樊雪梅　王書民　李哲建　鄭行望(商洛學院化學工程與現(xiàn)代材料學院，商洛76000)　(陜西師范大學化學化工學院，西安7006)

基于殼聚糖/Ru(bpy)23+/SiO2納米粒子電化學發(fā)光傳感器用于尿酸的檢測

樊雪梅*1王書民1李哲建1鄭行望21
1(商洛學院化學工程與現(xiàn)代材料學院，商洛726000)2(陜西師范大學化學化工學院，西安710062)

利用反相微乳液法制備了殼聚糖復合納米粒子，采用Nafion/MCNT復合膜技術實現(xiàn)了對復合納米粒子有效而穩(wěn)定的固定，從而制備了電化學發(fā)光傳感器，實現(xiàn)了對尿酸的檢測。在0．1 mol/L PBS緩沖溶液(pH 7．4)中，當尿酸與修電極作用15 min時，電化學發(fā)光強度與尿酸濃度(1．0×10-10～1．0× 10-5mol/L)的負對數(shù)呈良好的線性關系，線性方程為IECL=-709．52－202．74lg C，相關系數(shù)R=0．9936，檢出限為6．0×10-12mol/L。傳感器表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性，對1．0×10-8mol/L尿酸平行測定11次，發(fā)光強度的相對標準偏差為2．9%，測定尿酸實際樣品的加標回收率在98．5%～103．5%之間。

電化學發(fā)光;殼聚糖納米粒子;尿酸

1　引言

尿酸是核蛋白和核酸的代謝產(chǎn)物，人體內尿酸過量是許多疾病的征兆，如痛風、腎功能衰竭、心血管疾病等，故人體內尿酸的檢測在臨床診斷方面有著重要意義。目前，測定尿酸的方法主要有色譜法［1，2］、分光光度法［3，4］、熒光法［5，6］、化學發(fā)光法［7，8］、電化學法［9～11］等。

電化學發(fā)光因其設備簡單、靈敏度高、適用范圍廣等特點而備受關注。但是目前利用電化學發(fā)光法測定尿酸的方法較少［12，13］。近年來，通過將發(fā)光試劑固定在電極表面制備得到固相電化學發(fā)光傳感器，這樣既節(jié)約了昂貴的發(fā)光試劑，又提高了靈敏度，拓寬了電化學發(fā)光法在分析化學中的應用。溶膠-凝膠膜法和Nafion/MCNT是目前應用最多的固定化技術，但是溶膠-凝膠法制備的電化學發(fā)光傳感器穩(wěn)定性較差［14］。利用二氧化硅微球包埋聯(lián)吡啶釕，可以改善SiO2溶膠-凝膠法固定聯(lián)吡啶釕傳感器的穩(wěn)定性［15，16］。殼聚糖分子中含有豐富的游離氨基和羥基，具有良好的吸附能力、導電能力和生物相容性，是電化學發(fā)光傳感器中較優(yōu)良的材料［17］。

2　實驗部分

2．1儀器與試劑

MPI-E型電致化學發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁電子科技有限公司)，Zennium電化學工作站(德國Zahner公司)，UV-1600PC紫外-可見分光光度計(中國上海美譜達儀器有限公司)，F(xiàn)-4600熒光分光光度計(日本日立公司)，RT5 POWER電磁攪拌機(德國IKA公司)，WF-300D超聲波清洗機(寧波海曙五方超聲設備有限公司)，TDL-802B型離心機(上海安亭科學儀器廠)，PT-RO 10L實驗室超純水設備(上海品拓環(huán)保工程設備有限公司)。三電極系統(tǒng):工作電極為裸玻碳電極或修電極，Pt絲為對電極，Ag/AgCl (飽和KCl溶液)為參比電極。

