劉曉蕾，高磊，崔娜

（河北省保定市第一中心醫(yī)院1.血液內(nèi)科，2.彩超室，3.婦科，河北 保定 071000）

免疫毒素CCL25-PE38抗急性T淋巴細(xì)胞白血病實(shí)驗(yàn)研究

劉曉蕾1，高磊2，崔娜3

（河北省保定市第一中心醫(yī)院1.血液內(nèi)科，2.彩超室，3.婦科，河北 保定 071000）

目的探討免疫毒素CCL25-PE38對急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）細(xì)胞系MOLT4（天然高水平表達(dá)CCR 9）的殺傷作用，以期為T-ALL的靶向治療提供基礎(chǔ)。方法通過流式細(xì)胞術(shù)、共聚焦顯微術(shù)檢測CCL25-PE38與MOLT4細(xì)胞的結(jié)合及內(nèi)化，Transwell趨化小室檢測其趨化能力，細(xì)胞增殖試劑WST-1檢測其細(xì)胞殺傷能力，Annexin V-FITC/PI染色檢測其凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，建立SCID小鼠白血病細(xì)胞異種移植腫瘤（CCR 9+腫瘤）模型檢測CCL25-PE38的抑瘤效果。結(jié)果WST-1檢測結(jié)果顯示CCL25-PE38能特異性殺傷MOLT4細(xì)胞；Annexin V-FITC/PI染色顯示CCL25-PE38主要通過凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)引起MOLT4細(xì)胞死亡；在SCID小鼠白血病細(xì)胞異種移植瘤模型中，注入CCL25-PE38能緩解CCR 9+腫瘤的生長。結(jié)論CCL25-PE38通過凋亡誘導(dǎo)作用引起MOLT4細(xì)胞死亡，緩解異種移植CCR 9+腫瘤的生長。

CCL25-PE38；急性T淋巴細(xì)胞白血??；免疫毒素

白血病在全球發(fā)病率呈上升趨勢，我國白血病發(fā)病率為十萬分之三，每年約新增40 000例患者。白血病表現(xiàn)為骨髓造血組織惡性增生，形成大量異常的白細(xì)胞，廣泛浸潤組織器官，引起多種組織器官不可逆損害，直接威脅患者生命。白血病的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)與白血病細(xì)胞及其生長微環(huán)境相互作用密切相關(guān)。免疫毒素是一種由抗體或細(xì)胞因子與化學(xué)毒素耦合組成的融合蛋白。通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和隨后的毒素成分被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，并與二磷酸腺苷結(jié)合，核糖基化延伸因子2（EF-2），從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成被抑制和靶細(xì)胞死亡[1]。PE38，38 kD的截短型綠膿桿菌外毒素A的衍生物，已被廣泛作為免疫毒素毒素組分。例如，抗CD22的重組免疫毒素BL22，基于PE38的作用治療毛細(xì)胞白血病證明是成功的[2]。重組免疫毒素8H9-PE38用于乳腺癌，骨肉瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療[3]。因此，重組免疫毒素可能是一種用于治療癌癥患者，尤其是血液腫瘤患者有前途的方法。以趨化因子受體介導(dǎo)的免疫治療是一個極具吸引力的策略。本研究推測，毒素與趨化因子融合構(gòu)成的新型免疫毒素，可能對高水平表達(dá)CCR9的急性T淋巴細(xì)胞白血?。═ lineageacutelymphoblastic leukemia，T-ALL）細(xì)胞的存活產(chǎn)生影響。為了檢驗(yàn)該假設(shè)，本研究設(shè)計一個免疫毒素分子CCL25-PE38，構(gòu)建其真核表達(dá)載體，并表達(dá)在真核細(xì)胞293T中，然后檢測其對T-ALL細(xì)胞系MOLT4的殺傷作用以及抗MOLT4細(xì)胞異種移植腫瘤效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑MOLT4細(xì)胞（自然高水平表達(dá)CCR9），小鼠成纖維細(xì)胞L929，HEK 293T細(xì)胞購自美國模式菌科收集中心，RPMI 1640、DMEM、胰酶來源于美國Hyclone公司，青霉素、鏈霉素購自美國Sigma公司，F(xiàn)etal bovine serum（FBS）購自美國Gibco公司，限制性內(nèi)切酶來源于美國NewEngland Biolabs公司，pcDNA3.1（+）載體來源于美國Invitrogen公司，Wizard Plus Maxipreps DNA Purification System來源于Promega，EntransterTM-D來源于中國Engreen，重組人-CCL25來源于美國Peprotech公司，鼠抗人CCR9單克隆抗體購自美國R&D公司，BCA蛋白分析試劑盒購自碧云天生物有限公司，過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG，F(xiàn)ITC/R-PE標(biāo)記羊抗兔IgG，R-PE標(biāo)記驢抗鼠IgG（H+L）來源于美國Protein Tech公司，Annexin V-FITC試劑盒來源于美國BD公司，細(xì)胞增殖試劑WST-1來源于美國Roche公司，甘油來源于美國Sigma公司。

