劉霞，王帥，武躍明，司海超，王婷，司伏生

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)系，河南 南陽 473000；3.河南省南陽市中心醫(yī)院麻醉科，河南 南陽 473000）

河南省部分地區(qū)人群散發(fā)戊型肝炎流行病學(xué)及病毒基因型分析*

劉霞1，王帥2，武躍明2，司海超3，王婷2，司伏生2

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)系，河南 南陽 473000；3.河南省南陽市中心醫(yī)院麻醉科，河南 南陽 473000）

目的研究分析河南省南陽地區(qū)散發(fā)戊型肝炎的流行病學(xué)特征及流行毒株的基因型。方法在對(duì)目標(biāo)人群的戊型肝炎流行病學(xué)調(diào)查過程中，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)采集到的血清樣本進(jìn)行抗體檢測(cè)，對(duì)其中抗體為陽性的戊型肝炎病例，通過巢式PCR（nested R T-PCR）方法，擴(kuò)增基因組OR F2區(qū)域150bp的片段并進(jìn)行測(cè)序及生物信息學(xué)分析。結(jié)果本研究采集到的1100份血清樣品中有295份血清戊肝抗體陽性，陽性率26.8%。男女戊肝患病比為1.86︰1，戊肝患者中男性多于女性，80.3%的患者集中在35歲及以上的年齡組。HEV R NA檢測(cè)表明128份血清陽性，陽性率43.4%，病毒序列在分型上屬于基因4型，與中國(guó)西安株的核苷酸序列同源性最高。結(jié)論南陽地區(qū)的戊肝以散發(fā)為主，基因4型是該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)基因型。本地區(qū)戊肝的親緣關(guān)系與中國(guó)西安株最近，推斷兩地毒株可能來源于戊肝病毒的同一種系。

戊型肝炎；病毒；流行病學(xué)；基因

戊型肝炎（hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）感染而引起的急性自限性病毒性肝炎，主要經(jīng)糞口途徑傳播，引起戊型肝炎（HE）的流行和散發(fā)。戊型肝炎是個(gè)新發(fā)的全球性疾病，在世界上越來越多的國(guó)家發(fā)生和流行[1-2]。人對(duì)HEV普遍易感，病人發(fā)病癥狀嚴(yán)重，病死率高，青壯年戊肝病死率可達(dá)1%～2%，遠(yuǎn)較其他各型肝炎高，妊娠婦女患HEV的死亡率高達(dá)10%～25%，給人類健康造成嚴(yán)重威脅[3]。我國(guó)為HEV流行區(qū)，1986～1988年在我國(guó)南疆地區(qū)曾發(fā)生過戊肝的大流行，并造成707例死亡，對(duì)人類健康造成了嚴(yán)重威脅[4]。河南省未發(fā)生過戊肝的暴發(fā)流行，但近年來散發(fā)病例逐漸增多。由于HEV基因組自身的特點(diǎn)及其準(zhǔn)種現(xiàn)象的存在[5]，不同地區(qū)HEV的序列變異情況較大并且具有地方特異性，因此國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果并不能完全代表河南省的具體情況。本研究對(duì)HEV在河南省的流行情況及其基因組的序列進(jìn)行分析，以便研究其序列變異情況并為有效地監(jiān)控該病提供理論性參考。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器

1.2標(biāo)本來源

本研究中血清樣品主要來源于南陽、信陽及鄭州3地，為2013年1月-2013年12月住院治療的肝炎病患者血清樣本。此外，還有南陽市疾病預(yù)防控制中心對(duì)下轄區(qū)縣檢測(cè)到的急性黃疸及肝功能異常人群的血清樣本。對(duì)所獲得的樣本按照性別、年齡、臨床癥狀及既往病史等進(jìn)行詳細(xì)的登記調(diào)查。

1.3抗體檢測(cè)

對(duì)收集到的血清首先進(jìn)行抗HEV IgG抗體的檢測(cè)，抗體檢測(cè)試劑盒購自北京萬泰藥業(yè)股份有限公司，詳細(xì)檢測(cè)步驟及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照說明書所要求的進(jìn)行。

1.4引物設(shè)計(jì)及合成

對(duì)HEV抗體陽性的血清樣品進(jìn)行病毒RNA的提取并進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，利用DNA star和Primer 5.0軟件，選擇HEV ORF2區(qū)域作為RT-nPCR及基因分型引物，該引物公認(rèn)能夠擴(kuò)增HEV多個(gè)基因型的毒株，PCR產(chǎn)物大小為150 bp。引物序列如下：外引物：H1（5'-CTGTTTAAYCTTGCTGACAC-3'），H2（5'-WGARAGCCAAAGCACATC-3'）；內(nèi)引物：H3（5'-GACAGAATTGATTTCGTCG-3'），H4（5'-TGYTG GTTRTCRTAATCCTG-3'）。引物由上海生工有限公司進(jìn)行合成。

