李偉宏

（河南省鄭州市澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450064）

MicroRNA-200b在卵巢癌組織及血漿中的表達(dá)及其對癌細(xì)胞侵襲遷移的影響

李偉宏

（河南省鄭州市澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450064）

目的觀察microR NA-200b（簡稱miR-200b）在上皮性卵巢癌（EOC）患者卵巢組織以及血漿中的表達(dá)水平，探討miR-200b對卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移的影響。方法選取2014年12月-2015年12月鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診為EOC患者36例（EOC組），另選取同期因子宮肌瘤或子宮腺肌病及其他非卵巢病變行手術(shù)切除者共20例作為對照組。采用實(shí)時熒光定量R T-PCR（qR T-PCR）法檢測EOC患者和正常對照組卵巢組織中及血漿中miR-200b表達(dá)水平，人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3轉(zhuǎn)染miR-200b抑制物后，采用transwell法觀察細(xì)胞侵襲能力，并采用qR T-PCR和Western blot檢測MMP-9的mR NA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果miR-200b在上皮性卵巢患者卵巢組織及血漿中的表達(dá)水平均顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.01）；miR-200b抑制物可明顯降低SK-OV-3細(xì)胞遷移能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；且MMP-9的mR NA及蛋白水平均明顯降低（P<0.01）。結(jié)論miR-200b在上皮性卵巢癌組織中高表達(dá)，miR-200b可能通過影響MMP-9來促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲遷移。

microR NA-200b；上皮性卵巢癌；侵襲；MMP-9

卵巢癌是女性生殖道常見的惡性腫瘤之一，占女性生殖道腫瘤病死率的第一位[1]。上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是最常見的卵巢腫瘤類型，由于早期診斷率低及對化療藥物較高的耐藥性導(dǎo)致5年生存率低于20%[2]。尋找特異性和敏感性均較高的新的腫瘤標(biāo)志物，并與多種篩查方法相結(jié)合有望提高對上皮性卵巢癌的早期診斷。本研究對上皮性卵巢癌患者病變組織及外周血中microRNA-200b（簡稱miR-200b）的表達(dá)進(jìn)行檢測，以便了解miR-200b在上皮性卵巢癌中的臨床意義，并對miR-200b影響癌細(xì)胞侵襲遷移的機(jī)制進(jìn)行初步探究。

1 資料與方法

1.1研究對象

選取2014年12月-2015年12月于鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診為上皮性卵巢癌的患者36例（EOC組），年齡38～56歲，平均45歲；另選取同期因子宮肌瘤或子宮腺肌病及其他非卵巢病變行子宮全切除+單側(cè)(或雙側(cè))附件切除術(shù)者共20例作為對照組，術(shù)后病理檢查證實(shí)為正常卵巢，年齡36～57歲，平均46歲。兩組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。所有選擇病例術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療或激素治療。所有樣本均經(jīng)研究對象同意，并簽署知情同意書。

1.2主要試劑

人卵巢癌細(xì)胞系SK-OV-3購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，McCoy'5A細(xì)胞培養(yǎng)基購自Sigma公司，胎牛血清、雙抗購自Gibco公司，RNA提取試劑盒Trizol購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、PCR試劑盒、SYBR qRT-PCR試劑盒等均購自大連寶生生物工程有限公司。miR-200b、miR-200b抑制物及U6內(nèi)參的引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成；兔抗人MMP-9購自Cell signaling公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗、兔抗人β-actin購自北京博奧森公司。

1.3組織和血漿標(biāo)本總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

兩組患者手術(shù)中所取卵巢癌及正常卵巢組織，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。此外，EOC組和對照組術(shù)前均于清晨空腹抽靜脈血5 ml，加入EDTA抗凝劑，2h內(nèi)于4℃下高速離心3000×g，5min。離心后提取上層血漿放入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

取約100 mg組織或200 u血漿，加入1 ml Trizol，充分勻漿，抽提總RNA，所得RNA溶于25μl的DEPC水中。經(jīng)紫外分光光度計對提取的總RNA定量及檢測純度。進(jìn)一步用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。引物序列如下：miR-200b：正向引物5'-GGG TAATACTGCCTGGTAA-3'；反向引物5'-TTTGGCAC TAGCACATT-3'。U6：正向引物5'-CTCGCTTCGGC AGCACA-3'；反向引物5'-AACGCTTCACGAATTT-3'。qRT-PCR擴(kuò)增條件：50℃孵育2 min，95℃、Taq酶活化10min，95℃、15s，60℃、1min，共40個循環(huán)。運(yùn)用目的基因Ct值與內(nèi)參U6的Ct值之差ΔC（tCt目的基因–Ct管家基因）值，以2-ΔΔCt表示miR-200b的相對表達(dá)量，美國ABI PRISMR7300 Real-time PCR Systems進(jìn)行檢測及分析。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人卵巢癌細(xì)胞系SK-OV-3細(xì)胞培養(yǎng)于McCoy' 5A培養(yǎng)基[含有10%胎牛血清（FBS）、100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素]，在37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)生長。按說明書將miR-200b抑制物與脂質(zhì)體2000（美國Invitrogen公司）混合靜置后轉(zhuǎn)染SK-OV-3細(xì)胞，48 h后采用qRT-PCR檢測其干擾效率。

