楊麗珠朱婧章仁毅馬丹琦何品剛*方禹之(溫州醫(yī)科大學藥學院，溫州505)　(華東師范大學化學系，上海004)(浙江省臺州市路橋區(qū)計劃生育宣傳技術指導站，臺州8050)

基于直立碳納米管大面積金粒子的DNA生物傳感器用于早幼粒白血病/維甲酸受體α融合基因檢測

楊麗珠*1朱婧2章仁毅2馬丹琦1，3何品剛*2方禹之2
1(溫州醫(yī)科大學藥學院，溫州325035)2(華東師范大學化學系，上海200241)3(浙江省臺州市路橋區(qū)計劃生育宣傳技術指導站，臺州318050)

基于直立碳納米管上的大面積金粒子構建了新型的電化學DNA生物傳感器，用于急性早幼粒細胞白血病PML/RARα融合基因的檢測。首先在直立碳納米管電極表面濺射金粒子，采用自組裝方法將巰基修的單鏈DNA固定到電極上，將氨基修的單鏈DNA和羧基化的CdTe量子點通過酰胺縮合反應生成CdTe修的DNA探針，通過與目標DNA的雙雜交反應形成三明治結構，利用差分脈沖陽極溶出伏安法檢測電極表面捕獲的CdTe量子點，從而對DNA進行定量分析。結果表明，電極上Cd2+峰電流與目標DNA濃度(1．0× 10-12～1．0×10-8mol/L)的對數(shù)值呈線性關系，線性方程為ipa(μA)=1．626+0．132lg C(mol/L)(R=0．996)，檢出限為4．0×10-13mol/L(3σ)。傳感器表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

直立碳納米管;金粒子;急性早幼粒細胞白血病;DNA生物傳感器;差分脈沖陽極溶出伏安

1　引言

急性早幼粒細胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)是急性骨髓系白血病中一種嚴重危害人類健康的惡性白血?。?］，而早期診斷直接影響患者的治療效果及生存質量。早幼粒白血病/維甲酸受體α(Promyelocytic leukaemia/retinoic acid receptorα，簡稱PML/RARα)融合基因是APL特異性的標志物，對其檢測有助于APL診斷，且對融合基因的定量也有重要意義。目前，APL的臨床診斷方法，如Southern-Blot法、熒光原位雜交技術(FISH)和實時定量分析PCR方法，普遍存在局限性，如特異性低、靈敏度不高、操作繁瑣、檢測費用高等［2～4］，限制了在臨床檢測中的應用。

DNA生物傳感器具有靈敏度高、檢測成本低、操作簡單等優(yōu)點［5］，在流行病、遺傳疾病、腫瘤臨床檢驗和基因診斷等方面有很高的應用價值［6～9］。直立碳納米管陣列(ACNTs)與無序碳納米管相比，在導電性、比表面積和生物兼容性等方面具有更為突出的優(yōu)勢［10，11］，已被應用于生物傳感器的研究［12～14］。Wang等［12］通過有序自組裝碳納米管技術制備了DNA生物傳感器，該傳感器比無序多壁碳納米管的傳感器具有更高的雜交效率和更高的選擇性。Yang等［13］在直立碳納米管修電極上制備了基于金納米粒子和二氧化硅凝膠的生物傳感器，測定了血紅蛋白的直接電化學。本研究組前期的工作中，在直立碳納米管電極上以重氮化固定環(huán)糊精，構建了基于主客體識別技術的DNA生物傳感器［14］。

本研究在電極表面修的直立碳納米管表面濺射大面積金粒子，通過自組裝固定巰基修的DNA探針，與CdTe量子點修的DNA檢測探針以及目標DNA形成三明治結構，構建一種新型的DNA生物傳感器，通過陽極溶出法測定捕獲至電極表面的CdTe量子點，用于PML/RARα融合基因的檢測。由于直立碳納米管表面固定了大量的金粒子，以CdTe量子點作為雜交指示劑，結合陽極溶出法的放大作用，本傳感器具有靈敏度高、制備簡便、重現(xiàn)性好和穩(wěn)定性高等優(yōu)點。