多壁碳納米管(MCNT，中國科學院成都有機化學有限公司，＞7．5%，7～15 nm×0．5～10μm．);殼聚糖(MW=60000～120000 g/mol，乙?；取?0 mol%)、三聯(lián)吡啶釕、Nafion 117、正硅酸乙酯、Triton×-100、正己醇、環(huán)己烷均購于Sigma公司;尿酸(天津市華東試劑廠);其余試劑均為分析純。

2．2CRuS NPs的制備

分別取7．5 mL環(huán)己烷、1．8 mL TrionX-100和正己醇混合，加入300μL超純水為分散相，攪拌0．5 h后，依次加入50μL 0．01 moL/L三聯(lián)吡啶釕和150μL 0．5%殼聚糖溶液形成穩(wěn)定的油包水結構，并加入適量NaOH溶液，將體系調為中性，然后持續(xù)攪拌1 h，依次加入90μL正硅酸乙酯、60μL氨水，再持續(xù)攪拌24 h，反應完全后，加入6 mL丙酮破乳，離心收集復合納米粒子，然后分別以乙醇、超純水超聲離心，吸取上清液得復合納米粒子，最終將其分散在NaAc-HAc緩沖溶液(pH 5．0)中，2℃保存。

2．3電化學發(fā)光傳感器的制備

將玻碳電極(直徑2 mm)在0．05μmAl2O3拋光粉上打磨光亮，分別在HNO3(1∶1，V/V)，乙醇(1∶1，V/V)，超純水中超聲3 min，干燥后。取10μL Nafion/MCNT混合液滴加于干凈的玻碳電極表面，自然晾干。將修好的電極插入200μL均勻的CRuSNPs溶液中30 min，CRuSNPs復合納米粒子通過靜電吸附隨時間逐漸自組裝于Nafion/MCNT電極表面，隨后用0．01 mol/L PBS(pH 7．4)沖洗電極，去除非特異性吸附的CRuSNPs納米粒子，隨后，用循環(huán)伏安技術將CRuSNPs/Nafion/MCNT電極在0．9～1．4 V的電位窗口下掃描至穩(wěn)定，除去電極表面多余的，最終可制得電化學發(fā)光傳感器。圖1為電化學發(fā)光傳感器的原理圖。

圖1　電化學發(fā)光傳感器的原理圖Fig．1　Principle diagram ofelectrochemical luminescence sensor

2．4實驗方法

以CRu NPs/Nafion/MCNT/GCE修電極為工作電極，當電解池中的尿酸與修電極作用15 min后，在-0．2～1．4 V范圍內進行循環(huán)伏安掃描，掃描速率為100mV/s，介質為0．10mol/L PBS緩沖溶液(含50 mmol/L TPA，pH 7．4)，光電倍增管負高壓為800 V，記錄電化學發(fā)光信號，通過電化學發(fā)光強度值對尿酸進行定量分析，所有實驗均在室溫下進行，所有電位值均相對于Ag/AgCl參比電極。

3　結果與討論

3．1CRuSNPs的表征

對合成的CRuSNPs進行了TEM表征(圖2)，由圖2可知，所制備的納米顆粒的平均直徑為50 nm且分散效果較好。CRuSNPs的紫外和熒光光譜圖見圖3。由圖3A可知，合成的CRuSNPs復合納米粒子與游離態(tài)的紫外吸收光譜形狀相同，可知CRuSNPs在水溶液中具有很好的分散性。由圖3B可知，在458 nm激發(fā)波長下，游離態(tài)的最大發(fā)射波長為596 nm，而CRuSNPs的最大發(fā)射波長較藍移了17 nm，這可能是因為CRuSNPs溶液中的SiO-基團與之間的靜電吸附使得被束縛在SiO2納米粒子內部，致使CRuSNPs在溶液中時，很少與周圍的水分子相互作用，顯示出熒光發(fā)射波長相對較短［18］。