1.5細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的SK-OV-3細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后SKOV-3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至3×105個/ml，按0.1ml/孔加到transwell小室的上層，上室預(yù)先用100μl Matrigel膠包被后紫外線照射2h。小室下層加入1ml含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，對己穿至小室下層的細(xì)胞固定并用結(jié)晶紫染色后顯微鏡（Olympus）進(jìn)行計數(shù)（隨機(jī)選取5個視野），實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，設(shè)平行復(fù)孔。

1.6免疫印跡檢測蛋白水平

收集SK-OV-3及轉(zhuǎn)染miR-200b抑制物48 h后SK-OV-3細(xì)胞，蛋白裂解液處理并制備蛋白樣品，根據(jù)蛋白定量結(jié)果調(diào)整每孔的上樣量，將蛋白樣品加在10%SDS-PAGE膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫震蕩封閉2 h，一抗分別加兔抗人的MMP-9（1∶1 000稀釋）、兔抗人β-actin（1∶3 000稀釋），4℃孵育過夜后，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶3 000稀釋）室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，UVP凝膠成像儀（Gel Doc-It TS2 310 ImagingSystem）拍照檢測。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計作圖用Graph Pad Prism 5.0軟件，計量資料主要為計量數(shù)據(jù)，均通過正態(tài)性檢驗(yàn)；多組間比較為單因素方差分析+LSD多重比較，兩組間差異比較用Student'st檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1EOC組和對照組的卵巢組織及外周血中miR-200b mRNA水平的比較

與對照組正常卵巢組織比較，EOC組卵巢組織中miR-200bmRNA的表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。EOC組患者外周血中miR-200b mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

表1　EOC組和對照組組織中miRNA-200b mRNA的表達(dá)水平（±s）

表1　EOC組和對照組組織中miRNA-200b mRNA的表達(dá)水平（±s）

組別miR-200bmRNA（2-ΔΔCt）t值P值卵巢組織對照組（n=20）1.21±0.24 EOC組（n=36）5.26±1.1320.6810.000外周血對照組（n=20）1.16±0.35 EOC組（n=36）3.48±1.0811.8200.000

2.2低表達(dá)miR-200b對SK-OV-3細(xì)胞侵襲功能的影響

與空白及空轉(zhuǎn)對照比較，SK-OV-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200b抑制物后，其miR-200b mRNA水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明抑制表達(dá)效果成功。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，與對照組比較，SK-OV-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200b抑制物后，transwell小室下層細(xì)胞數(shù)量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示miR-200b可能與卵巢癌細(xì)胞侵襲能力密切相關(guān)。見表2。

表2　低表達(dá)miR-200b對SK-OV-3細(xì)胞侵襲功能的影響（n=6±s）

表2　低表達(dá)miR-200b對SK-OV-3細(xì)胞侵襲功能的影響（n=6±s）

注：t1，P1值：A vs B；t2，P2值：A vs C；t3，P3值：B vs C

組別miR-200bmRNA水平細(xì)胞數(shù)量A：抑制物0.41±0.0423.1±1.1 B：對照組0.94±0.0334.7±1.1 C：空白組1.00±0.0135.2±1.3 F值P值756.346 0.000 187.355 0.000 t1，P1值31.763，0.00016.071，0.000 t2，P2值35.320，0.00017.380，0.000 t3，P3值3.558，0.0031.309，0.210

2.3干擾miR-200b對SK-OV-3細(xì)胞MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)影響

為了探討miR-200b影響SK-OV-3細(xì)胞侵襲的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測干擾miR-200b基因后SK-OV-3細(xì)胞中MMP-9的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，干擾miR-200b的SK-OV-3細(xì)胞表達(dá)MMP-9的mRNA和蛋白水平均顯著降低，提示miR-200b可能是通過促進(jìn)MMP-9的表達(dá)來影響癌細(xì)胞的侵襲能力。見表3和附圖。

表3　低表達(dá)miR-200b對SK-OV-3細(xì)胞MMP-9表達(dá)水平的影響（n=6±s）

表3　低表達(dá)miR-200b對SK-OV-3細(xì)胞MMP-9表達(dá)水平的影響（n=6±s）

注：t1，P1值：A vs B；t2，P2值：A vs C；t3，P3值：B vs C

組別MMP-9mRNA水平A：抑制物0.45±0.04 B：對照組0.82±0.04 C：空白組1.00±0.01 F值P值442.761 0.000 t1，P1值19.621，0.000 t2，P2值29.186，0.000 t3，P3值9.565，0.000