2　實驗部分

2．1儀器與試劑

CHI660A電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)，采用三電極體系:直立碳納米管陣列電極(直徑d=2 mm)為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl為參比電極。JEOL S-4800 FE-SEM型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本JEOL公司)。

羧基化的CdTe量子點(深圳市中鼎盛投資有限公司，編號QDWS-1L-54001，粒徑約3．0 nm);1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl，上海延長生化科技公司);N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(NHSS，上海生工生物技術公司);牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich公司)。其它試劑為分析純，實驗用水為超純水(Milli-Q，美國Millipore公司)。緩沖溶液:0．1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7．0);0．1mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 5．2)。所用DNA序列由上海生工生物技術公司合成，具體序列見表1。

表1 本文中用到的DNA序列Table 1　DNA sequences used in this work

2．2實驗方法

2．2．1直立碳納米管陣列(ACNTs)電極的制備［14］用化學氣相沉積法合成ACNTs［15］，再用磁共振法在其上濺射一層金粒子［14］，用10%HF將直立碳納米管陣列從石英基底上剝離，制成ACNTs工作電極。

2．2．2CdTe量子點修的DNA探針(CdTe-ssDNA)的制備在含2 OD檢測ssDNA(探針2)的樣品管中加入200μL 3 mol/L咪唑溶液，室溫渦旋振蕩30 min。再加入5 mL 0．1g/L CdTe量子點溶液和100μL 0．1 mol/L的EDC溶液，繼續(xù)攪拌12 h。14000 r/min離心30 min，黃色沉淀用PBS緩沖液充分洗滌，再分散到PBS緩沖液中，得CdTe量子點修的DNA探針(CdTe-ssDNA)。

2．2．3探針1在ACNTs電極上的自組裝固定在4°C條件下，將巰基修的捕獲探針(探針1)通過自組裝(組裝時間12 h)修到ACNTs電極表面的金粒子上，用1%(w/w)BSA封閉非特異性作用位點，用PBS緩沖液清洗電極，得ACNTs/probe 1電極。

2．2．4雙雜交反應在37℃恒溫箱中，將ACNTs/probe1電極和一定濃度的目標DNA溶液，在緩慢振蕩下，雜交反應30 min，用PBS緩沖液沖洗電極。將該電極和CdTe-ssDNA進行雜交反應30 min，用PBS緩沖液沖洗電極，得到ACNTs/probe1/target DNA/CdTe-ssDNA電極。

2．2．5電化學檢測用0．2 mL 0．1 mol/L HNO3溶液充分溶解電極表面的CdTe量子點，加入1．8 mL 0．1 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液(pH 5．2)配制成檢測液。以鍍汞膜的玻碳電極為檢測電極，利用差分脈沖陽極溶出伏安法［16］測定Cd2+的峰電流。

3　結果與討論

3．1基于直立碳納米管大面積金粒子構建DNA生物傳感器的檢測原理

通過在ACNTs電極面濺射了大面積金粒子，采用三明治模式，構建高靈敏的電化學DNA生物傳感器，用于檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARα融合基因的DNA片段。檢測原理如圖1所示。首先在金粒子表面通過自組裝固定巰基修的捕獲探針，再將氨基修的探針2與羧基化的CdTe量子點通過酰胺縮合反應制備成CdTe修的探針，然后與目標DNA雜交形成三明治結構。采用HNO3溶解捕獲至電極表面的CdTe量子點，利用陽極溶出法檢測Cd2+信號。直立碳納米管大的比表面積以及在碳管表面濺射的大量的金粒子，大大增加DNA分子在電極上的固定量，結合陽極溶出法對Cd2+富集與溶出的放大作用，所制備的傳感器表現(xiàn)出很高的靈敏度。

圖1　基于直立碳納米管大面積金粒子構建DNA生物傳感器的檢測示意圖Fig．1　Schematic representation of DNA biosensors based on large-area gold particles on aligned carbon nanotubes (ACNTs)electrode

