陳賢華，胡宏波，馮金，孫秀娟，劉大鷹

（廣西省柳州市柳鐵中心醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.病理科，3.呼吸內(nèi)科，廣西 柳州 545007）

Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)*

陳賢華1，胡宏波1，馮金1，孫秀娟2，劉大鷹3

（廣西省柳州市柳鐵中心醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.病理科，3.呼吸內(nèi)科，廣西 柳州 545007）

目的探討R eprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性改變與肺癌發(fā)生的關(guān)系。方法基因分型用TAKAR A的MightyAmp DNA聚合酶法，分別檢測(cè)36例肺癌患者（癌癥組）和23例非癌患者（對(duì)照組）的R eprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點(diǎn)G>C分布，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)、Logistic回歸分析和Armitage's趨勢(shì)檢驗(yàn)等分析基因多態(tài)性、患者性別、吸煙與否和年齡與肺癌發(fā)生的相關(guān)性。結(jié)果兩組標(biāo)本經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)，對(duì)照組在R eprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點(diǎn)G>C基因型觀測(cè)(理論)頻數(shù)為0，22，1（5.26，11.48，6.26），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）,癌癥組的基因型觀測(cè)(理論)頻數(shù)為6，29，1(11.67，17.65，6.67)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；經(jīng)Logistic回歸分析，基因多態(tài)性、年齡是危險(xiǎn)因素，基因多態(tài)性、年齡和吸煙與否在肺癌發(fā)生中不存在交互作用（P>0.05）；經(jīng)Armitage's趨勢(shì)檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.56，P=0.059）。結(jié)論R eprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點(diǎn)G>C單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌發(fā)生具有一定的相關(guān)性。

肺癌；R eprimo；多態(tài)性；哈迪一溫伯格平衡

1 材料和方法

1.1臨床資料

36例肺癌和23例非癌對(duì)照組病例選自2006年1月-2012年12月廣西省柳州市柳鐵中心醫(yī)院和外院手術(shù)切除或纖維支氣管鏡取得的肺（癌）組織，質(zhì)地良好，10%中性福爾馬林立即固定，石蠟包埋處理，室溫存檔至今；非癌對(duì)照組病例為肺支擴(kuò)、肺擴(kuò)張、非典型增生患者。

1.2提取DNA方法

選取TaKaRa DEXPAT試劑。肺（癌）組織加進(jìn)PE管（切片厚度為5μm），0.3 ml TaKaRa DEXPAT提取液，恒溫加熱儀100℃加熱10 min，低溫離心機(jī)12 000 rpm，4℃離心10 min形成分液層，吸取水層就可得到PCR擴(kuò)增用DNA。具體操作請(qǐng)參考說(shuō)明書。

1.3擴(kuò)增儀器和試劑

擴(kuò)增儀器：伯樂(lè)MJ Mini擴(kuò)增儀，試劑為TAKARA的MightyAmp DNA Polymerase試劑盒，正反向引物由上海生工合成,堿基序列為R1：5'-GCGCAGAACTTTGGAAGCTGC-3'；R2：5'-GCGC AGAACTTTGGAAGCTGG-3',R3：5'-AGGAGAAGAG TGGGAGCGC-3；R1R3針對(duì)839位點(diǎn)的G片段，擴(kuò)增235bp產(chǎn)物；R2R3針對(duì)839位點(diǎn)的C片段，擴(kuò)增235bp產(chǎn)物。

1.4PCR反應(yīng)體系

有了第二個(gè)角的測(cè)量經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于第三個(gè)角，學(xué)生想到把45°的角再折小點(diǎn)，經(jīng)過(guò)幾番嘗試，發(fā)現(xiàn)把45°角進(jìn)行三等分，每個(gè)角為15°，再用自制的量角工具進(jìn)行第三次量角，得出待測(cè)角與正方形里的15°角的兩邊剛好重合，是15°。

反應(yīng)體系為25μl:2×PCR Buffer 12.5μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，模板DNA 4μl，重蒸水7μl，酶（5 u/μl）0.5μl。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性5min，擴(kuò)增溫度98℃10 s、60℃15 s、68℃60 s，擴(kuò)增循環(huán)40次，最后68℃延伸4 min；PCR擴(kuò)增目的基因DNA的檢測(cè)：取10μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，χ2檢驗(yàn)評(píng)估對(duì)照組和病例組中各基因型的分布差異，t檢驗(yàn)評(píng)估年齡組差異，Logistic回歸分析多因素關(guān)系，以P=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)；哈迪一溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）檢測(cè)、Armitage's趨勢(shì)檢驗(yàn)、計(jì)算比值比（OR）及95%可信區(qū)間（CI），利用在線軟件（http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl）進(jìn)行計(jì)算，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1研究對(duì)象基本資料