1.5RNA的提取及擴(kuò)增

抗體陽性血清用TRIZOL Reagent進(jìn)行裂解后提取病毒RNA，最后溶解到DEPC水中。然后以病毒RNA為模板用M-MLV Reverse Transcriptase和Prime STAR HS DNA polymerase進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，合成病毒cDNA。PCR反應(yīng)條件和程序參考說明書進(jìn)行，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確認(rèn)。

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1.6基因克隆、測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析

用膠回收試劑盒對(duì)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后的片段進(jìn)行純化回收，目的DNA連接至T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布平板過夜生長(zhǎng)后挑取克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得的質(zhì)粒送華大基因進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得的序列用CLUSTAL-W（version 1.8）進(jìn)行序列比對(duì)，計(jì)算核苷酸序列的同源性，用Mega 4.0繪制構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1HEV IgG抗體檢測(cè)

本研究中，河南的南陽（980）例、信陽（60）例、鄭州（60）例，3地共采集到肝炎患者血清1 100份，經(jīng)抗體檢測(cè)，戊肝抗體陽性病例295例，占總數(shù)的26.8%。其中南陽、信陽、鄭州的戊肝病例數(shù)分別為272例、10例和13例，戊肝占各地肝炎患者病例分別為27.8%、16.7%和21.7%，信陽地區(qū)的戊肝病例比例低于其他兩個(gè)地區(qū)。

2.2戊肝病例年齡及性別分布特征

295例戊肝患者中，男性192例，女性103例，男︰女=1.86︰1。在戊肝患者中年齡最小18歲，最大的為68歲，80.3%的患者集中在35歲及以上的年齡組（見附表）。尤其以40～60歲年齡組占多數(shù)（58%）。

附表　戊肝病例的年齡與性別分布特征

2.3戊肝發(fā)病季節(jié)分布特征

2013年全年確定的295例戊肝病例中，在全年每個(gè)月份都有發(fā)生。61.7%的病例集中在前5月份和11、12月份之間（見圖1）。戊肝病例在季節(jié)分布上，從11月份開始逐步增多，直至到5月份，其中4月份的戊肝發(fā)病數(shù)達(dá)到最高峰。

圖1　2013年1～12月戊肝發(fā)病時(shí)間分布特征

2.4PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增、測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析

本研究中對(duì)295份戊肝抗體陽性的患者血清標(biāo)本進(jìn)行HEV RNA檢測(cè)，陽性病例128例，陽性率43.4%。擴(kuò)增出的目的片段均送上海生工測(cè)序，進(jìn)行序列分析及BLAST比對(duì)。結(jié)果表明128份樣品中，全部為基因4型病例，陽性率達(dá)100%，進(jìn)一步表明河南省南陽市戊肝患者的基因型以4型為主。

用DNA star（version 7.0）和CLUSTAL-W（version 1.8）軟件對(duì)來國(guó)內(nèi)主要省份及國(guó)外代表性毒株基因組本區(qū)段的核苷酸同源性進(jìn)行比較。去除重復(fù)性的序列，本研究選取其中3株代表性的毒株用Mega 4.0繪制構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果表明，本研究中的擴(kuò)增序列與中國(guó)的西安分離株JKO-Chi Sai 98C（ac cession number：AB197673）在同一進(jìn)化分支上，同屬于基因4型，進(jìn)一步提示南陽市散發(fā)戊肝病例的基因型主要是4型，且基因4型是本地的優(yōu)勢(shì)基因型和主要致病毒株（見圖2）。

