曹　丹，張愛(ài)梅，韓雪英，伏笑融

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅　蘭州　730070）

鮮橘皮霉變部位主要微生物的檢測(cè)研究

曹丹，張愛(ài)梅*，韓雪英，伏笑融

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

以新鮮橘子為材料，探究鮮橘皮霉變部位存在的主要微生物類(lèi)型。通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化檢驗(yàn)等試驗(yàn)方法，初步判定鮮橘皮霉變部位存在的主要優(yōu)勢(shì)微生物包括3種細(xì)菌和3種霉菌。3種細(xì)菌分別是：枯草芽孢桿菌，短小芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌；3種霉菌分別是：橘青霉、煙曲霉和炭黑曲霉。

鮮橘皮；細(xì)菌；真菌；分離；鑒定

橘子，俗稱(chēng)桔，是起源古老的多年生蕓香科植物，華夏大地是其主要發(fā)源地之一。在中國(guó)，很久以前人們就開(kāi)始食用橘子，并對(duì)其進(jìn)行了人工栽培［1］。橘子酸甜可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，渾身是寶，尤其是橘皮，作用甚多。

橘皮，又名陳皮，新鮮橘皮含有大量的維生素C和香油精，具有理氣化痰，健脾和胃的功能。利用橘子皮泡茶，味道清新還能通氣提神；鮮橘皮還可以用來(lái)治療咳嗽、便秘、睡覺(jué)磨牙、口臭、消化不良及胰腺炎等；另外，食品加工業(yè)利用鮮橘皮制橘皮粥、橘皮茶、橘皮酒、橘皮菜及橘皮果醬等，為其帶來(lái)不少經(jīng)濟(jì)效益［2-3］。

近年來(lái)，對(duì)鮮橘皮的研究主要側(cè)重于其藥用價(jià)值，生物活性及化學(xué)反應(yīng)等方面［4-6］，對(duì)鮮橘皮表面微生物的檢測(cè)較少，而本研究側(cè)重于鮮橘皮霉變部位主要優(yōu)勢(shì)微生物的分離純化和鑒定。通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定和生化鑒定相結(jié)合的手段，對(duì)鮮橘皮霉變部位與正常部位的微生物進(jìn)行比較，找出鮮橘皮霉變部位存在的主要優(yōu)勢(shì)微生物，并對(duì)以后橘皮表面微生物的研究提供一定的參考和依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料

原料：試驗(yàn)原料購(gòu)自蘭州市安寧區(qū)果蔬市場(chǎng)，為市售的同一品種的新鮮橘子。

（二）試劑、儀器與用具

1.試劑。草酸銨結(jié)晶紫、蕃紅、碘液、95%乙醇、香柏油、二甲苯、孔雀綠、甲基紅試劑、溴百里酚藍(lán)、格里斯氏試劑、二苯胺試劑、吲哚試劑、對(duì)二甲基氨基苯甲醛、檸檬酸鐵、檸檬酸鈉、a-萘酚、氫氧化鉀、乙醇、乙醚、二甲基氨基苯甲醛、1 mol/L鹽酸、1 mol/LNaOH、過(guò)氧化氫等。

2.儀器。恒溫水浴鍋（KW-4）：上海必爾得儀器實(shí)業(yè)有限公司；智能型電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9080B）：上海瑯玹實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌鍋（DSX-280B）：上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；封閉式調(diào)溫加熱器（MB-1-1）：北京科偉永興儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（DZ47LE-32 C32）：天津市拉貝爾實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；顯微成像系統(tǒng)（YYP一210）：日本NIKON公司；電子天平CP114（GB/T26497）：奧豪斯儀器（上海）有限公司制造；冰箱（BC-92）：廣東奧馬電器股份有限公司。

3.用具。刀片，接種環(huán)，載玻片，鑷子，濾紙，牙簽，酒精燈，玻璃棒，移液槍等。

（三）培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：用于細(xì)菌分離；察氏培養(yǎng)基：用于霉菌分離；生化鑒定采用休和利夫森二氏培養(yǎng)基、V_P實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、丙酸鹽培養(yǎng)基、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、吲哚實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基、明膠水解培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基等，按照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》［7］和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［8］配置。

