng)，如離子跨膜運(yùn)輸、活性氧(ROS)合成、蛋白質(zhì)磷酸化和脫磷酸化以及茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)合成等[4～5]；進(jìn)而選擇性地誘導(dǎo)植物特定基因表達(dá)、激活代謝過程中的關(guān)鍵酶的活性，最終導(dǎo)致次生代謝途徑中某些產(chǎn)物積累的變化[6]。這個代謝過程中，各種信號分子對植物次生代謝物合成的調(diào)控過程并非完全獨(dú)立，而是通過特定的應(yīng)答(cross-talk)機(jī)制，形成復(fù)雜的協(xié)調(diào)關(guān)系，最終以特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)形式介導(dǎo)外界因子誘發(fā)次生代謝物的生物合成[7]。本實(shí)驗(yàn)采用前期篩選出的內(nèi)生真菌ZPRa-R-1與宿主大花紅景天共培養(yǎng)，研究宿主中主要信號分子NO,SA和H2O2含量，關(guān)鍵酶PAL和CA4H活性及主要活性成分酪醇和紅景天苷積累的變化規(guī)律，為利用生物因子改善紅景天活性成分積累提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 材料與試劑

紅景天組培苗為山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所建立的大花紅景天組培苗繁殖體系。內(nèi)生真菌ZPRa-R-1經(jīng)本課題組鑒定為瓶頭霉屬(Phialocephalasp.)真菌[8]，其ITS序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，編號為KJ542299。此菌保藏于中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC No.9347)和山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所生物化工實(shí)驗(yàn)室。真菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。酪醇對照品(美國Accu Standard Inc，批號501-94-0)；紅景天苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110818-201005)；水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號100106-201104)；甲醇(美國Fisher公司，色譜純)；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

Agilent1200高效液相色譜儀(手動進(jìn)樣器，四元泵，DAD二極管陣列檢測器，熒光檢測器，在線脫氣機(jī)，美國Agilent公司)；UV2450型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；arium@Pro UF純水系統(tǒng)(德國Sartorius公司)；SW-CJ-IFD雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 內(nèi)生真菌與紅景天組織苗共生培養(yǎng)

無菌條件下，打取直徑為0.5 cm的ZPRa-R-1菌塊，接種于與紅景天組培苗接觸的培養(yǎng)基(MS+0.5 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-1NAA)上，光照培養(yǎng)(光14 h，暗10 h；對應(yīng)溫度28℃，22℃；光照強(qiáng)度30 μmol·m-2·s-1；濕度70%～75%)，不接菌的紅景天組培苗作為對照，每2 d取樣1次，周期為20 d，重復(fù)3次。

醫(yī)藥衛(wèi)生研究事業(yè)的發(fā)展是建立在大量的臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上的，只有經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)證明藥物的有效性，該藥物才能應(yīng)用到醫(yī)院患者的治療中。醫(yī)院進(jìn)行相關(guān)藥物使用情況的反應(yīng)、療效等數(shù)據(jù)，對于藥物改良、藥效提升等都具有重要意義，能夠?yàn)獒t(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展提供數(shù)據(jù)支撐。

2.2 NO含量的測定

采用Greiss試劑法[9]。精確稱取1 g新鮮紅景天組培苗，加入3 mL蒸餾水和少許石英砂，研磨至勻漿，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，4 000 r·min-1下離心20 min，移液槍吸取上清液即為樣品提取液。將樣品提取液:Greiss試劑=1∶1(V∶V),振蕩混勻，室溫下靜置30 min，于550 nm處測定吸光值，在NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算NO含量。