收集肺癌患者36例。病理分組：小細(xì)胞癌組10例，大細(xì)胞癌組10例，腺癌組9例，鱗癌組7例；男性26例，平均（58.81±10.42）歲，女性10例，平均（54.40±9.58）歲，年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.161，P=0.254）。23例非癌對(duì)照患者，男性19例，平均（54.21±10.24）歲，女性4例，平均（50.00±6.16）歲，年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.784，P=0.442）。

2.2Reprimo基因分型和電泳

Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點(diǎn)各個(gè)基因型在瓊脂糖凝膠電泳顯示的條帶可為GG：235 bp；CC：235 bp；GC：235 bp。見附圖。

附圖　Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839 G>C位點(diǎn)基因型條帶圖譜

2.3Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

各組在Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839G>C位點(diǎn)基因型頻數(shù)（觀測(cè)/理論）GG，GC，CC和Hardy-Weinberg檢驗(yàn)具體見表1，判斷其符合Hardy-Weinberg平衡的標(biāo)準(zhǔn)為P>0.05。

表1　各組研究對(duì)象Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)

2.4基因多態(tài)性、患者性別、吸煙與否和年齡對(duì)肺癌發(fā)生的影響

2.4.1單因素分析基因多態(tài)性與肺癌與否關(guān)系的χ2檢驗(yàn)（χ2=6.394，P=0.041）；性別與肺癌與否關(guān)系的χ2檢驗(yàn)（χ2=0.837，P=0.360）；吸煙與否與肺癌與否關(guān)系的χ2檢驗(yàn)（χ2=1.639，P=0.200）；年齡與肺癌與否關(guān)系的χ2檢驗(yàn)（χ2=1.532，P=0.131），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.2多因素Logistic回歸分析以基因多態(tài)性、吸煙與否和年齡為3個(gè)自變量，肺癌與否為因變量做Logistic回歸分析，B為回歸系數(shù)，Exp（B）為相對(duì)危險(xiǎn)度，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2　多因素Logistic回歸分析

2.5Reprimo 839位點(diǎn)多態(tài)性與各組肺癌易感性的Armitage's趨勢(shì)檢驗(yàn)

攜帶C等位基因的患者比G等位基因的患者肺癌發(fā)病率低；攜帶GC、CC及GC+CC基因型的患者比GG基因型的患者肺癌發(fā)病率更低，各肺癌組Armitage's趨勢(shì)檢驗(yàn)情況具體見表3。

表3　各組肺癌Reprimo 839位點(diǎn)各基因模型Armitage's趨勢(shì)檢驗(yàn)

3 討論

基因Reprimo是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，含有109個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為12 kD，定位于人類染色體2q23；是P53基因的下游靶基因，異位表達(dá)的P53可引起ReprimomRNA表達(dá)，其過(guò)表達(dá)可使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯于G2期其機(jī)制可能是通過(guò)抑制Cdc2/cyclinB1和Cdc2活性核轉(zhuǎn)位的途徑來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[6]。

現(xiàn)報(bào)道Reprimo基因甲基化與腫瘤關(guān)系的論文很多，認(rèn)為其與腫瘤是否發(fā)生、治療方面存在一定的相關(guān)性[7-9]，而Reprimo基因多態(tài)性與腫瘤研究的報(bào)道較少，YE等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Reprimo基因3'非翻譯區(qū)的824位點(diǎn)存在G>C多態(tài)性，經(jīng)Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)高加索人群，證明該位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布均符合遺傳平衡規(guī)律[10]。BEASLEY等[11]在研究Reprimo基因3'非翻譯區(qū)824位點(diǎn)G>C多態(tài)性與大腸癌的關(guān)系時(shí)，健康組和大腸癌組也證實(shí)在該位點(diǎn)符合遺傳平衡規(guī)律，但憩室病組不符合此平衡規(guī)律。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組和非癌對(duì)照組在Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布不符合遺傳平衡狀態(tài)（P<0.05），但是肺癌病理分組中大細(xì)胞癌組、腺癌組、鱗癌組符合該規(guī)律（P>0.05）；小細(xì)胞癌組可認(rèn)為接近符合遺傳平衡狀態(tài)（P=0.045）。各肺癌組之間的基因型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.287，P=0.638）。不符合Hardy-weinberg平衡的原因可能是基因分型錯(cuò)誤，也可能是基因缺失/突變，也可能是樣品數(shù)不足夠大。

