李曉非，黃山，梁桂亮，呂松琴，資敏，劉永亮

（1.云南省昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 昆明 650041；2.國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361102）

細(xì)胞因子聯(lián)合檢測對活動性結(jié)核與潛伏性結(jié)核鑒別診斷的預(yù)測價(jià)值分析*

李曉非1，黃山1，梁桂亮1，呂松琴1，資敏1，劉永亮2

（1.云南省昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 昆明 650041；2.國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361102）

目的探索細(xì)胞因子聯(lián)合檢測在結(jié)核患者潛伏性感染及活動性感染鑒別診斷中的預(yù)測價(jià)值。以期在細(xì)胞因子水平找到能夠區(qū)分結(jié)核活動性感染和潛伏性感染的指標(biāo)，為臨床診斷結(jié)核提供新的依據(jù)。方法采用流式微球陣列法檢測72例確診為活動性肺結(jié)核患者，57例確診為潛伏性感染者的23種血清細(xì)胞因子的水平，分析單個(gè)細(xì)胞因子在潛伏性感染及活動性感染鑒別診斷中的價(jià)值，最后進(jìn)一步用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析多個(gè)細(xì)胞因子聯(lián)合檢測的診斷價(jià)值。結(jié)果相比于潛伏性感染組，活動性結(jié)核組白細(xì)胞介素15（IL-15）、干擾素誘導(dǎo)蛋白10（IP-10）、白細(xì)胞介素8（IL-8）、白細(xì)胞介素2（IL-2）、血清白細(xì)胞介素2受體a（IL-2R a）、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白a（MIP-1a）這6種細(xì)胞因子水平均升高（P<0.05）；其余白細(xì)胞介素4（IL-4）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等17種細(xì)胞因子在血清中的含量兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在結(jié)核活動性的鑒別診斷中，3個(gè)細(xì)胞因子的AUC值大于0.8，分別為IL-8（0.83）、IL-15（0.89）、IP-10（0.93）；（IL-8&IL-15）、（IL-8&IP-10）和（IL-15 &IP-10）兩個(gè)細(xì)胞因子聯(lián)合檢測優(yōu)于任一單細(xì)胞因子的診斷價(jià)值（P<0.05）；（IL-8&IL-15&IP-10）3個(gè)細(xì)胞因子聯(lián)合檢測時(shí)，曲線下面積值為0.97，可顯著提升活動性結(jié)核診斷的敏感性和特異性。結(jié)論在IFN-γ釋放實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，IL-8、IL-15、IP-10聯(lián)合檢測可以作為區(qū)分活動性和潛伏性結(jié)核的理想標(biāo)志物。

細(xì)胞因子；活動性結(jié)核；潛伏性結(jié)核；診斷

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，是一種非常嚴(yán)重的全球性健康問題，全球每年新增結(jié)核患者約有900萬，因結(jié)核病死亡的人數(shù)高達(dá)170萬[1]。根據(jù)結(jié)核菌感染狀態(tài)，可將患者分為活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核，但是兩者之間的治療方案截然不同。

目前，結(jié)核診斷在欠發(fā)達(dá)國家和地區(qū)仍有很大的挑戰(zhàn)。廣泛應(yīng)用的痰涂片檢測敏感性在34%～80%之間，雖然痰培檢測敏感性高于痰涂片，但耗時(shí)長，同時(shí)很多高結(jié)核負(fù)擔(dān)國家也無法滿足其對實(shí)驗(yàn)室條件的要求[2]。