1.1.2主要儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），Eppendorf PCR儀（德國Eppendorf AG公司），Air Tech超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），KHB CT-360自動多功能酶標(biāo)儀（上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司），GENE GENIUS凝膠成像分析系統(tǒng)（英國Syngene公司），Eppendorf移液器（德國Eppendorf AG公司），Eppendorf臺式冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf AG公司），蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)印儀（北京六一），Transwell趨化小室（美國Corning公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Forma公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司），共聚焦顯微鏡（德國Leica）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1重組免疫毒素CCL25-PE38靶向殺傷MOLT4細(xì)胞實(shí)驗(yàn)收集1×105MOLT4細(xì)胞，PBS洗滌。分別取CCL25-PE38、PE38（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0及2.0 nmol/ml，PBS稀釋），加至細(xì)胞懸液中，混合后加至96孔板的各小孔中。以PBS處理作為陰性對照組。37℃、二氧化碳CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，加入10μl WST-1（美國Roche公司）繼續(xù)培養(yǎng)4h。酶標(biāo)儀測定450nm下的光密度（optical density，OD）值。同時為檢測CCL25-PE38對MOLT4細(xì)胞的特異性殺傷作用依賴于CCR9，設(shè)立CCL25-PE38加抗CCR9抗體（美國R&D公司）處理組。收集MOLT4細(xì)胞，PBS洗滌1次。先用抗CCR9抗體處理1 h，然后加入CCL25-PE38。其他處理同上。為檢測CCL25-PE38對CCR9-細(xì)胞增殖能力的影響，收集1×105L929細(xì)胞，PBS洗滌1次。取CCL25-PE38（0.5 nmol/ml，PBS稀釋），加至細(xì)胞懸液中，混合后加至96孔板的各小孔中。以PBS處理作為陰性對照組。37℃、二氧化碳CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，加入10μl WST-1繼續(xù)培養(yǎng)4h。酶標(biāo)儀測定450nm下的OD值。重組免疫毒素CCL25-PE38凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，收集1×105MOLT4細(xì)胞，PBS洗滌1次。取CCL25-PE38（0.5nmol/ml，PBS稀釋），加至細(xì)胞懸液中，混合物加至24孔板的各小孔中。37℃、二氧化碳CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24及48 h。離心收集處理后的細(xì)胞，結(jié)合緩沖液洗滌1次，加入AnnexinV-FITC/PI（美國BD公司）于暗處孵育15 min。立即上流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）進(jìn)行檢測。

1.2.2重組免疫毒素CCL25-PE38抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

MOLT4細(xì)胞異種移植腫瘤（CCR9+）模型建立：SCID小鼠由武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，6～8周齡，雌性，許可證編號：SCXK（鄂）2008-2004。小鼠飼養(yǎng)在無菌隔離器中。一周后無菌條件下將MOLT4細(xì)胞接種至SCID小鼠背部皮下（1×107/只），接種后約7～9 d可觸及到約300mm3大小的腫瘤塊，將未長出腫瘤的小鼠棄掉不用，余下動物分成3組，每組5只。重組免疫毒素CCL25-PE38處理及抗瘤效果觀察：于第9天開始分別經(jīng)尾靜脈注射（靜脈注射不成功的采用腹腔注射）CCL25-PE38、PE38（0.5 nmol/只/d）、PBS；連續(xù)注射14 d。每隔一天測量瘤體的長和寬，并計算瘤體大小。至實(shí)驗(yàn)第29天，采取頸椎脫臼方式將SCID荷瘤小鼠處死，剝離腫瘤體并稱重。HE染色：用4%中性甲醛固定剝離得到的腫瘤，送本校組織胚胎學(xué)教研室進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色。在顯微鏡下觀察腫瘤塊組織學(xué)特點(diǎn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測CCR9+腫瘤中CCR9的表達(dá)情況：無菌條件下碾磨腫瘤塊，使用200目的細(xì)胞濾網(wǎng)收集腫瘤細(xì)胞，PBS洗滌2次。傳代培養(yǎng)3次后，收集細(xì)胞檢測其表面CCR9的表達(dá)水平。分離收集各處理組1×105細(xì)胞，加10μg/mL的抗CCR9單克隆抗體（美國R&D公司）至細(xì)胞懸液中，于4℃孵育1 h，以MOLT4細(xì)胞作為對照，加入PBS處理。PBS洗滌2遍后，加入RPE標(biāo)記的羊抗鼠IgG（美國ProteinTech公司），4℃孵育30min。PBS洗滌2次后上流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）進(jìn)行檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graph Prism 5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)比較的t檢驗(yàn)處理和單因素方差分析，定性資料用獨(dú)立樣本R×C列聯(lián)表資料的χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1免疫毒素CCL25-PE38靶向殺傷MOLT4細(xì)胞能力檢測