（四）試驗(yàn)方法

1.鮮橘的處理。從市售鮮橘中挑選表面含有小霉點(diǎn)的橘子作為試驗(yàn)材料，將其置于恒溫培養(yǎng)箱中，28℃的條件下放置36 h，待橘子表面霉變部位長(zhǎng)大，呈現(xiàn)青灰色時(shí)即可進(jìn)行后續(xù)步驟。

2.微生物的初步分離。無(wú)菌條件下，用滅菌剪刀在鮮橘皮霉變部位剪出1.5 cm×1.5 cm大小的面積，將剪下的橘皮用滅菌鑷子夾至盛有50 mL無(wú)菌水的三角瓶中，封好瓶口并不斷搖勻震蕩，充分震蕩20 min后，在三角瓶中取勻液1 mL，稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4的4個(gè)濃度梯度，用移液槍吸取1 mL稀釋液到培養(yǎng)皿中，每一個(gè)稀釋度上做出2組平行，及時(shí)將45℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基傾倒在平皿中，平板凝固后進(jìn)行培養(yǎng)，28℃條件下培養(yǎng)48 h，觀(guān)察菌落生長(zhǎng)狀況。在鮮橘皮正常部位采用同樣的方法進(jìn)行微生物的初步分離［9-10］。對(duì)正常部位與霉變部位微生物的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行對(duì)比。

3.微生物的純化。培養(yǎng)48 h后，對(duì)于細(xì)菌：挑取形態(tài)不同的菌落于新的培養(yǎng)基中進(jìn)行平板劃線(xiàn)，當(dāng)所生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征一致時(shí)，進(jìn)行顯微鏡觀(guān)察和革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)，確定微生物是否純化。若未純化，則繼續(xù)挑取菌落，進(jìn)行平板劃線(xiàn)直至純化。對(duì)于霉菌，用接種針挑取菌落邊緣的菌絲，點(diǎn)種于培養(yǎng)基上并且記錄菌落形態(tài)。若第一次純化后培養(yǎng)物不純，則進(jìn)行第二次接種，直至菌落純化好為止。

4.微生物的觀(guān)察與鑒定

細(xì)菌：參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》［7］《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［8］、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［11］采取菌落觀(guān)察、革蘭氏染色、芽孢染色等方法初步鑒定；再通過(guò)接觸酶、氧化酶、葡萄糖、糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、V_P實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、明膠水解、淀粉水解、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、丙酸鹽實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原、耐熱性等進(jìn)行生化鑒定。

霉菌：參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》［7］《真菌的形態(tài)和分類(lèi)》［12］首先進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察和描述，其次用棉藍(lán)染色鏡檢：在顯微鏡下觀(guān)察霉菌的菌絲或孢子的形態(tài)和特征，孢子的排列等，并記錄拍照。根據(jù)菌溶形態(tài)及鏡檢結(jié)果，確定菌種類(lèi)型。

二、結(jié)果和分析

（一）鮮橘皮霉變部位與正常部位微生物生長(zhǎng)狀況比較

將霉變部位與正常部位分離到的微生物分別接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，待微生物生長(zhǎng)出來(lái)后，比較其生長(zhǎng)狀況，結(jié)果如表1所示。

表1　霉變部位與正常部位微生物生長(zhǎng)狀況

觀(guān)察并比較牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基上的微生物生長(zhǎng)狀況發(fā)現(xiàn)：鮮橘皮霉變部位存在較多細(xì)菌和真菌，而正常部位幾乎沒(méi)有真菌，細(xì)菌較少。

（二）鮮橘皮霉變部位典型細(xì)菌的鑒定

觀(guān)察細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況可發(fā)現(xiàn)，有些細(xì)菌大量存在于鮮橘皮霉變部位，而在橘皮正常部位幾乎沒(méi)有或很少。選取這些大量出現(xiàn)在霉變部位的典型細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)觀(guān)察，挑選出9株不同形態(tài)的菌株，反復(fù)劃線(xiàn)分離，進(jìn)行純培養(yǎng)，并標(biāo)記為：A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3。據(jù)初步鑒定，9株菌株可分為3類(lèi)，A1、B2、C3為一類(lèi)，記作NO1；A2、B1、C2為一類(lèi)，記作NO2；A3、B3、C1為一類(lèi)，記作NO3。NO1代表：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），NO2代表：短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus），NO3代表：環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillusbacillus）其菌落形態(tài)，革蘭氏染色特征分別見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 細(xì)菌菌落形態(tài)

