劉曉蕾,高磊,崔娜
(河北省保定市第一中心醫(yī)院1.血液內(nèi)科,2.彩超室,3.婦科,河北 保定 071000)
免疫毒素CCL25-PE38抗急性T淋巴細(xì)胞白血病實(shí)驗(yàn)研究
劉曉蕾1,高磊2,崔娜3
(河北省保定市第一中心醫(yī)院1.血液內(nèi)科,2.彩超室,3.婦科,河北 保定 071000)
目的探討免疫毒素CCL25-PE38對急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL)細(xì)胞系MOLT4(天然高水平表達(dá)CCR 9)的殺傷作用,以期為T-ALL的靶向治療提供基礎(chǔ)。方法通過流式細(xì)胞術(shù)、共聚焦顯微術(shù)檢測CCL25-PE38與MOLT4細(xì)胞的結(jié)合及內(nèi)化,Transwell趨化小室檢測其趨化能力,細(xì)胞增殖試劑WST-1檢測其細(xì)胞殺傷能力,Annexin V-FITC/PI染色檢測其凋亡誘導(dǎo)效應(yīng),建立SCID小鼠白血病細(xì)胞異種移植腫瘤(CCR 9+腫瘤)模型檢測CCL25-PE38的抑瘤效果。結(jié)果WST-1檢測結(jié)果顯示CCL25-PE38能特異性殺傷MOLT4細(xì)胞;Annexin V-FITC/PI染色顯示CCL25-PE38主要通過凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)引起MOLT4細(xì)胞死亡;在SCID小鼠白血病細(xì)胞異種移植瘤模型中,注入CCL25-PE38能緩解CCR 9+腫瘤的生長。結(jié)論CCL25-PE38通過凋亡誘導(dǎo)作用引起MOLT4細(xì)胞死亡,緩解異種移植CCR 9+腫瘤的生長。
CCL25-PE38;急性T淋巴細(xì)胞白血??;免疫毒素
白血病在全球發(fā)病率呈上升趨勢,我國白血病發(fā)病率為十萬分之三,每年約新增40 000例患者。白血病表現(xiàn)為骨髓造血組織惡性增生,形成大量異常的白細(xì)胞,廣泛浸潤組織器官,引起多種組織器官不可逆損害,直接威脅患者生命。白血病的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)與白血病細(xì)胞及其生長微環(huán)境相互作用密切相關(guān)。免疫毒素是一種由抗體或細(xì)胞因子與化學(xué)毒素耦合組成的融合蛋白。通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和隨后的毒素成分被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì),并與二磷酸腺苷結(jié)合,核糖基化延伸因子2(EF-2),從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成被抑制和靶細(xì)胞死亡[1]。PE38,38 kD的截短型綠膿桿菌外毒素A的衍生物,已被廣泛作為免疫毒素毒素組分。例如,抗CD22的重組免疫毒素BL22,基于PE38的作用治療毛細(xì)胞白血病證明是成功的[2]。重組免疫毒素8H9-PE38用于乳腺癌,骨肉瘤,神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療[3]。因此,重組免疫毒素可能是一種用于治療癌癥患者,尤其是血液腫瘤患者有前途的方法。以趨化因子受體介導(dǎo)的免疫治療是一個極具吸引力的策略。本研究推測,毒素與趨化因子融合構(gòu)成的新型免疫毒素,可能對高水平表達(dá)CCR9的急性T淋巴細(xì)胞白血?。═ lineageacutelymphoblastic leukemia,T-ALL)細(xì)胞的存活產(chǎn)生影響。為了檢驗(yàn)該假設(shè),本研究設(shè)計一個免疫毒素分子CCL25-PE38,構(gòu)建其真核表達(dá)載體,并表達(dá)在真核細(xì)胞293T中,然后檢測其對T-ALL細(xì)胞系MOLT4的殺傷作用以及抗MOLT4細(xì)胞異種移植腫瘤效應(yīng)。
1.1材料
