高瑞雄，閆巧珍，岳珍珍，雷宏杰，徐懷德*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

冷榨核桃粕液態(tài)發(fā)酵制備核桃多肽

高瑞雄，閆巧珍，岳珍珍，雷宏杰，徐懷德*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

探討以冷榨核桃粕為主要原料，采用納豆芽孢桿菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵制備核桃多肽的方法。分析發(fā)酵時(shí)間、底物質(zhì)量濃度、起始pH值、接種量及發(fā)酵溫度對(duì)核桃多肽產(chǎn)量和水解度的影響，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面分析法對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到的最優(yōu)工藝參數(shù)為：發(fā)酵時(shí)間84 h、底物質(zhì)量濃度8 g/100 mL、起始pH 8.0、接種量11%、發(fā)酵溫度33 ℃。此發(fā)酵條件下核桃多肽質(zhì)量濃度和水解度均達(dá)到最大值，分別為2.58 mg/mL和37.5%。

冷榨核桃粕；納豆芽孢桿菌；液態(tài)發(fā)酵；多肽；工藝優(yōu)化

核桃（Juglans regia L.）屬胡桃科胡桃屬植物，我國(guó)是世界第一大核桃生產(chǎn)國(guó)［1］，栽培面積5 000多萬(wàn)畝，產(chǎn)量達(dá)150多萬(wàn)t［2］。核桃果仁營(yíng)養(yǎng)豐富，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)60%以上，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)20%，其氨基酸種類(lèi)齊全、組成合理，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源。核桃的加工主要是榨油，冷榨核桃粕是核桃仁冷榨油后的副產(chǎn)物。相比熱榨法，冷榨核桃粕蛋白變性少，蛋白質(zhì)含量30%以上，還含有多種微量元素和不飽和脂肪酸，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［3］。多數(shù)核桃油生產(chǎn)企業(yè)將核桃粕用作飼料或肥料，核桃粕利用率低，資源嚴(yán)重浪費(fèi)［4］，因此，亟需開(kāi)發(fā)新技術(shù)對(duì)其進(jìn)行深加工利用。

人體攝取的蛋白質(zhì)經(jīng)消化后主要以肽的形式吸收［5］。核桃蛋白經(jīng)過(guò)酶解后可制得小分子多肽，它具有溶解性高、黏度低、吸濕性強(qiáng)等功能特性，還具有抗氧化性、抑菌性、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性、溶血活性、血小板聚集抑制活性等生理功能，但酶制劑價(jià)格昂貴、成本高、生產(chǎn)工藝復(fù)雜。目前已有研究采用枯草芽孢桿菌［6］或黑曲霉［7-8］發(fā)酵核桃粕制備天然抗氧化肽。微生物發(fā)酵法制備的植物多肽已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品及環(huán)保等領(lǐng)域［9-10］，而以納豆芽孢桿菌發(fā)酵制備核桃多肽的研究未見(jiàn)報(bào)道。

納豆芽孢桿菌是我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局公布的食品用益生菌，其具有改善人體腸道菌群生態(tài)、助消化、增強(qiáng)細(xì)胞免疫等功能［11］。納豆芽孢桿菌發(fā)酵可產(chǎn)生包括蛋白酶、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶等多種酶系。蛋白酶能降解大分子蛋白質(zhì)，生成小分子功能性多肽，其他酶的產(chǎn)生可降解發(fā)酵基質(zhì)中的大分子物質(zhì)，從而提高機(jī)體對(duì)基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)成分的吸收利用率。

本研究以核桃粕為原料，采用納豆芽孢桿菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，分析發(fā)酵時(shí)間、底物質(zhì)量濃度、起始pH值、接種量和發(fā)酵溫度對(duì)核桃多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響，通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，為核桃粕的綜合利用、經(jīng)濟(jì)價(jià)值的提升提供理論依據(jù)和方法指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料、菌種與試劑

