夏群辛培勇褚金芳*(中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所國(guó)家植物基因研究中心(北京)，北京000)(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京00049)

全自動(dòng)在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)水稻中6種內(nèi)源性植物激素

夏群1，2辛培勇1褚金芳*1
1(中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所國(guó)家植物基因研究中心(北京)，北京100101)2(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

建立了同時(shí)檢測(cè)水稻中6種內(nèi)源性植物激素脫落酸(Abscisic acid，ABA)、吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、水楊酸(Salicylic acid，SA)、茉莉酸(Jasmonic acid，JA)、吲哚-3-丙酸(Indole-3-propionic acid，IPA)和吲哚-3-丁酸(Indole-3-butyric acid，IBA)的全自動(dòng)在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。植物樣品經(jīng)過甲醇提取，采用C18固相萃取柱富集凈化，流動(dòng)相將待測(cè)物洗脫至C18分析色譜柱進(jìn)行分離，最終使用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。方法的線性范圍為8～320μg/L，相關(guān)系數(shù)為R2≥0．99;方法的檢出限(S/N=3)范圍為0．1～0．8μg/kg;實(shí)際樣品中方法回收率范圍為71．2%～126%，RSD＜13%。應(yīng)用本方法快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)了水稻幼穗中多種內(nèi)源性植物激素的含量，并與目前植物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)常用的檢測(cè)方法進(jìn)行了比較。同時(shí)，本方法對(duì)水稻受傷葉片的內(nèi)源植物激素含量變化進(jìn)行了定量分析，其含量隨受傷時(shí)間的變化趨勢(shì)與其生物背景的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

植物激素;在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;定量分析;水稻

1　引言

植物激素是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一系列天然小分子化合物，參與調(diào)控植物的株型建成、光合作用及水分營(yíng)養(yǎng)利用等重要生理過程［1］。植物激素在植物體內(nèi)含量極低，通常在鮮重0．1～50μg/kg的范圍內(nèi)，且植物體內(nèi)化合物種類復(fù)雜多樣，因此，植物激素的定性和定量分析一直是植物激素研究領(lǐng)域的難點(diǎn)之一［2，3］。離線固相萃取(Off-line SPE)［4，5］前處理手段結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用是目前常用的分析檢測(cè)技術(shù)［6～8］，但操作相對(duì)繁瑣、費(fèi)時(shí)，且易引入誤差。隨著技術(shù)的發(fā)展，在線固相萃取(On-line SPE)越來越多地與液相色譜聯(lián)用，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、分析速度快、重現(xiàn)性與精密度好等優(yōu)點(diǎn)，多應(yīng)用于基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單的樣品，如水、牛奶等［9，10］，而復(fù)雜基質(zhì)中痕量植物激素的應(yīng)用報(bào)道較少［11，12］。

水稻是重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量與品質(zhì)直接關(guān)系到全球的糧食安全問題。植物激素對(duì)水稻產(chǎn)量的提高與品質(zhì)的保持起著至關(guān)重要的作用［13］。因此，建立水稻材料中高通量和高靈敏度的多種植物激素同時(shí)分析方法，對(duì)內(nèi)源植物激素的網(wǎng)絡(luò)互作和水稻育種研究具有重要意義，但目前對(duì)水稻內(nèi)源多種植物激素同時(shí)分析的方法研究較少［14］。本實(shí)驗(yàn)基于在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(On-line SPE-LC-MS/MS)開發(fā)了一種可以同時(shí)檢測(cè)水稻中6種植物激素的方法。相對(duì)于傳統(tǒng)的植物激素分析方法，本方法具有分析速度快、通量高、重現(xiàn)性與精密度良好等優(yōu)點(diǎn)。

2　實(shí)驗(yàn)部分

2．1儀器與試劑

SymbiosisTMPharma在線固相萃取-液相色譜系統(tǒng)(荷蘭Spark Holland公司)，配柱溫箱;C2SE、C8EC-SE和C18HD在線固相萃取柱(10 mm×2 mm，7μm，19．4 mg，荷蘭Spark Holland公司);Quattro Premier XE三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)。

脫落酸(Abscisic acid，ABA)、吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)和茉莉酸(Jasmonic acid，JA)標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司);水楊酸(Salicylic acid，SA)、吲哚-3-丙酸(Indole-3-propionic acid，IPA)和吲哚-3-丁酸(Indole-3-butyric acid，IBA)標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr．Ehrenstorfer公司);ABA穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)(2H6-ABA，捷克OlChem Im公司);其它穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)(2H5-JA、2H4-SA和2H2-IAA，加拿大CDN Isotopes公司)。甲醇和乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司);乙酸(LC-MS級(jí)，美國(guó)Fluka公司);甲酸(分析純，美國(guó)Acros Organics公司)。實(shí)驗(yàn)所用18．2 MΩ超純水由PURELAB純水儀(英國(guó)ELGA公司)制備。