3．2ACNTs電極的SEM表征和循環(huán)伏安特性

圖2是直立碳納米管(長度約50μm)的側面(圖2a)和頂端(圖2b和2c，c為b黑框區(qū)域的放大圖)的場發(fā)射掃描電鏡(FESEM)圖像。由圖可以看出，直立碳納米管排列致密且均勻有序，定向性好，頂端開口(圖2b和2c)，側壁上包裹了大面積的金粒子(圖2a和2c)，相比于常規(guī)金電極具有更大的表面積，可以固定更多的生物分子。

圖2　場發(fā)射掃描電鏡圖。(a)ACNTs的側面圖;(b和c)ACNTs的頂部俯視圖Fig．2　Field emission scanning electron microscopic(FESEM)images(a)sidewall view of ACNTs，(b)and(c)top view of ACNTs．

圖3顯示的是裸金電極(Φ=2 mm)(a)和ACNTs電極(b)在0．1 mol/L H2SO4溶液中的循環(huán)伏安圖，兩種電極均在1．4 V出現(xiàn)一個氧化峰，生成的金的氧化物在反向掃描時還原，但ACNTs電極的氧化還原峰電流與金電極相比明顯增大。根據(jù)文獻［17］方法，通過還原峰電流測得ACNTs電極中金粒子的有效面積為39．8 mm2，明顯大于ACNTs電極的幾何面積3．14 mm2，粗糙度系數(shù)(Rf)為12．7［18］。由此可見，在ACNT表面濺射金粒子可增加電極的表面積，提高DNA分子在電極表面的固定量和直立碳納米管電極的導電性。

圖3　裸金電極(a)和ACNTs電極(b)在0．1 mol/L H2SO4溶液中的循環(huán)伏安圖，掃速為100mV/sFig．3　Cyclic voltammograms of bare Au electrode(a) and ACNTs electrode(b)in 0．1mol/L H2SO4at a scan rate of 100 mV/s

3．3雜交反應時間的優(yōu)化

對兩次雜交反應的時間進行了優(yōu)化。實驗發(fā)現(xiàn)，當雜交時間在0～30 min之間，響應信號隨著雜交時間延長而增大;當雜交時間超過30 min，響應信號增大的較慢，因此選擇兩次雜交時間均為30 min。

3．4DNA的測定

將兩步雜交反應后捕獲到電極表面的CdTe量子點先用硝酸溶解，然后利用差分脈沖陽極溶出法(DPASV)測定其電化學信號。結果表明，響應信號隨著目標DNA濃度的增加而增大。圖4是不同濃度的目標DNA對應的Cd2+的DPASV響應，插圖為目標DNA的濃度對數(shù)值與相對應的Cd2+的DPASV響應電流的關系曲線。當目標DNA濃度在1．0×10-12～1．0×10-8mol/L范圍內(nèi)時，Cd2+的DPASV響應電流與目標DNA的濃度對數(shù)值之間呈線性關系，線性方程為ipa(μA)=1．626+0．132lg C(mol/L)，相關系數(shù)R=0．996，檢出限為4．0×10-13mol/L(3σ，n=11)。結果表明，構建的DNA傳感器具有很高的靈敏度，并且高于文獻報道的基于金電極和CdS納米粒子檢測DNA雜交的方法［14］及基于CdS納米粒子和主客體識別技術的均相雜交的DNA生物傳感器［16］。同一批內(nèi)5支電極制備的傳感器響應電流的RSD =6．9%。顯示出良好的重現(xiàn)性。

圖4　不同濃度的目標DNA存在下Cd2+的差分脈沖陽極溶出(DPASV)響應。目標DNA濃度為(a到f):0，1．0×10-12mol/L，1．0×10-11mol/L，1．0×10-10mol/L，1．0×10-9mol/L，1．0×10-8mol/L。插圖為Cd2+的DPASV響應與不同濃度目標DNA的關系曲線Fig．4　Differential pulse anodic stripping voltammetry (DPASV)response of Cd2+in the presence different concentration of target DNA(a to f:0，1．0×10-12mol/L，1．0×10-11mol/L，1．0×10-10mol/L，1．0×10-9mol/L，1．0× 10-8　mol/L)．Inset:　DPASV　responses　of　Cd2+corresponding to different concentrations of target DNA．