冷榨核桃粕（粗蛋白含量32.89%） 河北綠嶺莊園食品有限公司。

納豆芽孢桿菌 CICC10023 中國(guó)工業(yè)菌種保藏中心。

Gly-Gly-Tyr-Arg 美國(guó)Sigm a公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQLS-50G立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；ZYF-161智能恒溫培養(yǎng)振蕩器 黑龍江東拓儀器制造有限公司；GNP-9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PB-10 pH計(jì) 賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；HJ-4A數(shù)顯恒溫多頭磁力攪拌器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；KDC-40低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；FTX-FA1004電子天平 美國(guó)康州HZ電子科技有限公司。

1.3方法

1.3.1生長(zhǎng)曲線測(cè)定

液體培養(yǎng)基組成：牛肉膏3 g/L、蛋白胨5 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7.0，加入15 g/L瓊脂得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基。采用分光光度法測(cè)定納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線［12］。分別配制液體培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將保藏的菌種轉(zhuǎn)接到基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h使菌種活化。用接種環(huán)挑2 環(huán)活化的菌種到液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)（37 ℃，150 r/min），每隔3 h取樣一次，樣品稀釋10 倍后，以液體培養(yǎng)基為對(duì)照，在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌體的吸光度，以吸光度對(duì)培養(yǎng)時(shí)間作圖得到生長(zhǎng)曲線。

1.3.2蛋白酶活力測(cè)定

蛋白酶活力的測(cè)定參考GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》和福林-酚法［13］。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制定：依次量取100 μg/mL的L-酪氨酸溶液0、1、2、3、4、5 mL于6 支試管中，然后加蒸餾水至10 mL。取上述溶液各1.00 mL，分別加入0.4 mol/L的碳酸鈉溶液5 mL、福林-酚試劑1 mL，混勻后在40 ℃顯色20 min，最后在680 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以不含L-酪氨酸的空白管進(jìn)行調(diào)零。以吸光度對(duì)L-酪氨酸濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到方程為：y=10.165 0x+0.004 6（R2=0.999 6）。根據(jù)式（1）計(jì)算蛋白酶活力。

式中：A1、A0分別為樣品和空白的吸光度；4為反應(yīng)的總體積；n為稀釋倍數(shù)；K為吸光常數(shù)，指A680nm=0時(shí)的L-酪氨酸質(zhì)量（97.92 μg）；10為反應(yīng)時(shí)間/min。

將核桃粕發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌冷卻后，接入種子液，空白對(duì)照中加入等量的無(wú)菌生理鹽水，同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵。每隔12 h取一定體積的發(fā)酵液，2 862×g離心15 min，取上清液適當(dāng)稀釋?zhuān)瞻讓?duì)照與樣品進(jìn)行相同的處理。取試管加入1 mL上清液，置于40 ℃恒溫水浴鍋中，加入10 mg/mL的酪素1 mL（酪素需要在40 ℃水浴中預(yù)熱5 min）開(kāi)始反應(yīng)，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)10 min后，立即取出加入0.4 mol/L的三氯乙酸2 mL，靜置10 min，然后過(guò)濾。取1 mL濾液，分別加入0.4 mol/L的碳酸鈉溶液5 mL、福林-酚試劑1 mL，混勻后在40 ℃顯色20 min，最后在680 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.3多肽質(zhì)量濃度測(cè)定

采用雙縮脲法測(cè)定多肽質(zhì)量濃度［14］。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制定：將Gly-Gly-Tyr-Arg用體積分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸依次配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL的四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取6.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液加入4.0 mL雙縮脲試劑，混勻靜置10 min后，715×g離心10 min，取上清液在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以5%三氯乙酸為空白調(diào)零。以吸光度對(duì)多肽質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到方程為：y=0.136 6x+0.000 8（R2=0.999 3）。

樣品測(cè)定：準(zhǔn)確吸取5 mL發(fā)酵液，1 118×g離心15 min，取2.5 mL上清液加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻靜置10 min，然后2 862×g離心10 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，用5%的三氯乙酸定容，取6.0 mL樣液加入4.0 mL雙縮脲試劑，混勻靜置10 min，然后715×g離心10 min，取上清液在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中多肽的質(zhì)量濃度。