3．2傳感器的電化學及電化學發(fā)光行為

實驗對不同電極表面進行了電化學及電化學發(fā)光行為進行研究。由不同電極在0．1 mol/L PBS (pH 7．4)中循環(huán)伏安圖(圖4A)可見，Nafion/MCNT修電極(曲線 b)的電流強于裸玻碳電極(曲線a)，這是因為MCNT具有較強的導電性，說明Nafion/MCNT已修于玻碳電極上，而CRuSNPs/ Nafion/MCNT修電極(曲線c)的電流強于Nafion/MCNT修電極(曲線b)，這是因為CRuSNPs納米粒子具有較大的比表面積，電子傳導能力增強，且由曲線c還可看出，在+1．1 V處出現(xiàn)可逆的氧化還原峰，這正是的特征峰，說明CRuS NPs已成功修于Nafion/MCNT上。

由不同電極在50 mmol/L TPA(0．1 mol/L PBS，pH 7．4)中的電化學發(fā)光圖(圖4B)可知，裸電極(曲線a)和Nafion/MCNT修電極(曲線b)幾乎不發(fā)光，但將CRuSNPs納米粒子固定在Nafion/MCNT修電極上時，出現(xiàn)明顯的發(fā)光現(xiàn)象(曲線c)，這表明CRuSNPs已很好地固定在Nafion/MCNT電極表面，從而顯示出良好的電化學發(fā)光行為。

穩(wěn)定性和重現(xiàn)性對于構建可重復使用的修電極至關重要。由CRuS NPs/Nafion/MCNT修電極連續(xù)掃描電化學發(fā)光圖(圖4C)可見，Nafion/MCNT與CRuSNPs混合膜修電極在連續(xù)掃描10圈的過程中，電化學發(fā)光信號非常穩(wěn)定。

圖2 CRuSNPs的TEM圖Fig．2　TEM image of chitosan-Rucomposite nanoparticles(CRuSNPs)

圖3 Ru(bpy)和CRuSNPs(b)的紫外光譜圖(A)和熒光光譜圖(B)Fig．3　UV-vis spectra(A)and fluorescence spectraand CRuS NPs(b)

圖4　不同電極在0．1 mol/L PBS(pH 7．4)中的循環(huán)伏安曲線(A)，不同電極在0．1 mol/L PBS(含50 mmol/L TPA，pH 7．4)中的電化學發(fā)光曲線(B)，CRu NPs-Nafion/MCNT修電極循環(huán)電位掃描10圈的電化學發(fā)光-時間曲線(C)，其中GCE(a)，Nafion/MCNT/GCE(b)，CRu NPs-Nafion/MCNT/GCE(c)Fig．4　Cyclic voltammograms obtained at different electrodes in 0．1 mol/L PBS(pH=7．4)(A)，ECL intensitypotential profiles obtained at different electrodes in 0．1mol/L PBS(pH 7．4)containing 50mmol/L tri-n-propylamine(TPA)(B)，ECL intensity-time curves of CRu NPs-Nafion/MCNT/GCE obtained in 0．1 mol/L PBS (pH 7．4)containing 50 mmol/L TPA from continuous potential scanning over ten cycles(C)．GCE(a)，Nafion/MCNT/GCE(b)，CRu NPs-Nafion/MCNT/GCE(c)

3．3尿酸在CRuSNPs/Nafion/MCNT修電極上的電化學發(fā)光行為

考察了尿酸在CRuS NPs/Nafion/MCNT修電極上的電化學發(fā)光行為。如圖5所示，當在0．10 mol/L PBS(含50 mmol/L TPA，pH 7．4)中加入1．0×1007mol/L尿酸時，電化學發(fā)光強度降低，證明尿酸對 CRuS NPs/Nafion/MCNT修電極上的電化學發(fā)光有抑制作用。眾所周知，對于電化學發(fā)光體系被電氧化為而TPA被電氧化為TprA0+，從而形成TprA0自由基和TprA0+反應得到從激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)便產(chǎn)生電化學發(fā)光。尿酸對該電化學發(fā)光體系的猝滅原因可能是由于尿酸的加入，消耗了部分所致［13］。