1.1.1主要試劑MOLT4細(xì)胞(自然高水平表達(dá)CCR9),小鼠成纖維細(xì)胞L929,HEK 293T細(xì)胞購自美國模式菌科收集中心,RPMI 1640、DMEM、胰酶來源于美國Hyclone公司,青霉素、鏈霉素購自美國Sigma公司,F(xiàn)etal bovine serum(FBS)購自美國Gibco公司,限制性內(nèi)切酶來源于美國NewEngland Biolabs公司,pcDNA3.1(+)載體來源于美國Invitrogen公司,Wizard Plus Maxipreps DNA Purification System來源于Promega,EntransterTM-D來源于中國Engreen,重組人-CCL25來源于美國Peprotech公司,鼠抗人CCR9單克隆抗體購自美國R&D公司,BCA蛋白分析試劑盒購自碧云天生物有限公司,過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG,F(xiàn)ITC/R-PE標(biāo)記羊抗兔IgG,R-PE標(biāo)記驢抗鼠IgG(H+L)來源于美國Protein Tech公司,Annexin V-FITC試劑盒來源于美國BD公司,細(xì)胞增殖試劑WST-1來源于美國Roche公司,甘油來源于美國Sigma公司。
1.1.2主要儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),Eppendorf PCR儀(德國Eppendorf AG公司),Air Tech超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),KHB CT-360自動多功能酶標(biāo)儀(上??迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司),GENE GENIUS凝膠成像分析系統(tǒng)(英國Syngene公司),Eppendorf移液器(德國Eppendorf AG公司),Eppendorf臺式冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf AG公司),蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)印儀(北京六一),Transwell趨化小室(美國Corning公司),細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Forma公司),倒置顯微鏡(日本Nikon公司),流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司),共聚焦顯微鏡(德國Leica)。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1重組免疫毒素CCL25-PE38靶向殺傷MOLT4細(xì)胞實(shí)驗(yàn)收集1×105MOLT4細(xì)胞,PBS洗滌。分別取CCL25-PE38、PE38(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0及2.0 nmol/ml,PBS稀釋),加至細(xì)胞懸液中,混合后加至96孔板的各小孔中。以PBS處理作為陰性對照組。37℃、二氧化碳CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,加入10μl WST-1(美國Roche公司)繼續(xù)培養(yǎng)4h。酶標(biāo)儀測定450nm下的光密度(optical density,OD)值。同時為檢測CCL25-PE38對MOLT4細(xì)胞的特異性殺傷作用依賴于CCR9,設(shè)立CCL25-PE38加抗CCR9抗體(美國R&D公司)處理組。收集MOLT4細(xì)胞,PBS洗滌1次。先用抗CCR9抗體處理1 h,然后加入CCL25-PE38。其他處理同上。為檢測CCL25-PE38對CCR9-細(xì)胞增殖能力的影響,收集1×105L929細(xì)胞,PBS洗滌1次。取CCL25-PE38(0.5 nmol/ml,PBS稀釋),加至細(xì)胞懸液中,混合后加至96孔板的各小孔中。以PBS處理作為陰性對照組。37℃、二氧化碳CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,加入10μl WST-1繼續(xù)培養(yǎng)4h。酶標(biāo)儀測定450nm下的OD值。重組免疫毒素CCL25-PE38凋亡誘導(dǎo)效應(yīng),收集1×105MOLT4細(xì)胞,PBS洗滌1次。取CCL25-PE38(0.5nmol/ml,PBS稀釋),加至細(xì)胞懸液中,混合物加至24孔板的各小孔中。37℃、二氧化碳CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24及48 h。離心收集處理后的細(xì)胞,結(jié)合緩沖液洗滌1次,加入AnnexinV-FITC/PI(美國BD公司)于暗處孵育15 min。立即上流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)進(jìn)行檢測。
1.2.2重組免疫毒素CCL25-PE38抗腫瘤實(shí)驗(yàn)