有研究證實(shí)，與潛伏性結(jié)核患者比較，活動性結(jié)核患者外周血中T淋巴細(xì)胞在結(jié)核特異性抗原剌激后分泌的細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素8（Interleukin8，IL-8）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、白細(xì)胞共同抗原抗體（cluster of differentiation 46，CD46）、干擾素誘導(dǎo)蛋白10（interferon-inducibleprotein10，IP-10）等都顯著升高[3]。本研究擬通過用流式微球陣列法（cytometric bead array，CBA）檢測活動性及潛伏性感染者外周血經(jīng)結(jié)核特異性抗原剌激后白細(xì)胞介素15（Interleukin 15，IL-15）、IP-10、IL-8、白細(xì)胞介素2（interleukin 2，IL-2）、白細(xì)胞介素2受體a（interleukin 2 receptor a，sIL-2Ra）、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白a（macrophage inflammatoryprotein1alpha，MIP-1a）等23種細(xì)胞因子的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)比較各細(xì)胞因子在活動性結(jié)核診斷中的價(jià)值，并進(jìn)一步分析幾種細(xì)胞因子聯(lián)合檢測在活動性結(jié)核診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2014年1月-2015年6月于昆明市第三人民醫(yī)院收治確診的72例活動性肺結(jié)核患者。其中，男性42例，女性30例；平均（52.3±14.6）歲。潛伏性肺結(jié)核患者57例。其中，男性28例，女性29例；平均（51.6±16.6）歲。兩組患者性別和年齡構(gòu)成比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

1.2入組診斷標(biāo)準(zhǔn)

本研究入組樣本分為臨床活動性結(jié)核患者組和IFN-γ釋放實(shí)驗(yàn)陽性潛伏感染者組?；顒有越Y(jié)核患者符合下列診斷標(biāo)準(zhǔn)：①明顯的臨床癥狀如低熱盜汗咳嗽咳血；②X射線及細(xì)菌學(xué)檢查陽性排除其他非結(jié)核性肺部疾患。潛伏性結(jié)核患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)：①與活動性結(jié)核人群密切接觸的人群；②結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)檢測（T cell spot test，T-SPOT）、結(jié)核分枝桿菌（Tuberculosis，TB）檢測陽性；③X射線及細(xì)菌學(xué)檢查陰性；④無臨床癥狀。

所有入組患者均排除使用激素或者患有其他影響免疫功能的疾病如人類免疫缺陷病毒、自身免疫病等。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑

高糖改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸二鈉、青霉素和鏈霉素（杭州吉諾公司），F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀（flow Cytometry，F(xiàn)CM）和各細(xì)胞因子的CBA Flex Set檢測試劑盒（美國Becton Dickinson公司），T-SPOT.TB試劑盒（英國OxfordImmunotec公司），F(xiàn)icoll密度梯度淋巴細(xì)胞分離液、胎牛血清、RPMI 1640（美國Gibco公司），結(jié)核分枝桿菌特異性重組蛋白由廈門大學(xué)國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心提供。

1.4刺激抗原的制備

本研究利用基因工程技術(shù)將致病性結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6和CFP-10融合表達(dá)，經(jīng)大腸桿菌表達(dá)純化后獲得重組抗原E1C0。

1.5外周血特異性T細(xì)胞的刺激培養(yǎng)及細(xì)胞因子的檢測

在含有TB特異抗原的培養(yǎng)管中加入新鮮抗凝血，37℃孵育16～24 h后，1 800 r/min離心5 min，收集上清液置入-80℃冰箱冷凍保存。FCM檢測，按照檢測試劑盒的要求準(zhǔn)備儀器調(diào)整微球，打開BD FACS Comp軟件，用Cali BRITE Beads進(jìn)行儀器設(shè)置。然后打開BD Cell Quest軟件，調(diào)出CBA儀器調(diào)整模板，用儀器調(diào)整微球設(shè)置本次實(shí)驗(yàn)的最佳參數(shù)，依次采集各標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本管的數(shù)據(jù)。每種CK依據(jù)CellQuest和CBA軟件（BD Pharmingen）生成的標(biāo)準(zhǔn)參照曲線計(jì)算其熒光密度進(jìn)行定量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Medcalc統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組均數(shù)間比較用單因素方差分析；受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析用于各個(gè)細(xì)胞因子及幾種細(xì)胞因子聯(lián)合對診斷活動性結(jié)核的敏感性與特異性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組患者血液在結(jié)核特異性抗原剌激后細(xì)胞因子的釋放情況