圖5　CRuS NPs/Nafion/MCNT/GCE在含50 mmol/L TPA的0．10 mol/L pH 7．4 PBS(a)和含50 mmol/L TPA和0．10μmol/L尿酸的0．10 mol/L pH 7．4 PBS (b)中的電化學發(fā)光響應圖。Fig．5　ECL intensity-potential profiles obtained at CRuS NPs/Nafion/MCNT/GCE　in(a)　0．1　mol/L　PBS (pH 7．4)　containing 50　mmol/L　TPA　and　(b) 0．1 mol/L　PBS　(pH 7．4)　containing　containing 50 mmol/L TPA and 1．0×1007μmol/L uric acid．

3．4實驗條件的選擇

CRu NPs中的羥基能與尿酸中的胺基形成氫鍵，故CRu NPs/Nafion/MCNT/GCE修電極與尿酸的作用時間及體系的pH值均對電化學發(fā)光強度有一定的影響。由圖6可知，隨著反應時間延長，電化學發(fā)光信號逐漸降低，到15 min時發(fā)光強度趨于平穩(wěn)，再繼續(xù)延長結合時間，響應信號幾乎不變。這表明15 min時即可達到猝滅最大程度，因此選擇15 min作為反應時間。實驗考察了1．0×1007mol/L尿酸在pH 5．8～8．0范圍內的電化學發(fā)光現(xiàn)象。結果表明，隨著pH值增大，抑制效果先增大后減小，當pH=7．4時，抑制效果最大。因此選擇pH 7．4的緩沖溶液進行后續(xù)實驗。

3．5干擾實驗

在最佳實驗條件下，當尿酸濃度為1．0×1007mol/L，相對誤差不超過±5%時，1000倍的K+，Na+，F(xiàn)e2+，Zn2+，Ca2+，Mg2+，Cl0;500倍的葡萄糖、尿素、蔗糖;100倍的L-谷氨酸、L-賴氨酸、羥脯氨酸、抗壞血酸不干擾測定;50倍的草酸干擾測定，實驗采取加入Ca2+消除干擾。

3．6傳感器對尿酸的電化學發(fā)光響應

在優(yōu)化實驗條件下，按實驗方法測定不同濃度尿酸電化學發(fā)光強度并繪制工作曲線(圖7)。電化學發(fā)光強度和尿酸濃度(1．0×10010～1．0×1005mol/L)的負對數(shù)呈良好的線性關系，線性方程為: IECL=0709．52－202．74lg C，相關系數(shù)R=0．9936，檢出限(S/N=3)為6．0×10012mol/L。

圖6　1．0×1007mol/L尿酸電化學發(fā)光強度與反應時間的響應曲線Fig．6　ECL intensity-time curves of 0．1 mol/L PBS(pH 7．4)containing 1．0×1007mol/L uric acid

圖7　不同濃度尿酸電化學發(fā)光響應曲線Fig．7　ECL intensity-potential curves with different concentrations of uric acid．(a)blank，(b)1．0×10010mol/L，(c)　1．0　×　1009mol/L，(d)　1．0　×　1008mol/L，(e)1．0×1007mol/L，(f)1．0×1006mol/L，(g)1．0× 1005mol/L．Inset:calibration curve for uric acid

3．7傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性分析

用同一支傳感器對1．0×10-8mol/L尿酸連續(xù)測定11次，電化學發(fā)光強度相對偏差為2．9%，用同一批次的5支傳感器對1．0×10-8mol/L尿酸進行測定，電化學發(fā)光強度相對偏差為3．1%，說明此傳感器有較好的重現(xiàn)性。為考察傳感器的穩(wěn)定性，使傳感器吸附1．0×10-8mol/L尿酸溶液后，置于4℃下保存，定期測定電化學發(fā)光信號值。14天內，電化學發(fā)光強度幾乎不變，說明傳感器的穩(wěn)定性較好。