2．2實(shí)驗(yàn)條件

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源負(fù)離子模式(ESI-);毛細(xì)管電壓為2．80 kV;源溫110℃;脫溶劑氣溫度400℃;脫溶劑氣流速800 L/h;錐孔氣流50 L/h;倍增器電壓650 V;碰撞氣(氬氣)0．17 L/h;掃描方式多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1　目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1　MRM parameters for tandem mass spectrometry

色譜條件:Waters公司XBridgeTMBEH C18色譜柱(3．0 mm×75 mm，2．5μm);流動(dòng)相A為0．2% (V/V)乙酸;流動(dòng)相 B為甲醇;梯度洗脫程序:0～0．5 min，20%B;0．5～11 min，20%～95%B; 11～11．5 min，95%B;11．5～12 min，95%～20%B;12～14．5 min，20%B;流速0．2 mL/min;柱溫30℃。

在線固相萃取條件:SPE柱經(jīng)過1 mL甲醇和1 mL 1%(V/V)甲酸活化平衡，流速5mL/min;10μL樣品由0．4 mL 1%(V/V)甲酸上樣，流速0．7mL/min;淋洗液為0．9mL 1%(V/V)甲酸和0．1mL 1%(V/ V)甲酸-甲醇的混合液，流速5 mL/min;淋洗后，流動(dòng)相將待測(cè)物梯度洗脫至分析柱，洗脫時(shí)間7 min，流速0．2 mL/min;洗脫的同時(shí)，新的SPE柱進(jìn)行活化、上樣和淋洗。

2．3方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)

ABA，IAA，SA，JA，IPA和IBA標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液為5 mg/L，溶劑為甲醇，于-20℃儲(chǔ)存。用80% (V/V)甲醇稀釋儲(chǔ)備液，配制工作溶液為20μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)品，儲(chǔ)存于4℃。通過稀釋標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，配制5個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣分析，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。ABA，IAA，SA和JA采用穩(wěn)定同位素稀釋法進(jìn)行定量分析，IPA與IBA采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。取低中高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣5天，每天測(cè)定5次，考察方法的精密度。在水稻幼穗中加ABA，IAA，SA和JA的同位素內(nèi)標(biāo)以及IPA、IBA標(biāo)準(zhǔn)品，按S/N=3和S/N=10確定方法的檢出限和定量限。在水稻基質(zhì)中，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，計(jì)算低中高3個(gè)濃度的方法回收率。

2．4樣品前處理和水稻培養(yǎng)與傷害

水稻植物材料在液氮條件下收集與研磨。稱取約0．2 g鮮重植物材料于7 mL離心管中，加入2 mL甲醇(含銅試劑)，同時(shí)加入2H6-ABA，2H2-IAA，2H4-SA和2H5-JA各10 ng，渦旋混合，-20℃過夜提取。于4℃下，以15000 r/min離心15 min，收集上清液，氮?dú)獯蹈扇芙庥?00μL 80%(V/V)甲醇中，經(jīng)0．2μm PTFE濾膜過濾后，由在線固相萃取系統(tǒng)分析。

水稻種子由70%乙醇和2．5%次氯酸鈉消毒后于37℃萌發(fā)，將萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移至玻璃培養(yǎng)管中，用Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:光/暗周期(16/8 h);溫度25℃;濕度70%。傷害實(shí)驗(yàn)材料為3周水稻幼苗，對(duì)水稻幼苗第三片完全展開的葉片用止血鉗夾出2個(gè)傷口，間隔4 cm，收集受害5，15，30，60，120和360 min后的葉片，考察多種植物激素含量變化。

3　結(jié)果與討論

3．1液相色譜條件優(yōu)化

分別比較了乙腈和甲醇作為色譜有機(jī)流動(dòng)相時(shí)，6種目標(biāo)化合物保留行為。當(dāng)乙腈作為有機(jī)相時(shí)，隨著混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣次數(shù)的增加，ABA，JA與IBA的質(zhì)譜響應(yīng)穩(wěn)定，而IAA，SA與IPA的響應(yīng)逐漸降低;當(dāng)甲醇作為有機(jī)相時(shí)，6種植物激素都能保持穩(wěn)定的質(zhì)譜響應(yīng)，并且分離度較好。本實(shí)驗(yàn)選擇了甲醇作為有機(jī)流動(dòng)相。在流動(dòng)相中添加少量的添加劑可以增強(qiáng)質(zhì)譜離子源的離子化效率，實(shí)驗(yàn)分別考察了10 mmol/L甲酸銨、0．05%甲酸、0．05%乙酸、0．1%乙酸和0．2%乙酸作為添加劑時(shí)的效果。添加乙酸時(shí)，IPA，IBA，SA與JA的質(zhì)譜平均響應(yīng)峰面積比添加甲酸時(shí)高(圖1)，因此選擇用乙酸調(diào)節(jié)pH值。盡管添加0．05%乙酸時(shí)其它5種植物激素的平均響應(yīng)峰面積最高，但是IAA響應(yīng)峰面積的RSD＞15%，因此最終選擇了0．2%(V/V)乙酸作為水相流動(dòng)相。