在用結(jié)核特異性抗原剌激后，相比于潛伏性結(jié)核感染組，活動性結(jié)核組患者血清中IL-8、IL-15、IL-2、IP-10、MIP-1a的水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；IL-2Ra的水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余IL-4、IL-6等17種細(xì)胞因子的水平兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1　兩組患者血液在結(jié)核特異性抗原剌激后血清中23種細(xì)胞因子水平的比較（pg/ml±s）

表1　兩組患者血液在結(jié)核特異性抗原剌激后血清中23種細(xì)胞因子水平的比較（pg/ml±s）

組別IL-8IL-15IL-2IL-2RaIP-10MIP-1aIL-4潛伏性結(jié)核（n=57）2.62±0.692.28±1.09122.83±24.9625.53±5.415990.12±1502.111006.38±268.13345.23±23.45活動性結(jié)核（n=72）3.93±1.174.37±1.70141.73±33.8732.62±15.0410793.53±3121.601252.46±369.32363.91±49.53 F值56.05138.0212.4111.4597.3517.8454.21 P值0.0000.0000.0000.0290.0000.0000.422組別IL-6IL-9IL-12IL-13IL-14M-CSFPF-4ENA-78潛伏性結(jié)核（n=57）37.43±5.352.43±0.43123.52±10.4324.72±2.988.34±0.520.92±0.02435.46±23.2483.74±8.27活動性結(jié)核（n=72）41.32±8.433.21±0.33142.65±16.2219.43±3.4410.34±0.441.03±0.03452.33±33.7882.98±6.45 F值3.442.671.935.923.232.095.896.32 P值0.5100.5510.5910.1330.5320.5820.1110.108組別PDGFEGFTNF-β1TNF-β2BMPIGF-1NGFOSM潛伏性結(jié)核（n=57）91.32±4.2735.53±2.465.32±0.026.87±0.06122.54±10.75453.76±69.234.91±0.4312.24±0.99活動性結(jié)核（n=72）95.34±6.7441.43±3.844.99±0.047.88±0.07133.54±12.44542.88±55.895.12±0.6614.22±1.01 F值1.452.531.554.993.424.782.334.11 P值0.6410.6020.6220.2140.5240.3990.5260.402

2.2各細(xì)胞因子在區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核中的ROC曲線分析

為了進(jìn)一步評價(jià)這6種細(xì)胞因子在鑒別診斷結(jié)核感染為潛入性或活動性中的應(yīng)用，筆者繼續(xù)對這6種細(xì)胞因子做ROC曲線的分析。結(jié)果顯示6種細(xì)胞因子IL-8、IL-15、IL-2、IL-2Ra、IP-10、MIP-1a的曲線下面積（area under the curve，AUC）分別為0.83（95%CI：0.75，0.89）、0.89（95%CI：0.81，0.93）、0.70（95%CI：0.61，0.77）、0.74（95%CI：0.65，0.77）、0.93（95%CI：0.87，0.96）、0.70（95%CI：0.61，0.78）。根據(jù)ROC曲線分析，筆者進(jìn)一步確定對應(yīng)每種炎癥因子用于診斷的最佳cut-off值，以及其在活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核鑒別診斷中的敏感性和特異性。見表2和圖1。

表2　對6種細(xì)胞因子在活動性結(jié)核診斷中的ROC曲線分析

接著筆者對AUC>0.8的3種細(xì)胞因子IL-8、IL-15、IP-10做ROC曲線比較，IL-8與IL-15之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.227）；IP-10與IL-15之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.247）；IP-10優(yōu)于IL-8（P<0.05）。見圖2。

2.3細(xì)胞因子聯(lián)合檢測在區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核中的ROC曲線分析