2.3 SA含量的測定

參照陶金華[9]的方法提取SA，用HPLC熒光檢測法測定含量。精確稱取1 g新鮮紅景天組培苗，勻漿，加入1 mL 90%甲醇，漩渦混合器振蕩1 min，10 000×g離心15 min，上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，下層沉淀用0.5 mL 100%甲醇按上述方法重新提取，合并2次上清液，冷凍干燥、濃縮，加入0.5 mL 5%三氯乙酸溶解，振蕩2 min。用0.8 mL醋酸乙酯與環(huán)己烷的混合液(1∶1，V∶V)萃取2次，合并有機(jī)相，冷凍干燥、濃縮。加入0.6 mL液相流動相溶解，用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液即為待測樣品，4℃保存，待測。

色譜條件：色譜柱為Thermo-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μL)；柱溫25℃；進(jìn)樣體積為10 μL；流速為0.5 mL·min-1；流動相為0.2 mol·L-1乙酸鈉緩沖液-甲醇(9∶1，V∶V)，pH5.5。熒光檢測器激發(fā)波長：294 nm，發(fā)射波長：426 nm。

2.4H2O2含量的測定

采用硫酸鈦法[7]。精確稱取1 g新鮮紅景天組培苗，加入5 mL于4℃下預(yù)冷丙酮，冰浴條件下迅速勻漿，在4℃ 10 000 r·min-1下離心20 min。吸取2 mL上清液，加入0.5 mL 5%硫酸鈦，充分混勻，再加入2 mL濃氨水，混勻，在4℃ 10 000 r·min-1下離心15 min，棄上清。用5 mL 2 mol·L-1濃硫酸溶解沉淀，于波長415 nm處測定吸光度。根據(jù)吸光度值，利用H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算H2O2含量。

2.5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定

2.6 肉桂酸-4-羥化酶(CA4H)活性的測定

稱取新鮮紅景天組培苗0.5 g，冰浴研磨后加入5 mL磷酸緩沖液(200 mmol·L-1，pH7.5，2 mmol·L-1β-巰基乙醇),在4℃下以10 000 r·min-1離心15 min。取上清液即為CA4H粗酶提取液。

酶反應(yīng)液組成為：0.2 mL酶提液，4.8 mL磷酸緩沖液(50 mmol·L-1；2 mmol·L-1反式肉桂酸，0.5 mmol·L-1氧化型輔酶鈉鹽NADP，2 mmol·L-1巰基乙醇)。37℃下反應(yīng)1 h后，加入0.1 mL 6 mmol·L-1HCL終止反應(yīng)，取上清液在290 nm比色。對照為不加酶提取液(加入0.8 mL ddH2O)。酶活性表示為U·g-1·h-1，重復(fù)3次。

2.7 次生代謝物含量的測定

采用HPLC檢測次生代謝物含量。將紅景天組培苗在40℃烘干。精確稱取質(zhì)量后置于具塞錐形瓶，按料液比為1∶10(m∶v)加入甲醇溶液浸泡30 min，超聲提取20 min，濾紙過濾。濾渣按上述方法重復(fù)提取2次，合并上述濾液，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮，得濃縮物。用色譜級甲醇定容至一定體積，用0.45 μm尼龍微孔濾膜過濾，置于4℃保存，備用。

色譜條件：色譜柱Thermo-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μL)；柱溫30℃；進(jìn)樣10 μL；流速0.8 mL·min-1；流動相為甲醇-水(32∶68，V∶V)。紫外檢測波長277 nm。

3 結(jié)果與分析

3.1 內(nèi)生真菌對紅景天組培苗中信號分子的影響

圖1 ZPRa-R-1對紅景天組培苗中三種信號分子含量的影響Fig.1 Effects of ZPRa-R-1 on the singnaling molecules in Rhodiola tissue culture seedling inoculated()