圖1　不同添加劑(甲酸銨、甲酸和乙酸)對(duì)6種植物激素質(zhì)譜響應(yīng)峰面積的影響Fig．1　Effects of different addictives(ammonium formate，formic acid and acetic acid)in aqueous mobile phase for the response of six phytohormones

3．2在線固相萃取方法優(yōu)化

3．2．1在線固相萃取柱的選擇考察了目標(biāo)化合物在3種反相填料SPE柱(C2SE，C8EC-SE和C18HD)上的保留情況。C8EC-SE和C18HD對(duì)6種酸性植物激素保留能力較強(qiáng)，C2SE保留能力最弱。C18HD作為在線固相萃取柱時(shí)，IAA和SA的質(zhì)譜響應(yīng)峰面積比C8EC-SE更高(圖2)，說明C18HD對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的回收率更高，最終選用C18HD柱作為在線固相萃取柱。

圖2　不同SPE柱對(duì)分析物保留能力的比較Fig．2　Comparison of different SPE sorbents for six phytohormones

3．2．2淋洗條件的優(yōu)化淋洗液為1%(V/V)甲酸(A)和1%(V/V)甲酸-甲醇(B)混合溶液，分別比較了1 mL不同比例(B/(A+B)，0，10%，15%和20%)淋洗液的淋洗效果。當(dāng)B所占比例為15%時(shí)，IAA和SA的響應(yīng)峰面積下降明顯;當(dāng)B所占比例為10%和0時(shí)，質(zhì)譜響應(yīng)峰面積差別較小(圖3)，說明目標(biāo)化合物的損失較小，最終淋洗液中B的比例選擇10%。

圖3　不同淋洗有機(jī)相比例的比較Fig．3　Comparison of different percentage of organic solution for six phytohormones

3．2．3洗脫時(shí)間的優(yōu)化C18HD SPE柱和分析色譜柱都基于反相作用機(jī)理保留和分離化合物。IAA最先被洗脫，JA最后被洗脫。梯度洗脫時(shí)間太短(小于6 min)，洗脫回收率較低;洗脫時(shí)間太長(zhǎng)，在分析植物樣品時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)移更多的雜質(zhì)至分析色譜柱。最終洗脫時(shí)間選擇7 min(圖4)。

圖4　洗脫時(shí)間的優(yōu)化Fig．4　Optimization of elution time for six phytohormones

3．3方法學(xué)考察

方法的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2＞0．99。方法的檢出限范圍為0．1～0．8μg/kg(表2)，定量限范圍為0．4～2．5μg/kg(表2)。6種植物激素的回收率的為71．2%～126．0%，RSD為2．4%～12．8%(表3)。

表2　線性方程、線性范圍和方法回收率(n=6)Table 2　Linear relationships and spiked recoveries(n=6)

表3　方法的日內(nèi)精密度(RSD，%，n=5)、日間精密度(RSD，%，n=5)、檢出限和定量限Table 3　Intraday precision(n=5)，interday precisions(n=5)，LODs and LOQs

3．4方法的驗(yàn)證與應(yīng)用

目前植物學(xué)領(lǐng)域普遍使用的植物激素定量分析數(shù)據(jù)是由樣品經(jīng)離線SPE前處理后，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析得到的［8，15］。分別用離線SPE分析方法［8］和本研究建立的在線SPE方法分析水稻幼穗中內(nèi)源性植物激素的含量，結(jié)果見表4。兩種方法定量分析結(jié)果相近，該結(jié)果驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確性。在線SPE-LC-MS/MS方法可檢測(cè)到的目標(biāo)化合物的色譜圖如圖5所示，IPA和IBA由于含量低，在樣品中未檢出。

表4　在線固相萃取方法和離線方法分析水稻幼穗6種內(nèi)源性植物激素(n=3)Table 4　Quantitative results of six phytohormones concentrations in young panicles of rice with on-line SPE-LC-MS/MSand off-line SPE-LC-MS/MS(n=3)

圖5　在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析水稻幼穗中植物激素色譜圖Fig．5　Chromatograms of phytohormones in young panicles of rice with on-line SPE-LC-MS/MS