用多元邏輯回歸算得在用2種或3種細(xì)胞因子聯(lián)合檢測在鑒別結(jié)核為活動性或潛伏性時(shí)各細(xì)胞因子前的系數(shù)（IL-8&IL-15）=1.32*IL-8+1.52*IL-15；（IL-8&IP-10）=0.95*IL-8+0.00081*IP-10；（IL-15 &IP-10）=1.31*IL-15+0.00076*IP10；（IL-8&IL-15 &IP-10）=1.26*IL-8+0.88*IL-15+0.00065*IP10。（IL -8&IL-15）、（IL-8&IP-10）和（IL-15&IP-10）3組兩個(gè)細(xì)胞因子聯(lián)合檢測的AUC值大于任一單細(xì)胞因子檢測的AUC值（P<0.05）。3組兩因子聯(lián)合檢測之間AUC值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；（IL-8 &IL-15&IP-10）3因子聯(lián)合檢測與（IL-15&IP-10）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），（IL-8&IL-15& IP-10）優(yōu)于（IL-8&IL-15），（P<0.05），（IL-8& IL-15&IP-10）優(yōu)于（IL-8&IP-10）（P<0.05）。見圖3和表3。

圖1　結(jié)核抗原刺激后的細(xì)胞因子在區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核的ROC曲線分析

圖2　IL-15、IL-8、IP-10在區(qū)分活動性結(jié)核與潛伏性結(jié)核的ROC曲線分析比較

圖3　細(xì)胞因子聯(lián)合檢測在區(qū)分活動性結(jié)核與潛伏性結(jié)核的ROC曲線分析比較

表3　細(xì)胞因子聯(lián)合檢測在區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核的ROC曲線分析

3 討論

IFN-γ釋放實(shí)驗(yàn)是確認(rèn)病原體感染及評估感染狀況較為可靠的方法，且有早期診斷價(jià)值[4-5]。外周全血或分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞，在結(jié)核桿菌特異性的抗原刺激后，感染過結(jié)核分支桿菌的個(gè)體外周血中的記憶性T細(xì)胞能夠被再次激活，從而迅速地釋放包括IFN-γ在內(nèi)的多種炎癥因子。但是由于目前的IFN-γ釋放實(shí)驗(yàn)只檢測IFN-γ一種分子，敏感性低、容易受機(jī)體其他因素干擾，而且僅僅只能夠檢測到結(jié)核桿菌的感染，不能夠區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核感染。在結(jié)核病高流行的地區(qū)和國家，由于潛伏性結(jié)核感染的比率較高，使IGRAγ在臨床診斷中的應(yīng)用受到了極大地限制[6-7]。因此發(fā)明一種基于T細(xì)胞免疫反應(yīng)的活動性結(jié)核診斷方法，發(fā)現(xiàn)一種新的T細(xì)胞應(yīng)答標(biāo)志物非常重要[8]。

德國JACOBSEN等人[9]利用FASCIA和multiplex技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)，CD64以及GTPase 33A可以用來區(qū)分結(jié)核患者和潛伏感染者。有大量研究證實(shí)，IP-10可以用于活動性結(jié)核的鑒別診斷，而且可以作為結(jié)核治療效果的一個(gè)指標(biāo)[10-12]。同樣的，國內(nèi)王瑩等人[13]分別應(yīng)用植物血凝素、純化的結(jié)核分枝桿菌CFP10/ESAT6融合蛋白刺激人全血產(chǎn)生IP-10，用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測105例活動性結(jié)核病患者、52例非結(jié)核肺部疾病患者、29例健康對照者全血中IP-10水平，通過ROC曲線確定其診斷活動性結(jié)核病的臨界值，并評價(jià)其診斷效能，并最終證實(shí)活動性結(jié)核病患者免疫反應(yīng)增強(qiáng)，全血結(jié)核特異的IP-10檢測可以作為活動性結(jié)核病的輔助診斷指標(biāo)之一。

本實(shí)驗(yàn)通過用結(jié)核特異性抗原刺激結(jié)核患者的外周血，檢測IFN-γ以外23種細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IL-15、IP-10、IL-8、IL-2、IL-2Ra、MIP-1a這6種細(xì)胞因子的表達(dá)在潛伏性感染組活動性感染組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與國內(nèi)外其他研究結(jié)果相符[14-15]，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)IP-10具有良好的敏感性和特異性，并且在23個(gè)檢測指標(biāo)中AUC值最高，為0.93。雖然不同研究的“cut off”值存在不同，敏感性和特異性也存在差異，但多個(gè)研究都顯示IP-10對活動性結(jié)核具有較高的診斷準(zhǔn)確性。