圖2 革蘭氏染色結(jié)果

由圖1可知，NO1菌落形態(tài)呈圓形，0.7～0.8 μm×2.0～3.0 μm，邊緣齒狀，表面隆起黏稠，乳白色，不透明；NO2存在半透明型和不透明型兩種不同的菌落形態(tài)，圖中所示為不透明菌落，經(jīng)過(guò)三次純化后半透明型菌落逐漸消失。NO2菌落形狀不規(guī)則，0.6～0.7 μm×2.0～3.0 μm，邊緣不整齊，表面粗糙，乳白色，不透明。NO3菌落呈圓形，1.0～1.5 μm×2.0～7.0 μm，邊緣整齊，表面無(wú)皺褶，隆起，乳白色，不透明。

圖2是在40×的顯微鏡下觀(guān)察到的。由圖2可知，菌株均是革蘭氏陽(yáng)性菌，NO1呈桿狀，鏈狀，產(chǎn)芽孢，中生或偏端生，橢圓或柱形，孢囊不膨大；NO2呈桿狀，鏈狀，產(chǎn)芽孢，偏端生，橢圓形或柱形，孢囊不顯著膨大；NO3呈桿狀，鏈狀，產(chǎn)芽孢，中生或極生，孢囊稍膨大。

由圖1與圖2的結(jié)論初步進(jìn)行判斷：NO1、NO2、NO3都屬于芽孢桿菌屬。為進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定，做細(xì)菌的生理生化檢驗(yàn)，結(jié)果如表2所示：

表2　生理生化鑒定結(jié)果

菌株NO1能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麥芽糖等。吲哚實(shí)驗(yàn)為陰性，接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、淀粉水解及明膠水解均為陽(yáng)性，V-P測(cè)定為陽(yáng)性，丙酸鹽利用為陰性，5℃、55℃條件下不生長(zhǎng)，在7%、10%的高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)良好，因此可以判斷：以菌株NO1為代表的一類(lèi)細(xì)菌為枯草芽孢桿菌。

菌株NO2能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麥芽糖等，但不能利用乳糖。接觸酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、明膠水解均為陽(yáng)性，硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、淀粉水解及丙酸鹽利用為陰性，V-P測(cè)定為陽(yáng)性，5℃、55℃條件下不能生長(zhǎng)，在7%鹽環(huán)境中生長(zhǎng)良好，因此可以判斷：以菌株NO2為代表的一類(lèi)細(xì)菌為短小芽孢桿菌。

菌株NO3能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麥芽糖等，但不能利用乳糖。接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、明膠水解、淀粉水解均為陽(yáng)性，V-P測(cè)定為陰性，5℃、55℃條件下不能生長(zhǎng)，在7%鹽環(huán)境中生長(zhǎng)良好，10%鹽環(huán)境中不能生長(zhǎng)，因此可以判斷：以菌株NO2為代表的一類(lèi)細(xì)菌為環(huán)狀芽孢桿菌。

（三）鮮橘皮霉變部位幾種主要真菌的鑒定

對(duì)鮮橘皮霉變部位分離到的真菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀(guān)察真菌在察氏培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)主要有3類(lèi)真菌大量出現(xiàn)，對(duì)它們依次標(biāo)號(hào)為：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。其菌落形態(tài)特征如圖3所示，與菌落相應(yīng)的顯微形態(tài)特征如圖4所示。

圖3 真菌菌落形態(tài)圖

圖4 真菌顯微形態(tài)圖（40×）

通過(guò)觀(guān)察可以初步判斷：真菌Ⅰ菌絲淡色，有橫隔，分生孢子梗頂端有掃帚狀分支，分支為多極的分生孢子梗，分生孢子呈球形，屬于青霉屬。真菌Ⅱ、Ⅲ匍匐于基質(zhì)上的菌絲向空中伸出球形或橢圓形頂囊的分生孢子梗，在其頂端的小梗或進(jìn)一步分枝的次級(jí)小梗上生出鏈狀的分生孢子，屬于曲霉屬。

真菌在培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)，由幼態(tài)逐漸走向成熟，觀(guān)察它們的變化趨勢(shì)并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步判斷。