圖2　HEV代表性毒株和參考序列基于ORF2 150 bp片斷構(gòu)建的進(jìn)化樹（●為本文分離株）

3 討論

近年來的驗(yàn)證表明，戊型肝炎由原來的在亞洲、非洲等發(fā)展中國(guó)家的暴發(fā)流行逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿蚍秶鷥?nèi)的散發(fā)流行，成為威脅全球人類健康的一個(gè)世界性問題[1]。最近的研究表明，在無償獻(xiàn)血者的血液中及器官移植患者體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)有感染HEV的報(bào)道[6-11]，并且出現(xiàn)甲肝和戊肝的混合感染[12]。為了研究河南省南陽市的戊肝流行情況本研究進(jìn)行了連續(xù)12個(gè)月的戊肝病例篩查，共發(fā)現(xiàn)戊肝病例295例。本研究表明，年齡與性別是戊肝感染的影響因素。本研究戊肝患者中年齡最小18歲，最大的為68歲，80.3%的患者集中在35歲及以上的年齡組。在關(guān)于戊肝發(fā)病男女性別比的報(bào)道中，不同研究者有不同的說法，如最新研究中有報(bào)道戊肝患者男女之比為1.85︰1[13]，2.99︰1[14]，1.58︰1[15]。本研究中戊肝患者男女之比為1.86︰1，支持男性比女性更易感戊肝的結(jié)論。戊肝患者中男性多于女性，80.3%的患者集中在35歲及以上的年齡組，可能原因是：隨著人群年齡的增長(zhǎng)，其活動(dòng)范圍越來越大，生活方式也越來越多樣化，因此感染戊肝的幾率也就越來越大。此外，季節(jié)也是戊肝感染率變化的一個(gè)影響因素。本研究中的戊肝病例呈全年散發(fā)，前5個(gè)月和11、12月份是戊肝的高發(fā)季節(jié)，占全年發(fā)病總數(shù)的61.7%。

為了初步調(diào)查河南其他地區(qū)的戊肝流行情況，筆者從河南省會(huì)鄭州市和南陽市臨近的信陽市各采集60份血清樣品，調(diào)查結(jié)果顯示鄭州市和信陽市的戊肝陽性率分別為21.7%和16.7%，低于南陽市的27.8%。這可能和南陽市人口多，人員流動(dòng)性大，生活方式多樣化有一定的關(guān)系。為了進(jìn)一步查明南陽市流行的戊肝基因型，筆者對(duì)295份戊肝抗體陽性的患者血清標(biāo)本進(jìn)行HEV RNA檢測(cè)，陽性病例128例，陽性率43.4%。擴(kuò)增出的目的片段經(jīng)測(cè)序BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)全部為基因4型，與近年來國(guó)內(nèi)主要流行毒株基因型一致。

在核苷酸的同源性方面，本研究中分離到3株病毒株NY-1、NY-2、NY-3與中國(guó)分離株CCC220（長(zhǎng)春株）、JYI-Chi Sai 01C（上海株）和JKO-ChiSai 98C（西安株）在同一進(jìn)化分支上。其中與西安分離株JKO-ChiSai98C（accession number：AB197673）的親緣關(guān)系為最高，同屬于基因型4型。說明分離到的病毒株較為穩(wěn)定，未發(fā)生較大的變異情況。地理分布上南陽與西安有較近的地緣關(guān)系，人員往來較為頻繁，這為病毒在兩地的快速傳播提供了較為便利的條件。

本研究通過一年的監(jiān)測(cè)，對(duì)南陽市戊肝的流行情況進(jìn)行初步的研究，調(diào)查結(jié)果表明南陽市的戊肝患者以散發(fā)為主。選取代表性毒株進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本地感染人的戊肝基因型為4型。該結(jié)果將為以后更好的防控該病提供重要理論參考。

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（張蕾編輯）

Epidemiological and genotype analysis of sporadic Hepatitis E in some parts of Henan*

Xia Liu1，Shuai Wang2，Yue-ming Wu2，Hai-chao Si3，Ting Wang2，F(xiàn)u-sheng Si2
（1.School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212013，China；2.Department of medical technology，Nanyang Medical College，Nanyang，Henan 473000，China；3.Anesthesiology Department，Nanyang Central Hospital，Nanyang，Henan 473000，China）

Objective To investigate the epidemiological characteristics of the sporadic Hepatitis E infection cases in Nanyang area.Methods In the investigation process of the target population，ELISA was used to detect the antibodies in the collected serum samples.The 150bp fragments of the ORF2 were amplified from the positive samples by nested RT-PCR and the target fragments were sequenced and analyzed.Results 295 of 1100 serum samples were HEV antibody positive，and the positive rate was 26.8%.Sporadic hepatitis E cases of 80.3%occurred with age over 35，and the male to female ratio was 1.86：1.A total of 128 serum samples were HEV RNA positive，and the viral sequences belonged to the genotype 4 with the maximum homology to Xi'an isolate.Conclusions Hepatitis E sporadic in Nanyang area and genotype 4 is the predominant strain in the city.The strains isolated in Nanyang have the closest relationship with Xi'an isolate，and this maybe infer that these two strains probably originate from the same HEV strain.

Hepatitis E；Virus；Epidemiology；Genotype

R 512.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.003

1005-8982（2016）20-0012-04

2016-05-09

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目資助（No：13B310179）

司伏生，E-mail：mr.fusheng@163.com