MOLT4細(xì)胞異種移植腫瘤(CCR9+)模型建立:SCID小鼠由武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供,6~8周齡,雌性,許可證編號:SCXK(鄂)2008-2004。小鼠飼養(yǎng)在無菌隔離器中。一周后無菌條件下將MOLT4細(xì)胞接種至SCID小鼠背部皮下(1×107/只),接種后約7~9 d可觸及到約300mm3大小的腫瘤塊,將未長出腫瘤的小鼠棄掉不用,余下動物分成3組,每組5只。重組免疫毒素CCL25-PE38處理及抗瘤效果觀察:于第9天開始分別經(jīng)尾靜脈注射(靜脈注射不成功的采用腹腔注射)CCL25-PE38、PE38(0.5 nmol/只/d)、PBS;連續(xù)注射14 d。每隔一天測量瘤體的長和寬,并計算瘤體大小。至實(shí)驗(yàn)第29天,采取頸椎脫臼方式將SCID荷瘤小鼠處死,剝離腫瘤體并稱重。HE染色:用4%中性甲醛固定剝離得到的腫瘤,送本校組織胚胎學(xué)教研室進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色。在顯微鏡下觀察腫瘤塊組織學(xué)特點(diǎn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測CCR9+腫瘤中CCR9的表達(dá)情況:無菌條件下碾磨腫瘤塊,使用200目的細(xì)胞濾網(wǎng)收集腫瘤細(xì)胞,PBS洗滌2次。傳代培養(yǎng)3次后,收集細(xì)胞檢測其表面CCR9的表達(dá)水平。分離收集各處理組1×105細(xì)胞,加10μg/mL的抗CCR9單克隆抗體(美國R&D公司)至細(xì)胞懸液中,于4℃孵育1 h,以MOLT4細(xì)胞作為對照,加入PBS處理。PBS洗滌2遍后,加入RPE標(biāo)記的羊抗鼠IgG(美國ProteinTech公司),4℃孵育30min。PBS洗滌2次后上流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)進(jìn)行檢測。
1.3統(tǒng)計學(xué)方法
采用Graph Prism 5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料用均數(shù)比較的t檢驗(yàn)處理和單因素方差分析,定性資料用獨(dú)立樣本R×C列聯(lián)表資料的χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1免疫毒素CCL25-PE38靶向殺傷MOLT4細(xì)胞能力檢測
為檢測免疫毒素CCL25-PE38對細(xì)胞存活的影響,本研究檢測免疫毒素CCL25-PE38對MOLT4細(xì)胞的殺傷作用以及對L929細(xì)胞增殖的影響。如圖1所示,CCL25-PE38能特異性殺傷MOLT4細(xì)胞,隨著免疫毒素CCL25-PE38濃度的增加其殺傷效應(yīng)也隨著增強(qiáng),同時其殺傷作用能被抗CCR9的抗體特異性阻斷。CCL25-PE38對CCR9表達(dá)陰性細(xì)胞的增殖無影響。
圖1 免疫毒素CCL25-PE38細(xì)胞毒作用檢測
2.2免疫毒素CCL25-PE38凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)
為探討免疫毒素殺傷MOLT4細(xì)胞的機(jī)制,本研究檢測免疫毒素誘導(dǎo)MOLT4細(xì)胞凋亡的作用。隨著CCL25-PE38作用于MOLT4細(xì)胞時間的增加,發(fā)生凋亡的MOLT4細(xì)胞數(shù)(Annexin-V FITC陽性和Annexin-FITC、PI雙陽性細(xì)胞)逐漸增加,見圖2。24 h凋亡率為30.7%,48h凋亡率達(dá)到41.3%。與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見附表。
圖2 免疫毒素CCL25-PE38誘導(dǎo)MOLT4細(xì)胞凋亡效應(yīng)
附表 兩組免疫毒素CCL25-PE38誘導(dǎo)MOLT4細(xì)胞凋亡效應(yīng)的比較%
2.3免疫毒素CCL25-PE38抗CCR9+腫瘤效應(yīng)
為進(jìn)一步驗(yàn)證免疫毒素特異性殺傷白血病細(xì)胞的能力,本研究檢測免疫毒素在體內(nèi)抗CCR9+腫瘤作用。首先建立MOLT4細(xì)胞異種移植CCR9+腫瘤,接種MOLT4細(xì)胞9 d后,可檢測到大小為300 mm3瘤體。然后注入CCL25-PE38并觀察其對移植腫瘤生長的影響。如圖3所示,注入CCL25-PE38 12d以后能觀察到瘤體的的生長受到抑制。而PBS及PE38處理組瘤體的體積持續(xù)增長。因此,采用靜脈注射重組免疫毒素CCL25-PE38能有效緩解SCID小鼠異種移植腫CCR9+瘤的生長。