1.3.4水解度測(cè)定

采用甲醛滴定法測(cè)定水解度［15］。取發(fā)酵液10 mL，2 862×g離心10 min，吸取5 mL上清液于燒杯中，加入25 mL蒸餾水。將燒杯置于磁力攪拌器上，插入pH電極。開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用NaOH溶液調(diào)pH值至8.2，并且保持1 min不變，然后加入15 mL中性甲醛溶液，1 min后用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定pH值至9.2。記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定的體積（V1）。以接種等量無(wú)菌水的發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對(duì)照，相同處理后，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定的體積（V0）。按照式（2）計(jì)算水解度。

式中：V0、V1為分別空白液和發(fā)酵液加入甲醛后消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度/（mol/L）；V為離心后取上清液的體積，取5 mL；ρ為發(fā)酵液中底物含量/（g/100 mL）；ω為核桃粕的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（32.89%）；14.01為氮的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；0.16為換算系數(shù)。

1.3.5核桃粕液體發(fā)酵單因素試驗(yàn)

將冷榨核桃粕粉碎過(guò)40 目篩網(wǎng)。分別稱(chēng)取核桃粕粉10 g、NaCl和葡萄糖各0.05 g，加水到一定底物含量，調(diào)pH值后，用高壓滅菌鍋121 ℃濕熱滅菌15 min，冷卻后接入種子液，并于恒溫振蕩器中發(fā)酵，轉(zhuǎn)速150 r/min。接種后發(fā)酵120 h，每隔12 h測(cè)定多肽質(zhì)量濃度和水解度，觀察多肽質(zhì)量濃度和水解度隨時(shí)間的變化。此外分別研究底物質(zhì)量濃度、起始pH值、接種量及發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響。

1.3.6響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定發(fā)酵時(shí)間84 h，底物含量8 g/100 mL。通過(guò)Design-Expert 1.5軟件，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)（BBD）原理，選擇對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度影響較大的起始pH值、接種量、發(fā)酵溫度3 個(gè)因素為考察指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，并考察3 個(gè)因素的交互作用。

1.3.7驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化條件下重復(fù)6 次實(shí)驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵液中的多肽質(zhì)量濃度和水解度，進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性。

1.4數(shù)據(jù)處理

所得的數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理，用Design-Expert 1.5軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

圖1　納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1　Growth curve o f Bacillus subtils natto

由圖1可知，發(fā)酵前3 h為菌種的延滯期，在這個(gè)時(shí)間段，菌種適應(yīng)新的環(huán)境，活菌總數(shù)幾乎沒(méi)有變化；3～18 h為菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體活躍并大量增殖，并在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值；18～30 h為菌種的穩(wěn)定期，在這個(gè)時(shí)間段，菌種增長(zhǎng)的同時(shí)有部分菌種衰亡，增長(zhǎng)量和衰亡量趨于平衡，活菌數(shù)保持穩(wěn)定；30 h以后進(jìn)入衰亡期，菌體衰亡加快，出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。研究表明，培養(yǎng)基質(zhì)的不同使納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)期的各個(gè)時(shí)間段稍有差別，但生長(zhǎng)曲線總體趨勢(shì)相同［16］。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌種代謝旺盛，抗不良條件能力強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)選取培養(yǎng)12 h的菌液為種子液。

2.2發(fā)酵液中蛋白酶活力隨時(shí)間的變化

圖2　蛋白酶活力隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.2　Changes in proteinase activities during fermentation