為檢測免疫毒素CCL25-PE38對細(xì)胞存活的影響，本研究檢測免疫毒素CCL25-PE38對MOLT4細(xì)胞的殺傷作用以及對L929細(xì)胞增殖的影響。如圖1所示，CCL25-PE38能特異性殺傷MOLT4細(xì)胞，隨著免疫毒素CCL25-PE38濃度的增加其殺傷效應(yīng)也隨著增強(qiáng)，同時其殺傷作用能被抗CCR9的抗體特異性阻斷。CCL25-PE38對CCR9表達(dá)陰性細(xì)胞的增殖無影響。

圖1　免疫毒素CCL25-PE38細(xì)胞毒作用檢測

2.2免疫毒素CCL25-PE38凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)

為探討免疫毒素殺傷MOLT4細(xì)胞的機(jī)制，本研究檢測免疫毒素誘導(dǎo)MOLT4細(xì)胞凋亡的作用。隨著CCL25-PE38作用于MOLT4細(xì)胞時間的增加，發(fā)生凋亡的MOLT4細(xì)胞數(shù)（Annexin-V FITC陽性和Annexin-FITC、PI雙陽性細(xì)胞）逐漸增加，見圖2。24 h凋亡率為30.7%，48h凋亡率達(dá)到41.3%。與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見附表。

圖2　免疫毒素CCL25-PE38誘導(dǎo)MOLT4細(xì)胞凋亡效應(yīng)

附表　兩組免疫毒素CCL25-PE38誘導(dǎo)MOLT4細(xì)胞凋亡效應(yīng)的比較%

2.3免疫毒素CCL25-PE38抗CCR9+腫瘤效應(yīng)

為進(jìn)一步驗(yàn)證免疫毒素特異性殺傷白血病細(xì)胞的能力，本研究檢測免疫毒素在體內(nèi)抗CCR9+腫瘤作用。首先建立MOLT4細(xì)胞異種移植CCR9+腫瘤，接種MOLT4細(xì)胞9 d后，可檢測到大小為300 mm3瘤體。然后注入CCL25-PE38并觀察其對移植腫瘤生長的影響。如圖3所示，注入CCL25-PE38 12d以后能觀察到瘤體的的生長受到抑制。而PBS及PE38處理組瘤體的體積持續(xù)增長。因此，采用靜脈注射重組免疫毒素CCL25-PE38能有效緩解SCID小鼠異種移植腫CCR9+瘤的生長。

圖3　免疫毒素CCL25-PE38抑制異種移植CCR9+腫瘤的生長

2.4HE染色結(jié)果

為驗(yàn)證CCL25-PE38體內(nèi)抑瘤作用，本研究制作腫瘤組織切片并作HE染色。通過組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CCL25-PE38處理組與對照組比較血管分布密度減少，腫瘤細(xì)胞數(shù)目明顯減少。見圖4。

圖4　腫瘤組織HE染色結(jié)果

2.5CCR9+腫瘤中CCR9的表達(dá)水平

圖5　不同處理組來源的腫瘤細(xì)胞表面CCR9表達(dá)水平

在本實(shí)驗(yàn)中，盡管免疫毒素CCL25-PE38能有效緩解異種移植CCR9+腫瘤生長，但是不能完全消除腫瘤。為探究產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因，采用FCM檢測了來源于各組瘤體中細(xì)胞表面CCR9的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CCL25-PE38處理組，CCR9的表達(dá)水平明顯降低（66.9%），而PBS和PE38處理組腫瘤細(xì)胞表面CCR9水平未有明顯改變，見圖5。因而可推測CCR9表達(dá)水平的下降可能與MOLT4細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)后部分細(xì)胞不再表達(dá)CCR9有關(guān)。