圖3 免疫毒素CCL25-PE38抑制異種移植CCR9+腫瘤的生長
2.4HE染色結(jié)果
為驗(yàn)證CCL25-PE38體內(nèi)抑瘤作用,本研究制作腫瘤組織切片并作HE染色。通過組織學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)CCL25-PE38處理組與對照組比較血管分布密度減少,腫瘤細(xì)胞數(shù)目明顯減少。見圖4。
圖4 腫瘤組織HE染色結(jié)果
2.5CCR9+腫瘤中CCR9的表達(dá)水平
圖5 不同處理組來源的腫瘤細(xì)胞表面CCR9表達(dá)水平
在本實(shí)驗(yàn)中,盡管免疫毒素CCL25-PE38能有效緩解異種移植CCR9+腫瘤生長,但是不能完全消除腫瘤。為探究產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因,采用FCM檢測了來源于各組瘤體中細(xì)胞表面CCR9的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CCL25-PE38處理組,CCR9的表達(dá)水平明顯降低(66.9%),而PBS和PE38處理組腫瘤細(xì)胞表面CCR9水平未有明顯改變,見圖5。因而可推測CCR9表達(dá)水平的下降可能與MOLT4細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)后部分細(xì)胞不再表達(dá)CCR9有關(guān)。
趨化因子和趨化因子受體在疾病發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用[4]。最近有研究報道,CCX282-B,一個潛在的人CCR9拮抗劑,對腸道炎癥具有較好的治療效果[5]。此外,文獻(xiàn)[6]報道,下調(diào)CXCR4的表達(dá)抑制癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。針對趨化因子和/或趨化因子受體可能對控制相關(guān)疾病的發(fā)展進(jìn)程具有治療效果。CCR4單克隆抗體已被證明可以誘導(dǎo)T-ALL患者白血病細(xì)胞的死亡,抑制表達(dá)CCR4腫瘤的進(jìn)展[7-9]。該作用導(dǎo)致細(xì)胞的死亡有賴于抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用,但是該治療方式與患者的免疫功能狀態(tài)有關(guān)。而針對趨化因子或趨化因子受體與細(xì)胞毒性藥物的免疫毒素,直接殺傷靶細(xì)胞可能提供更好的治療效果。
PE38具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡作用已被廣泛用作免疫毒素的毒素成份[10-12]。在本研究中,WST-1檢測結(jié)果顯示,CCL25-PE38特異性殺死MOLT4細(xì)胞,但不殺傷L929細(xì)胞。重要的是靶向殺傷作用可被CCR9中和性抗體有效地阻斷,再次確認(rèn)CCL25-PE38對MOLT4細(xì)胞的殺傷作用是由CCR9介導(dǎo)的。隨后Annexin V-FITC/PI染色的結(jié)果表明,CCL25-PE38呈時間依賴性誘導(dǎo)MOLT4細(xì)胞的凋亡。另一項(xiàng)研究報道與本研究一致的結(jié)果,VGEFPE38融合毒素進(jìn)入胞漿后可誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[13-15]。此外,本研究通過向SCID小鼠注射MOLT4細(xì)胞建立白血病細(xì)胞荷瘤(CCR9+腫瘤)模型,探討CCL25-PE38對異種移植CCR9+腫瘤生長的影響。在SCID小鼠白血病細(xì)胞移植瘤模型中,注入CCL25-PE38能有效緩解CCR9+腫瘤的生長。經(jīng)FCM檢測發(fā)現(xiàn)瘤體(CCL25-PE38處理組)中分離的腫瘤細(xì)胞CCR9的表達(dá)水平下降,提示有可能一部分細(xì)胞在體內(nèi)喪失表面CCR9分子,對CCL25-PE38產(chǎn)生耐受。因此,提高免疫毒素CCL25-PE38的抗腫瘤效果是本研究下一步的工作目標(biāo),可能通過以下途徑:①生物信息學(xué)方法,優(yōu)化CCL25-PE38結(jié)構(gòu),以增加CCL25-PE38活性;②提高CCL25-PE38的穩(wěn)定性,以促進(jìn)其吸收;③使用與其他治療方法如化療相結(jié)合的策略。另外,為進(jìn)一步研究免疫毒素CCL25-PE38體內(nèi)抗白血病作用,進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):建立小鼠白血病模型,觀察CCL25-PE38治療白血病效果;觀察CCL25 -PE38的免疫原性、毒性、體內(nèi)代謝等情況。