真菌Ⅰ菌落具有放射狀皺紋，有同心環(huán)，質(zhì)地通常絨狀；反面為橙黃色，可溶性色素為黃色；菌絲體白色，有大量淡黃色滲出液，分生孢子梗生于基質(zhì)；帚狀枝雙輪生，或三輪生，同輪中長(zhǎng)短不一，分生孢子呈球形或近球形；總體來(lái)看，該菌株很可能為：青霉屬中的橘青霉。

真菌Ⅱ菌落在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，中心稍凸，質(zhì)地絲絨狀兼有少量絮狀；分生孢子結(jié)構(gòu)較少，淺灰綠色，老后顏色加深，反面黃褐色；滲出液無(wú)色；分生孢子頭呈短柱狀；分生孢子梗生于基質(zhì)；頂囊燒瓶形，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層；分生孢子近球形，壁粗糙。該菌株應(yīng)該為：曲霉屬中的煙曲霉群。

真菌Ⅲ菌落在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落平坦，質(zhì)地絲絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，孢子頭黑色，反面淡黃色且中部呈現(xiàn)黑褐色；無(wú)滲出液；分生孢子頭幼時(shí)球形，老后分裂成柱狀結(jié)構(gòu)；分生孢子梗生于基質(zhì)；頂囊球形，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層；分生孢子球形，壁粗糙。該菌株應(yīng)該為：曲霉屬中的炭黑曲霉。

三、結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)鮮橘皮表面的微生物進(jìn)行分離純化，比較鮮橘皮霉變部位和正常部位微生物的生長(zhǎng)狀況，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化檢驗(yàn)相結(jié)合的方式，發(fā)現(xiàn)了存在于鮮橘皮霉變部位的幾種主要的優(yōu)勢(shì)微生物。其中有9株典型的細(xì)菌最終鑒定為3類(lèi)：以NO1為代表的枯草芽孢桿菌，以NO2為代表的短小芽孢桿菌，以NO3為代表的環(huán)狀芽孢桿菌；另外還檢測(cè)到了來(lái)自于青霉屬和曲霉屬的3種真菌，分別是：橘青霉、煙曲霉及炭黑曲霉。

本試驗(yàn)的結(jié)論，對(duì)于鮮橘皮霉變部位微生物的檢測(cè)提供了一定的參考依據(jù)，如果對(duì)于霉變部位的優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行針對(duì)性的殺菌抑制，或許可以對(duì)鮮橘皮的霉變起到一定的阻礙作用。隨著社會(huì)的發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)健康的要求越來(lái)越高，因此，在橘皮食品加工方面很有必要考慮使用干凈無(wú)霉變的新鮮橘皮作為加工原料，滿(mǎn)足廣大消費(fèi)者的需要，從而獲取更好的經(jīng)濟(jì)效益。

［1］傅維康.橘子史話(huà)［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2008，（11）：69-70.

［2］一個(gè)橘子等于五味藥［J］.科學(xué)大觀(guān)園，2015，（11）：13.

［3］楊璞.桌邊床前放點(diǎn)橘子皮有利睡眠［J］.家庭醫(yī)藥，2014，（9）：79.

［4］張茂信.橘皮煎湯外洗治足癬［J］.浙江中醫(yī)雜志，2001，（7）：40.

［5］楊艷，羅愛(ài)民，潘雪雪，金晶.橘皮中功能成分的提取及其應(yīng)用研究［J］.湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，（3）：292-296.

［6］范瓊，張學(xué)亮，張弦，馮思苗.橘子皮對(duì)水中亞甲藍(lán)的吸附性能研究［J］.中國(guó)生物工程雜志，2007，（5）：85-89.

［7］周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986.

［8］東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［9］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/f4789.22010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［10］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/r4789.152010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［11］布坎南，吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，1984.

［12］戴芳瀾.真菌的形態(tài)和分類(lèi)［M］.北京：科學(xué)出版社，1987.

（編輯：張瓊瓊）

S379.5

B

1673-9019（2016）17-0029-03

2016-05-26

曹丹（1994-），女，甘肅會(huì)寧人，主要從事微生物研究。

張愛(ài)梅（1973-），女，甘肅武威人，副教授，主要從事微生物生態(tài)學(xué)的研究。