3．5方法的特異性

圖5是不同DNA序列存在下電極表面的Cd2+的DPASV響應。與空白樣品相比，完全互補PML/ RARα融合基因序列產(chǎn)生了非常明顯的DPASV信號;而另外4個序列的DPASV信號很低，和空白樣品的差別不大。上述結果表明，所構建的DNA傳感器可以區(qū)分單堿基錯配DNA序列、三堿基錯配DNA序列、PML基因片段(只有一半互補)、RARα基因片段(只有一半互補)和完全互補的PML/RARα基因序列序列，具有良好的特異性。

圖5　不同DNA序列存在下Cd2+的DPASV響應圖a，1．0×10-9mol/L完全互補的早幼粒白血病/維甲酸受體α(PML/RARα)融合基因;b，1．0×10-8mol/L單堿基錯配DNA;c，1．0×10-8mol/L三堿基錯配DNA; d，1．0×10-8mol/L PML基因片段;e，1．0×10-8mol/L RARα基因片段和(f)空白樣品。Fig．5　DPASV responses of Cd2+for the detection of 1．0×10-9mol/L complementary target DNA(a);1．0× 10-8mol/L one-base mismatched sequence(b);1．0× 10-8mol/L three-basemismatched sequence(c);1．0× 10-8mol/L promyelocytic leukaemia(PML)segment (d);1．0×10-8mol/L retinoic acid receptorα(RARα) segment(d);and blank sample(f)．

結果表明，由于直立碳納米管的大的比表面積、碳管表面濺射的大量的金粒子，以及CdTe量子點作為雜交指示劑利用陽極溶出檢測的放大用，構建的生物傳感器具有靈敏度高、特異性好、制作簡單等優(yōu)點。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No．31300819)and the Natural Science Foundation of Zhejiang Province，China(No．LQ12B05004)

DNA Biosensor Based on Large Area of Gold Particles on Aligned Carbon Nanotubes for Detection of Prom yelocytic Leukaem ia/Retinoic Acid ReceptorαFusion Gene

YANG Li-Zhu*，ZHU Jing2，ZHANG Ren-Yi2，MA Dan-Qi1，3，HE Pin-Gang*2，F(xiàn)ANG Yu-Zhi2
1(School of Pharmaceutical Sciences，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China)2(Department of Chemistry，East China Normal University，Shanghai200241，China)3(Family Planning Publicity＆Education Technical Advising Center of Luqiao，Taizhou 318050，China)

A novel electrochemical DNA biosensor was fabricated based on the large area of gold particles on the aligned carbon nanotubes for the detection of promyelocytic leukaemia/retinoic acid receptorα(PML/ RARα)fusion gene in acute promyelocytic leukemia．Firstly，the thiol-modified single-stranded DNA (ssDNA，probe 1)was immobilized on the gold particles sputtered on the aligned carbon nanotubes electrode by self-assembly technique．Then，amino-modified ssDNA and carboxyl-modified CdTe quantum dots(QDs) were combined to get CdTe-modified DNA probe through an amidization reaction．After hybridization with target DNA，a sandwich-type assay structure was formed．Finally，the CdTe quantum dots captured on the electrode surface were detected by differential pulse anodic stripping voltammetry．The change of peak current of Cd2+on the electrode was found to be linear with the logarithm of target DNA concentration in the range of 1．0×10-12mol/L to 1．0×10-8mol/L．The Linear equation was ipa(μA)=1．626+0．132lg C(mol/L)(the correlation coefficient R was 0．996)and the detection limitwas 4．0×10-13mol/L(3σ)．The fabricated DNA biosensor exhibited excellent reproducibility and stability．

Aligned carbon nanotubes;Gold particles;Acute promyelocytic leukemia;DNA biosensor; Differential pulse anodic stripping voltammetry

1 October 2015;accepted 5 January 2016)

10．11895/j．issn．0253-3820．150773

2015-10-01收稿2016-01-05接受

本文系國家自然科學基金項目(No．31300819)和浙江省自然科學基金項目(No．LQ12B05004)資助

*E-mail:yanglz3000@aliyun．com，pghe@chem．ecnu．edu．cn