3 討論

趨化因子和趨化因子受體在疾病發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用[4]。最近有研究報道，CCX282-B，一個潛在的人CCR9拮抗劑，對腸道炎癥具有較好的治療效果[5]。此外，文獻(xiàn)[6]報道，下調(diào)CXCR4的表達(dá)抑制癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。針對趨化因子和/或趨化因子受體可能對控制相關(guān)疾病的發(fā)展進(jìn)程具有治療效果。CCR4單克隆抗體已被證明可以誘導(dǎo)T-ALL患者白血病細(xì)胞的死亡，抑制表達(dá)CCR4腫瘤的進(jìn)展[7-9]。該作用導(dǎo)致細(xì)胞的死亡有賴于抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，但是該治療方式與患者的免疫功能狀態(tài)有關(guān)。而針對趨化因子或趨化因子受體與細(xì)胞毒性藥物的免疫毒素，直接殺傷靶細(xì)胞可能提供更好的治療效果。

PE38具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡作用已被廣泛用作免疫毒素的毒素成份[10-12]。在本研究中，WST-1檢測結(jié)果顯示，CCL25-PE38特異性殺死MOLT4細(xì)胞，但不殺傷L929細(xì)胞。重要的是靶向殺傷作用可被CCR9中和性抗體有效地阻斷，再次確認(rèn)CCL25-PE38對MOLT4細(xì)胞的殺傷作用是由CCR9介導(dǎo)的。隨后Annexin V-FITC/PI染色的結(jié)果表明，CCL25-PE38呈時間依賴性誘導(dǎo)MOLT4細(xì)胞的凋亡。另一項(xiàng)研究報道與本研究一致的結(jié)果，VGEFPE38融合毒素進(jìn)入胞漿后可誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[13-15]。此外，本研究通過向SCID小鼠注射MOLT4細(xì)胞建立白血病細(xì)胞荷瘤（CCR9+腫瘤）模型，探討CCL25-PE38對異種移植CCR9+腫瘤生長的影響。在SCID小鼠白血病細(xì)胞移植瘤模型中，注入CCL25-PE38能有效緩解CCR9+腫瘤的生長。經(jīng)FCM檢測發(fā)現(xiàn)瘤體（CCL25-PE38處理組）中分離的腫瘤細(xì)胞CCR9的表達(dá)水平下降，提示有可能一部分細(xì)胞在體內(nèi)喪失表面CCR9分子，對CCL25-PE38產(chǎn)生耐受。因此，提高免疫毒素CCL25-PE38的抗腫瘤效果是本研究下一步的工作目標(biāo)，可能通過以下途徑：①生物信息學(xué)方法，優(yōu)化CCL25-PE38結(jié)構(gòu)，以增加CCL25-PE38活性；②提高CCL25-PE38的穩(wěn)定性，以促進(jìn)其吸收；③使用與其他治療方法如化療相結(jié)合的策略。另外，為進(jìn)一步研究免疫毒素CCL25-PE38體內(nèi)抗白血病作用，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：建立小鼠白血病模型，觀察CCL25-PE38治療白血病效果；觀察CCL25 -PE38的免疫原性、毒性、體內(nèi)代謝等情況。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，免疫毒素CCL25-PE38能特異性殺傷高水平表達(dá)CCR9的MOLT4細(xì)胞，而不影響CCR9受體陰性細(xì)胞。此外，體內(nèi)研究表明，CCL25-PE38能緩解CCR9+腫瘤的生長。所以，CCL25-PE38在此呈現(xiàn)的生物活性使其有可能成為潛在治療高水平表達(dá)CCR9癌癥潛在的生物制劑，特別是T-ALL。

[1]PASTAN I,HASSAN R,FITZGERALD D J,et al.Immunotoxin treatment of cancer[J].Annu Rev Med,2007,58(1250):221-237.

[2]PEREZ-ATAYDE A R,SALLAN S E,TEDROW U,et al.Spectrum of tumor angiogenesis in the bone marrow of children with acute lymphoblastic leukemia[J].Am J Pathol,1997,150(3):815-821.

[3]SUMINOE A,MATSUZAKI A,HATTORI H,et al.Expression of matrix metalloproteinase(MMP)and tissue inhibitor of MMP (TIMP)genes in blasts of infant acute lymphoblastic leukemia with organ involvement[J].Leuk Res,2007,31(10):1437-1440.

[4]BECKER S E.The disease with hope:hairy cell leukemia[J]. Clin J Oncol Nurs,2007,11(5):731-735.