內(nèi)生真菌ZPRa-R-1與組培苗作用不同時間后，對紅景天組培苗中NO，SA和H2O2含量的影響分別如圖1所示。內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子在特定時間段內(nèi)可以誘導(dǎo)紅景天組培苗中NO，SA和H2O2含量的增加，但三者產(chǎn)生最高峰的時間不同。紅景天組培苗中NO含量在第8 d達(dá)到第一個最高峰，含量為0.193 μmol·g-1，此時對照組NO含量為0.115 μmol·g-1，處理組NO含量約為對照組的1.6倍。組培苗中SA在第10 d達(dá)到高峰，含量為0.062 μg·ml-1，是同時期對照組的2.5倍左右。紅景天組培苗中H2O2在第12 d達(dá)到最大值，含量達(dá)到0.092 μmol·g-1，對照組H2O2釋放量為0.028 μmol·g-1，前者為后者的3倍。結(jié)果表明，真菌接種紅景天，三種主要信號分子響應(yīng)順序?yàn)镹O，SA和H2O2，它們在接種真菌后第4 d達(dá)到一個低值，之后含量升高到一個峰值，隨之逐漸降低并趨于穩(wěn)定，這可能是宿主對外來刺激的一種防御反應(yīng)。

3.2內(nèi)生真菌對紅景天組培苗中PAL和CA4H活性的影響

紅景天組培苗與內(nèi)生真菌ZPRa-R-1共生20 d后，其關(guān)鍵酶PAL與CA4H活性表現(xiàn)出一定規(guī)律性(圖2)。結(jié)果表明，接入內(nèi)生真菌后，組培苗中合成紅景天苷和酪醇代謝途徑的關(guān)鍵酶PAL及CA4H活性逐漸增加，分別在第10和14 d達(dá)到最大值，且均高于對照組，達(dá)到166.400 U·g-1和0.625 U·g-1·h-1，分別是對照組的8和1.5倍。隨著時間的延長，兩種關(guān)鍵酶的活性又逐步降低。

圖2 ZPRa-R-1對紅景天組培苗中關(guān)鍵酶活性的影響Fig.2 Effects of ZPRa-R-1 on the activities of key enzymes in Rhodiola tissue culture seedling inoculated()

3.3內(nèi)生真菌對紅景天組培苗中主要次生代謝物積累的影響

內(nèi)生真菌ZPRa-R-1接種于紅景天組培苗，能夠引起宿主紅景天主要成分的積累效應(yīng)。結(jié)果表明，主要次生代謝物酪醇和紅景天苷含量發(fā)生了規(guī)律性的變化(圖3)。經(jīng)內(nèi)生真菌處理后，酪醇含量在第8 d達(dá)到最大值8.656 mg·g-1，而對照組為1.174 mg·g-1，處理組含量約為對照組的7倍；紅景天苷含量在第10 d達(dá)到最大值0.498 mg·g-1，此時對照組為0.177 mg·g-1，前者約為后者的2.8倍。這表明內(nèi)生真菌ZPRa-R-1能影響紅景天中紅景天苷和酪醇的積累，在某些時間段內(nèi)具有正向調(diào)節(jié)作用。

圖3 ZPRa-R-1對紅景天中紅景天苷和酪醇含量的影響Fig.3 Effects of ZPRa-R-1on the main secondary metabolites in Rhodiola tissue culture seedling inoculated(n=3,±s)

4 討論

研究表明，內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子并不直接參與植物次生代謝物的合成，它是通過激發(fā)植物細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，進(jìn)而調(diào)控植物次生代謝物的合成。其中，NO和H2O2被認(rèn)為是真菌誘導(dǎo)子誘發(fā)植物防御反應(yīng)的主要信號分子[10～11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NO多為上游信號分子，是信號網(wǎng)絡(luò)中所有信號分子調(diào)控的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[12]，并且是介導(dǎo)微生物誘導(dǎo)子誘發(fā)植物防御反應(yīng)所必須的信號分子之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)生真菌ZPRa-R-1可以在特定時間段顯著影響紅景天組培苗中NO，SA和H2O2等信號分子含量的變化，同時發(fā)現(xiàn)，NO的變化總是優(yōu)先于后兩者，同時產(chǎn)生酪醇和紅景天苷次生代謝途徑的關(guān)鍵酶PAL和CA4H活性也顯著提高，而后，引起關(guān)鍵代謝產(chǎn)物酪醇和紅景天苷積累的變化。根據(jù)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果，人們可以在特定的時間范圍內(nèi)，利用內(nèi)生真菌ZPRa-R-1與宿主紅景天相互作用，激活并調(diào)控關(guān)鍵酶基因表達(dá)，進(jìn)而獲得較高含量的紅景天苷和酪醇。目前為止，人們對此過程中NO的合成及轉(zhuǎn)換機(jī)制、作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)尚不清楚，誘導(dǎo)子如何實(shí)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并進(jìn)一步促進(jìn)植物積累次生代謝物等問題都有待于進(jìn)一步研究。