3．8樣品測定

取3份新鮮尿液0．5mL于50mL容量瓶中，加入1．00mL 0．01mol/LCaCl2以除去用高純水定容，再將該溶液稀釋1000倍，以此為分析樣品，按照實驗方法進行測定，同時，進行加標回收實驗，測定結果見表1。加標回收率為98．5%～103．5%，RSD為2．3%～3．1%，表明本方法可用于實際樣品的測定。

表1　尿液樣品分析及回收率實驗Table 1　Determination result of uric acid in urine(n=11)

4　結論

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Thiswork was supported by the National Natural Science Foundation of China(No．30970696)．

2015年度《分析化學》最佳審稿專家

本刊2015年度收到論文千余篇，在廣大分析化學專家的熱情支持下，順利完成全年的編輯出版工作，并榮獲““中國百種杰出學術期刊(2014年度)”稱號和“中國知網(wǎng)”評選的“2015中國最具國際影響力學術期刊”稱號。衷心感謝廣大分析化學工作者對本刊的支持與厚愛。為表彰在提高《分析化學》期刊學術質量工作中做出了突出貢獻的審稿專家，編輯部舉辦了首屆"最佳審稿專家"評選活動。此次評選主要依據(jù)審稿專家的審稿質量、審稿數(shù)量、審稿周期等評價指標，經(jīng)綜合評議，評選出了12名最佳審稿專家。名單公布如下:

Determination of Uric Acid Based on Chitosan/Ru(bpy)/SilicaNanoparticles Electrochem ilum inescence Sensor

FAN Xue-Mei1，WANG Shu-Min1，LIZhe-Jian1，ZHENG Xing-Wang2
1(College of Chemical Engineering and Modern Materials，Shangluo University，Shangluo 726000，China)2(School of Chemistry and Chemical Engineering，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，China)

Chitosan-Rucomposite nanoparticles(CRuS NPs)were prepared by reverse microemulsion method，and based on the Nafion/MCNT composite membrane technology，CRuS NPs were effectively andsteadilyimmobilizeonthesurfaceof aglassycarbonelectrodetopreparethe electrochemiluminescence sensor for uric acid determination．In 0．1 mol/L PBS(pH 7．4)buffer solution，whentheactuationdurationbetweenuricacidandthemodifiedelectrodewas15min，the electrochemiluminescence showed a good linear relationship to the negative logarithm of uric acid concentration in the range of 1．0×10-10－1．0×10-5mol/L，the linear equation was IECL=-709．52－202．74lg C and the correlation coefficient was 0．9936 with a detection limit of 6．0×10-12mol/L．The ECL sensor exhibited excellent repeatability and stability，and the RSD for 11 times determination of1．0×10-8mol/L uric acid was 2．9%．The recovery was 98．5%－103．5%in the determination of real Uric acid sample．

Electrogenerated chemiluminescence;Chitosan-Ru(bpy)nanoparticles;Uric acid

6 September 2015;accepted 29 December 2015)

姓名　單位　審稿論文(篇)邵學廣　南開大學化學系　9郭偉強　浙江大學化學系　7尹學博　南開大學化學系　7胡斌　武漢大學化學系　7屠一峰　蘇州大學化學系　6趙先恩　曲阜師范大學化學化工學院　6劉文涵　浙江工業(yè)大學化學工程與材料學院　6李攻科　中山大學化學化工學院　6邢志　清華大學化學系　6干寧　寧波大學理學院化學系　5欒天罡　中山大學生命科學學院　5韓鶴友　華中農(nóng)業(yè)大學理學院　5

10．11895/j．issn．0253-3820．150705

2015-09-06收稿;2015-12-29接受

本文系國家自然科學基金(No．30970696);陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2012KTDZ02-02);商洛市科技局計劃項目(SK-2014-4)及陜西省尾礦資源綜合利用重點實驗室項目(14SKY-FWK06)資助。

*E-mail:fanxuemei527@163．com