附圖　低表達(dá)miR-200b對SK-OV-3細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的影響

3 討論

上皮性卵巢癌（EOC）在卵巢惡性腫瘤中最為常見，發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者確診時已到晚期（Ⅲ期或Ⅳ期）而晚期患者的5年生存率低于20%，死亡率高居婦科惡性腫瘤之首[3]。上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多種癌基因和抑癌基因的表達(dá)失衡的過程，在該過程中，miRNA通過差異表達(dá)在基因組上通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)的靶基因（如ZEB1、HSF1等），從而發(fā)揮著類似于致癌或抑癌的功能[4-6]。

miRNA是一種新近發(fā)現(xiàn)的非編碼小分子RNA，參與調(diào)控細(xì)胞生長分化、能量代謝、凋亡等生理過程[7]。近年來發(fā)現(xiàn)，多數(shù)miRNAs定位在與腫瘤相關(guān)的染色體部位，miRNAs可以調(diào)控腫瘤相關(guān)基因，參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲或血管形成等過程，與人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系[8]。miR-200家族在上皮性卵巢癌及多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[9]。IORIO[10]對上皮性卵巢癌進(jìn)行多種miRNA的篩查發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌中表達(dá)上調(diào)倍數(shù)最高的是miR-200家族，提示miR-200家族在上皮性卵巢癌的發(fā)病機(jī)制中起著類似癌基因的作用，可用于上皮性卵巢癌的早期診斷。miR-200家族有5個家族成員，miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429。本研究對上皮性卵巢癌患者和正常對照組的卵巢組織及外周血中miR-200b mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EOC患者卵巢組織和外周血中miR-200b的mRNA水平均顯著高于正常對照組，與辛艷[11]、WYMAN等[12]的研究結(jié)果相一致，提示miR-200家族在上皮性卵巢癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）退化提示卵巢癌浸潤正常組織并觸發(fā)轉(zhuǎn)移[13]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是能夠降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，而MMP-9主要降解細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅳ型膠原，從而破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14-15]。由于在侵襲試驗(yàn)中，低表達(dá)miR-200b的卵巢癌細(xì)胞穿過小室的能力明顯降低。為進(jìn)一步探討miR-200b影響卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的機(jī)制，本研究檢測低表達(dá)miR-200b卵巢癌細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)情況，結(jié)果表明，低表達(dá)miR-200b后，卵巢癌細(xì)胞MMP-9的mRNA和蛋白水平均顯著降低，提示miR-200b調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞侵襲可能與MMP-9表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，上皮性卵巢癌患者高表達(dá)miR-200b可能通過影響上皮性卵巢癌細(xì)胞的侵襲功能參與上皮性卵巢癌的進(jìn)展，血漿miR-200b可能成為預(yù)測上皮性卵巢癌預(yù)后的標(biāo)志物。本研究為miR-200b與上皮性卵巢癌相互關(guān)系及其發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。

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（張西倩編輯）

Expression of miRNA-200b in ovarian cancer tissue and plasma and its effects on cancer cell migration

Wei-hong Li
（Zhengzhou Shuqing Medical College，Zhengzhou，Henan 450064，China）

Objective To observe the expression ofmiRNA-200bin ovarian tissue and plasma of EOC patients，and to investigate effects of miRNA-200b on invasion and migration of ovarian cancer cells.Methods From December 2014 to December 2015，36 cases of diagnosed EOC patients（EOC group）in our hospital were selected as EOC group.And 20 cases of patients underwent surgical resection because of uterine leiomyoma or adenomyosis and other non ovarian lesions over the same period were selected as control group.RT-PCR（qRT-PCR）was used to detect the expression ofmiRNA-200bin ovarian tissue and plasma of two groups.AfterSK-OV-3cells interference miRNA-200binhibitor，cell invasion ability was observed with transwell method.The mRNA and protein levels of MMP-9 were detected by qRT-PCR and Western blot.Results The expression ofmiRNA-200bin ovarian tissues and plasma of the EOC group were significantly higher than the control group（P＜0.001）.After interference of miRNA-200binSK-OV-3cells，the cell invasion ability was reduced，and the mRNA and protein levels of MMP-9 were decreased.Conclusions The expressions of miRNA-200b in EOC are increased.ThemiRNA-200bmay facilitate the migration of ovarian cancer cells by affectingMMP-9.

miRNA-200b；epithelial ovarian cancer；invasion and metastasis；MMP-9

R 737.31

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.009

1005-8982（2016）20-0040-04

2016-02-29