目前，限制藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵問題之一是細(xì)胞培養(yǎng)中次生代謝物含量偏低的問題。而內(nèi)生真菌用于促進(jìn)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累以及產(chǎn)生新的活性成分，具有繁殖快、生物量大、可塑性強(qiáng)，成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[13]。例如，添加內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子對茅蒼術(shù)懸浮細(xì)胞的生長及揮發(fā)油積累均有促進(jìn)作用,其中β-桉葉醇的量是對照的2.22倍[14]。大戟內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子對大戟中異大戟素的積累有明顯促進(jìn)作用，在內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子處理的第4 d達(dá)到高峰，且是對照組異大戟素含量的2.4倍[15]。這些研究為內(nèi)生真菌對藥用植物活性成分積累的調(diào)控作用提供了實(shí)踐基礎(chǔ)，為改良和馴化藥用植物提供了新的思路。

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EffectsofEndophyticFungiZPRa-R-1ontheKeySingnalMoleculesandtheMainSecondaryMetabolitesinRhodiolacrenulata

WANG Meng-Liang1JIAO Jin2XING Jie3TIAN Jun-Sheng3CUI Jin-Long1*WANG Jun-Hong1

(1.Insititute of Applied Chemistry,Shanxi University,Taiyuan 030006；2.Insititute of Biotechnology, Shanxi University,Taiyuan 030006；3.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine,Shanxi University,Taiyuan 030006)

We studied the effects on the key signal molecules and the main secondary metabolites's content in tissue culture ofRhodiolacrenulatainoculated with endophic fungi ZPRa-R-1. We selected Greiss method, RP-HPLC and Titanium sulfate method to detect the contents of NO, SA and H2O2, respectively, and detected the key enzymes, PAL and CA4H by spectrophotometry.p-Tyrosol and salidroside inRhodiolaseedling co-cultured with fungi were evaluated by RP-HPLC. The content of NO increased firstly, followed by SA and H2O2after thatRhodiolaseedling inoculated with endophic fungi. The maximum contents of NO, SA and H2O2were detected at 8, 10 and 12 d, and they were 0.193 μmol·g-1, 0.062 μg·g-1and 0.092 μmol·g-1, respectively. The maximum contents of PAL and CA4H were 166.400 U·g-1, 0.625 U·g-1·h-1, and were 8 and 1.5 times as much as that of control, repectively. The contents ofp-tyrosol and salidroside were accumulated, and the time of each of them reaching the maximum content was on 8 and 10 d, and the contents were 8.656 and 0.498 mg·g-1, and were 7 and 2.5 times as much as that of control, respectively. Therefore, ZPRa-R-1 has the capacity of regulating signals and promoting the activities of PAL and CA4H, and finally promoted accumulation ofp-tyrosol and salidroside in co-culturing seedling of fungi andRhodiola.

Rhodiolacrenulata;endophytic fungi;signal molecule;p-tyrosol;salidroside

國家自然科學(xué)基金(31270383)；山西省自然科學(xué)基金(2014011029-1)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20121401120001)；林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201304326)

王夢亮(1966—)，男，教授，博士，主要從事生物轉(zhuǎn)化及藥物中間體的合成的研究。

* 通信作者：E-mail:CJL717@163.com

2015-09-29

S567

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.03.015