不同菌種在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶的種類(lèi)及活力不同。納豆芽孢桿菌代謝產(chǎn)生的蛋白酶不是單一的蛋白酶，而是復(fù)合的蛋白酶系，而且以中性蛋白酶和堿性蛋白酶為主。從圖2可以看出，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶的活力都呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，在發(fā)酵120 h時(shí)，堿性蛋白酶和中性蛋白酶的活力分別達(dá)到190 U/mL和179 U/mL；在發(fā)酵60 h之前，堿性蛋白酶活力高于其他兩種蛋白酶活力；發(fā)酵60 h以后，中性蛋白酶活力逐漸增大，與堿性蛋白酶活力相當(dāng)，且明顯高于酸性蛋白酶活力。這是由于在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，菌種從延滯期到衰亡期，代謝產(chǎn)生的蛋白酶含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷積累，從而蛋白酶活力也呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，當(dāng)菌種衰亡后，產(chǎn)酶能力下降，蛋白酶的活力也不再變化［17］。

2.3多肽質(zhì)量濃度和水解度隨發(fā)酵時(shí)間的變化

圖3　多肽質(zhì)量濃度和水解度隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.3　Changes in polypeptide and DH during fermentation

由圖3可知，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液中的多肽質(zhì)量濃度及水解度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。在84 h之前，納豆芽孢桿菌增長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生多種蛋白酶，通過(guò)對(duì)核桃蛋白的降解，使得多肽質(zhì)量濃度和水解度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升［18］；發(fā)酵84 h之后，到達(dá)發(fā)酵后期，納豆芽孢桿菌開(kāi)始衰亡，產(chǎn)生的蛋白酶量逐漸減少，且部分多肽在蛋白酶的作用下進(jìn)一步降解生成游離氨基酸，導(dǎo)致多肽質(zhì)量濃度略微降低，水解度則持續(xù)增加，但增加的幅度低于發(fā)酵前期。綜合考慮，確定發(fā)酵時(shí)間為84 h。

2.4液態(tài)發(fā)酵核桃粕制備核桃多肽單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1底物質(zhì)量濃度對(duì)核桃多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響

圖4　底物質(zhì)量濃度對(duì)多肽質(zhì)量濃度和核桃粕蛋白水解度的影響Fig.4　Effect of feed concentration on polypeptide content and DH

由圖4可知，底物質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵結(jié)束后核桃多肽質(zhì)量濃度及核桃粕蛋白水解度的影響呈相反趨勢(shì)，底物質(zhì)量濃度越大，多肽質(zhì)量濃度越高，水解度反而越低。這是由于低底物質(zhì)量濃度時(shí)，納豆芽孢桿菌繁殖產(chǎn)生的蛋白酶與底物充分接觸反應(yīng)，使得核桃蛋白水解度增大，但是底物質(zhì)量濃度低，多肽的生成量相對(duì)較低。高底物質(zhì)量濃度導(dǎo)致料液呈現(xiàn)黏稠狀，溶氧量低，不利于納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖，底物量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白酶量，酶促反應(yīng)弱，因此水解度較低［19］；另外，發(fā)酵前原料的高壓滅菌熱處理使得部分核桃蛋白變性降解產(chǎn)生多肽，且產(chǎn)量隨底物含量增大而增加。底物質(zhì)量濃度為8 g/100 mL和11 g/100 mL時(shí)，多肽質(zhì)量濃度分別為2.03、2.21 mg/mL，水解度分別為33.2%、16.3%，考慮到原料的利用率，確定底物質(zhì)量濃度為8 g/100 mL比較適宜。

2.4.2起始pH值對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響

圖5　起始pH值對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響Fig.5　Effect of initial pH on polypeptide content and DH

由圖5可知，起始pH值對(duì)核桃多肽質(zhì)量濃度及水解度的影響呈相反趨勢(shì)，起始pH值越大，發(fā)酵結(jié)束后多肽質(zhì)量濃度也越高，而水解度卻越低。起始pH值小于7.0時(shí)，發(fā)酵液呈酸性，納豆芽孢桿菌繁殖緩慢，但是發(fā)酵前高壓熱處理結(jié)合酸的作用，使蛋白質(zhì)變性而部分蛋白降解產(chǎn)生多肽和游離氨基酸，最終導(dǎo)致多肽質(zhì)量濃度較低、水解度較大。當(dāng)起始pH值大于7.0時(shí)，納豆芽孢桿菌大量繁殖，產(chǎn)生的堿性蛋白酶降解核桃蛋白形成多肽，使得多肽質(zhì)量濃度升高，水解度相對(duì)酸性條件較低。這是由于弱堿性條件更適合納豆芽孢桿菌的產(chǎn)酶以及蛋白酶活性的發(fā)揮［20］?？梢?jiàn)起始pH值對(duì)多肽質(zhì)量濃度及水解度變化影響較大，將作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素。