為進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可靠性，考察了水稻幼苗葉片受傷后內(nèi)源性植物激素含量的變化，結(jié)果見圖6。IAA的含量變化較小，在(3．9±0．9)μg/kg和(8．3±0．8)μg/kg之間(圖6A)，沒有明顯的證據(jù)表明IAA參與植物的傷害反應(yīng)。ABA是植物應(yīng)對(duì)干旱、鹽脅迫等環(huán)境壓力的激素［16］。從圖6B可見，內(nèi)源的ABA含量在30 min后明顯上升，很可能是因?yàn)橹参锶~片失水后，ABA作為信號(hào)分子會(huì)使保衛(wèi)細(xì)胞的氣孔縮小，減少植物葉片的失水。在圖6C中，SA的含量變化較小，在(337．5±81．6)μg/kg和(528．5± 69．0)μg/kg之間，對(duì)外界傷害的反應(yīng)不明顯，符合SA調(diào)控抗性的機(jī)理研究，即SA介導(dǎo)的抗性主要是針對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌和卵菌等一系列病原菌的入侵［17］。生物學(xué)研究表明，JA是植物應(yīng)對(duì)傷害反應(yīng)重要的信號(hào)分子，植物受傷后JA的含量會(huì)顯著上升［8］。當(dāng)葉片沒有受到傷害時(shí)，JA的含量在定量限以下，含量低于0．4μg/kg;在受傷后60 min時(shí)，受傷葉片的JA含量達(dá)到最高，為(91．9±2．3)μg/kg;之后JA的含量開始下降，360 min時(shí)為(30．4±5．9)μg/kg。JA的濃度先升高后降低，再升高最后又降低的趨勢(shì)，在圖6D中表現(xiàn)為雙峰現(xiàn)象，這一變化趨勢(shì)與文獻(xiàn)［5］完全符合。

4　結(jié)論

建立了在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定量檢測(cè)水稻中6種內(nèi)源性植物激素的方法。在線固相萃取方法簡(jiǎn)化了植物激素分析的樣品前處理流程，使得分析速度與操作的簡(jiǎn)便性大大提高。本方法與植物研究領(lǐng)域內(nèi)公認(rèn)方法所得到的定量分析結(jié)果基本一致，并通過分析受傷葉片植物激素含量的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性和可靠性。本方法能同時(shí)分析多種內(nèi)源性植物激素，將非常有助于水稻以及其它植物材料中內(nèi)源性植物激素的互作研究。

圖6　水稻幼苗葉片受傷后內(nèi)源植物激素IAA(A)、ABA(B)、SA(C)和JA(D)濃度變化(n=3)Fig．6　Concentration change of IAA，ABA，SA and JA in wounded leaves of rice seedlings(n=3)

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Thiswork was supported by the National Natural Science Foundation of China(No．91417314)，and the Technique Innovation of Instrumental Function of CASProgram and CASKey Technology Talent Program

An Automated On-line Solid Phase Extraction-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometric Method for Six Endogenous Phytohormones Analysis in Rice

XIA Qun1，2，XIN Pei-Yong1，CHU Jin-Fang*1
1(National Centre for Plant Gene Research(Beijing)，Institute of Genetics and Developmental Biology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China)2(University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)

An automated on-line solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry (on-line SPE-LC-MS/MS)method for the simultaneous quantification of six endogenous phytohormones including abscisic acid(ABA)，indole-3-acetic acid(IAA)，salicylic acid(SA)，jasmonic acid(JA)，indole-3-propionic acid(IPA)and indole-3-butyric acid(IBA)in rice tissues was described．Plant samples were extracted withmethanol and on-line SPE procedurewas performed with C18SPE cartridges．Analyteswere eluted to C18analytical column withmobile phase and further analyzed by LC-MS/MS．The performance of the method was fully validated．Linearity showed good correlation(R2≥0．99)．Limits of detections(S/N=3) were in the range of 0．1－0．8μg/kg．Recoveries varied between 71．2%and 126%．Themethod was rapid and sensitive to determinemultiple phytohormones in rice young panicles and the resultswere cross-validated with the off-line SPE-LC-MS/MS phytohormone analyticalmethod．Finally，themethod was applied tomonitor the changes of ABA，IAA，SA and JA in wounded rice leaves．The trendswere in accord with plant physiological processes．

Phytohormones;On-line solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Quantitative analysis;Rice

29 September 2015;accepted 30 December 2015)

10．11895/j．issn．0253-3820．150769

2015-09-29收稿;2015-12-30接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金(No．91417314)、中科院儀器設(shè)備功能開發(fā)技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目和中科院關(guān)鍵技術(shù)人才項(xiàng)目資助

*E-mail:jfchu@genetics．a(chǎn)c．cn