[5]ONDA M,WANG Q C,GUO H F,et al.In vitro and in vivo cytotoxic activities of recombinant immunotoxin 8H9(Fv)-PE38 against breast cancer,osteosarcoma,and neuroblastoma[J].Cancer Res,2004,64(4):1419-1424.

[6]WALTERS M J,WANG Y,LAI N,et al.Characterization of CCX282-B,anoral lybioavailableantagonistoftheCCR9 chemokine receptor,for treatment of inflammatory bowel disease[J]. J Pharmacol Exp Ther,2010,335(1):61-69.

[7]YADAV V R,SUNG B,PRASAD S,et al.Celastrol suppresses invasion of colon and pancreatic cancer cells through the downregulation of expression of CXCR4 chemokine receptor[J].J Mol Med,2010,88(12):1243-1253.

[8]ISHIDA T,IIDA S,AKATSUKA Y,et al.The CC chemokine receptor 4 as a novel specific molecular target for immunotherapy in adult T-Cell leukemia/lymphoma[J].Clin Cancer Res,2004, 10(22):7529-7539.

[9]CHARRAD R S,GADHOUM Z,QI J,et al.Effects of anti-CD44 monoclonal antibodies on differentiation and apoptosis of human myeloid leukemia cell lines[J].Blood,2002,99(1):290-299.

[10]SONG G,LIAO X,ZHOU L,et al.HI44α,an anti-CD44 monoclonalantibody,induces differentiation and apoptosis of human acute myeloid leukemia cells[J].Leuk Res,2004,28(10): 1089-1096.

[11]KOURTI M,VAVATSI N,GOMBAKIS N,et al.Expression of multidrug resistance 1(MDR1),multidrug resistance-related protein 1(MRP1),lung resistance protein(LRP),and breast cancer resistance protein(BCRP)genes and clinical outcome in childhood acute lymphoblastic leukemia[J].Int J Hematol,2007, 86(2):166-173.

[12]KEPPLER-HAFKEMEYERA,KREITMAN R J,PASTAN I. Apoptosis induced by immunotoxins used in the treatment of hematologic malignancies[J].Int J Cancer,2000,87(1):86-94.

[13]HU C C,KE Y Q,SUN X L,et al.Human mesenchymal stem cells-like cells as cellular vehicles for delivery of immunotoxin in vitro[J].Biotechnol Lett,2009,31(2):181-189.

[14]KAKINUMA T,HWANG S T.Chemokines,chemokine receptors, and cancer metastasis[J].Journal of Leukocyte Biology,2006,79(4): 639-651.

[15]SEEMA S,ANGURAJ S,RAKESH K.Chemokines in tumor angiogenesis and metastasis[J].Cancer Metastasis Rev,2007,26(3/4): 453-467.

（張蕾編輯）

Study of CCL25-PE38 immunotoxin in treatment of T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL）

Xiao-lei Liu1，Lei Gao2，Na Cui3
（1.Department of Hematology，Baoding First Central Hospital，Baoding，Hebei 071000，China；2.Ultrasound Department，Baoding First Central Hospital，Baoding，Hebei 071000，China；3.Gynecology，Baoding First Central Hospital，Baoding，Hebei 071000，China）

Objective To investigate the killing effect ofCCL25-PE38immunotoxin on MOLT4 cell line in T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL）（CCR9natural high-level expression），and to provide the foundation of targeting treatment of T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL）.Methods Flow cytometryn and confocal microscopy were used to detect the binding and internalization of CCL25-PE38 and MOLT4 cells.Transwell chemotaxis chamber method was used to detect the chemotaxis.Cell Proliferation Reagent WST and Annexin VFITC/PI stain were used to detect killing ability of cells and the apoptosis induced effect respectively.And antitumous effect ofCCI25-PE38was detected by building the SCID leukemia cells in mice xenograft tumor（CCR9+tumors）model.Results WST-1 test showed thatCCL25-PE38produce specific lethal effect on MOLT4 cell. Annexin V-FITC/PI stain showed that the cause of death of MOLT4 cells was induced by apoptosis ofCCL25-PE38. Injection ofCCL25-PE38in SCID leukemia cells in mice xenograft tumor（CCR9+tumors）model can retard growth speed of CCR9+cancer.Conclusions The cause of death of MOLT4 is induced by apoptosis-inducing effect of CCL25-PE38，which can retard the growth of CCR9+xenotransplanted tumors.

CCL25-PE38；T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL）；immunotoxin

R 733.71

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.002

1005-8982（2016）20-0006-06

2016-02-18