綜上所述,本研究結(jié)果表明,免疫毒素CCL25-PE38能特異性殺傷高水平表達(dá)CCR9的MOLT4細(xì)胞,而不影響CCR9受體陰性細(xì)胞。此外,體內(nèi)研究表明,CCL25-PE38能緩解CCR9+腫瘤的生長。所以,CCL25-PE38在此呈現(xiàn)的生物活性使其有可能成為潛在治療高水平表達(dá)CCR9癌癥潛在的生物制劑,特別是T-ALL。
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(張蕾編輯)
Study of CCL25-PE38 immunotoxin in treatment of T-cell acute lymphoblastic leukemia(T-ALL)
Xiao-lei Liu1,Lei Gao2,Na Cui3
(1.Department of Hematology,Baoding First Central Hospital,Baoding,Hebei 071000,China;2.Ultrasound Department,Baoding First Central Hospital,Baoding,Hebei 071000,China;3.Gynecology,Baoding First Central Hospital,Baoding,Hebei 071000,China)
Objective To investigate the killing effect ofCCL25-PE38immunotoxin on MOLT4 cell line in T-cell acute lymphoblastic leukemia(T-ALL)(CCR9natural high-level expression),and to provide the foundation of targeting treatment of T-cell acute lymphoblastic leukemia(T-ALL).Methods Flow cytometryn and confocal microscopy were used to detect the binding and internalization of CCL25-PE38 and MOLT4 cells.Transwell chemotaxis chamber method was used to detect the chemotaxis.Cell Proliferation Reagent WST and Annexin VFITC/PI stain were used to detect killing ability of cells and the apoptosis induced effect respectively.And antitumous effect ofCCI25-PE38was detected by building the SCID leukemia cells in mice xenograft tumor(CCR9+tumors)model.Results WST-1 test showed thatCCL25-PE38produce specific lethal effect on MOLT4 cell. Annexin V-FITC/PI stain showed that the cause of death of MOLT4 cells was induced by apoptosis ofCCL25-PE38. Injection ofCCL25-PE38in SCID leukemia cells in mice xenograft tumor(CCR9+tumors)model can retard growth speed of CCR9+cancer.Conclusions The cause of death of MOLT4 is induced by apoptosis-inducing effect of CCL25-PE38,which can retard the growth of CCR9+xenotransplanted tumors.
CCL25-PE38;T-cell acute lymphoblastic leukemia(T-ALL);immunotoxin
R 733.71
A
10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.002
1005-8982(2016)20-0006-06
2016-02-18