本研究通過后期對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，（IL-8 &IL-15），（IL-8&IP-10）和（IL-15&IP-10）3組兩個(gè)細(xì)胞因子聯(lián)合檢測的AUC值大于任一單細(xì)胞因子檢測的AUC值，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（IL-8& IL-15&IP-10）3個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測能夠有效區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核，AUC值達(dá)0.97，高于上述兩個(gè)細(xì)胞因子聯(lián)合檢測的AUC值。同樣，最近WANG等人[16]在研究使用ESAT6/CFP10作為刺激抗原子，刺激活動性結(jié)核和健康人群后，使用luminex平臺檢測多重細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)結(jié)核潛伏性感染和活動性感染兩組之間IFN-γ、IP-10、MIG、TNF-a有顯著差別，并進(jìn)一步通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用IFN-γ和IP-10作為檢測指標(biāo)可以調(diào)高單獨(dú)使用IFN-γ檢測的敏感性和特異性。隨著現(xiàn)在檢測技術(shù)和設(shè)備的提升，在少量的樣本中快速、靈敏的對多種細(xì)胞因子同時(shí)進(jìn)行檢測已成為可能[17]。多種細(xì)胞因子的聯(lián)合檢測可以大大提高活動性結(jié)核診斷的敏感性和特異性，可以作為區(qū)分活動性和潛伏性結(jié)核的理想標(biāo)志物[3，18]。

本研究存在不足之處，首先，沒有納入健康對照組以觀察哪些細(xì)胞因子在結(jié)核患者中升高，僅僅設(shè)置了潛伏性結(jié)核患者組和活動性結(jié)核患者組；其次，由于成本問題，本研究納入的樣本量相對較少，無法對大規(guī)模的樣本進(jìn)行初步篩選。筆者將在后續(xù)的研究中針對已經(jīng)篩選出的6種細(xì)胞因子，采取前瞻性研究的方法，進(jìn)一步驗(yàn)證該指標(biāo)的診斷價(jià)值。

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（張蕾編輯）

Application of combined CKs to differentiate active and latent tuberculosis infection*

Xiao-fei Li1，Shan Huang1，Gui-liang Liang1，Song-qin Lyu1，Min Zi1，Yong-liang Liu2
（1.Department of Laboratory，the Third People's Hospital of Kunming，Kunming，Yunnan 650041，China；2.National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases，Xiamen，F(xiàn)ujian 361102，China）

Objective To find a new marker which can differentiate active tuberculosis infection and latent tuberculosis infection at the level of cytokine，and to provide new evidence for clinical diagnosis of tuberculosis. Methods Levels of 23 CKs of TB specific antigen from active or latent tuberculosis were evaluated by cytometric bead array.ROC analysis was used to test each CK and the combination of the CKs on the diagnosis of active tuberculosis.Results Compared with latent tuberculosis infection group，the levels of IL-15，IP-10，IL-8，IL-2R，sIL-2Ra，MIP-1ain the active tuberculosis infection group were significantly increased（P＜0.05）；Another 17 CKs like IL-4 and IL-6 had no significant difference between the two groups.The AUC value of IL-8（0.83），IL-15（0.89），IP-10（0.93）was beyond 0.8.Combination of（IL-8&IL-15），（IL-8&IP-10）or（IL-15&IP-10）had a greater value than one CK，P＜0.05.The AUC value of（IL-8&IL-15&IP-10）was significantly increased compared with the combination of two CKs.Conclusions Combination detection of IL-8，IL-15，IP-10 is the idealmarker for differentiation active tuberculosis infection from latent tuberculosis infection. Keywords：cytokine；tuberculosis；latent tuberculosis infection；diagnosis

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.008

1005-8982（2016）20-0034-06

R 521

A

2016-01-13

昆明市科技計(jì)劃項(xiàng)目，活動性結(jié)核血清學(xué)檢測靶標(biāo)篩選（No：2014-04-A-S-02-3091）