在相同致癌條件下，暴露人群只有一部分人會(huì)得肺癌，病因?qū)W研究表明不同個(gè)體對(duì)致癌物的易感性是有差異性的；分子流行病學(xué)提示遺傳傾向?qū)Υ蠖鄶?shù)肺癌可能起到關(guān)鍵性作用[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：基因多態(tài)性、患者性別、吸煙與否、年齡與肺癌發(fā)生與否作單因素分析時(shí)，基因多態(tài)性、年齡對(duì)肺癌發(fā)生與否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），患者性別、吸煙與否對(duì)肺癌發(fā)生與否無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。因吸煙為肺癌的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，因此以基因多態(tài)性、吸煙與否和年齡為3個(gè)自變量，以肺癌與否為因變量做Logistic回歸分析，3者在肺癌發(fā)生中不存在交互作用（P>0.05），但基因多態(tài)性相對(duì)危險(xiǎn)度最高，Exp（B）=5.369，說(shuō)明基因多態(tài)性在肺癌發(fā)生中起了重要作用。

BEASLEY等[11]研究Reprimo基因3'非翻譯區(qū)824位點(diǎn)G>C多態(tài)性與大腸癌的關(guān)系時(shí)，報(bào)道Reprimo基因824位點(diǎn)G>C多態(tài)性與大腸癌不存在相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點(diǎn)基因改變，攜帶C等位基因的患者比G等位基因的患者肺癌發(fā)病率低；攜帶GC、CC及GC+CC基因型的患者比GG基因型的患者肺癌發(fā)病率也明顯降低，Armitage's趨勢(shì)檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點(diǎn)基因改變，肺癌發(fā)生趨勢(shì)不是線性增加，但此處P=0.059，很接近0.05，可認(rèn)為基因多態(tài)性與肺癌發(fā)生還是具有一定相關(guān)性的，且在肺癌病理分組中大細(xì)胞癌、鱗癌與基因多態(tài)性存在相關(guān)性（P<0.05），腺癌、小細(xì)胞癌與基因多態(tài)性不存在相關(guān)性（P> 0.05）。

綜上所述Reprimo基因3'非翻譯區(qū)839位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌的發(fā)生具有一定相關(guān)性，尤其是攜帶G等位基因、GG基因型的患者更有可能發(fā)展成肺癌；基因多態(tài)性、患者性別、吸煙與否和年齡在肺癌發(fā)生中不存在交互作用，基因多態(tài)性相對(duì)危險(xiǎn)度最高。由于本實(shí)驗(yàn)樣本含量有限，且該位點(diǎn)基因不能解釋Reprimo基因所有位點(diǎn)的功能特性，在后續(xù)研究中有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本含量和實(shí)驗(yàn)，以期明確Reprimo基因單核苷酸多態(tài)性改變、基因類型與肺癌發(fā)生發(fā)展中關(guān)聯(lián)。

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（張蕾編輯）

Study of Reprimo 839 G＞C polymorphism and relationship with lung cancer*

Xian-huaChen1,Hong-boHu1,JinFeng1,Xiu-juanSun2,Da-yingLiu3
（1.Clinical laboratory，2.Pathology department，3.Respiratory medicine，Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital，Liuzhou，Guangxi 545007，China）

Objective To investigate the relationship between theReprimogene 3'-untranslated region 839 polymorphism and lung cancer.Methods Genotyping was performed with MightyAmp DNA Polymerase，a number of 36 lung cancer cases and 23 control cases were genotyped.The results of investigation were analyzed with χ2test，Logistic regression analysis and Armitage's trend test.Results According to Hardy-Weinberg equilibrium detection，Reprimo839 G＞C genotype observation（theory）frequency was 0，22，1（5.26，11.48，6.26）in the control group（with statistically significant difference，P=0.000）and 6，29，1（11.67，17.65，6.67）in the cancer group（with statistically significant difference，P=0.000）.Analyzed by Logistic regression analysis，gene polymorphism and age were risk factors，and there were no possible interactions among gene polymorphism，age，smoking status and lung cancer（P＞0.05）.Armitage's trend test revealed no statistically significant correlation between 839 G＞C polymorphism and susceptibility to lung cancer（χ2=3.56，P=0.059）.Conclusions This study indicates that there is a correlation between theReprimogene 3'-untranslated region 839 G＞C polymorphism and lung cancer.

lung cancer；reprimo；polymorphism；hardy-weinberg equilibrium

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.004

1005-8982（2016）20-0016-05

2016-02-23

柳州市科學(xué)技術(shù)局技術(shù)研究與開發(fā)計(jì)劃課題（No：2011J0302031）；廣西衛(wèi)生廳計(jì)劃課題（No：Z2010138）