2.4.3接種量對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響

圖6　接種量對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響Fig.6　Effect of inoculum amount on polypeptide content and DH

由圖6可知，多肽質(zhì)量濃度和水解度隨接種量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，該試驗(yàn)條件下，接種量為11%時(shí)，多肽質(zhì)量濃度和水解度均達(dá)到最大值，分別為2.36 mg/mL和35.7%，接種量太大或太小都不利于多肽質(zhì)量濃度和水解度的提高［21］。這是由于接種量低于11%時(shí)，隨著接種量增加，納豆芽孢桿菌密度逐漸增大，產(chǎn)生的蛋白酶量也隨之增加，使得多肽質(zhì)量濃度和水解度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。當(dāng)接種量大于11%時(shí)，菌體密度的增大導(dǎo)致繁殖速率下降，產(chǎn)酶量降低，使得多肽質(zhì)量濃度和水解度降低。

2.4.4發(fā)酵溫度對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響

圖7　發(fā)酵溫度對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響Fig.7　Effect of fermentation temperature on polypeptide content and DH

溫度是影響微生物生長(zhǎng)及蛋白酶活性的關(guān)鍵因素之一。由圖7可知，多肽質(zhì)量濃度和水解度隨溫度的升高呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。該條件下，發(fā)酵溫度為34 ℃時(shí)，多肽質(zhì)量濃度和水解度達(dá)到最大值，分別為2.65 mg/mL和34.9%，說(shuō)明納豆芽孢桿菌在該溫度條件下能較好的生長(zhǎng)繁殖，且其代謝產(chǎn)生的蛋白酶具有較大的活性，過(guò)低或過(guò)高的溫度都不利于納豆芽孢桿菌的代謝產(chǎn)酶以及蛋白酶最大活性的發(fā)揮［21］。

2.5核桃粕液態(tài)發(fā)酵制備核桃多肽工藝響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果回歸模型方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以多肽質(zhì)量濃度和水解度為指標(biāo)做BBD響應(yīng)面分析，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，共15 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12 個(gè)析因點(diǎn)，3 個(gè)零水平點(diǎn)。

表1　BBD響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table1　Experimental design and results for BBD response surface analysis

通過(guò)Design-Expert 1.5數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表2、3。由表2可知，以多肽質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，該模型效應(yīng)極顯著（P=0.000 1），因變量與自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.991 0），模型調(diào)整確定系數(shù)為，說(shuō)明該模型能模擬97.48%響應(yīng)值的變化，可信度高，與實(shí)際情況擬合良好，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明本試驗(yàn)的二次回歸方程能很好地對(duì)多肽質(zhì)量濃度進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。各因素中二次項(xiàng)以及交互項(xiàng)表現(xiàn)為極顯著；一次項(xiàng)以及二次項(xiàng)表現(xiàn)為顯著，說(shuō)明其對(duì)響應(yīng)值多肽質(zhì)量濃度影響極大。根據(jù)表2，各因素的影響順序?yàn)榻臃N量＞起始pH值＞發(fā)酵溫度。所得二次回歸方程為：

表2　多肽質(zhì)量濃度回歸模型方差分析Table2　Analysis of variance for the fitted quadratic model of polypeptide content

表3　水解度回歸模型方差分析Table3　Analysis of variance for the fitted quadratic model of DH

由表3可知，以水解度為響應(yīng)值，該模型效應(yīng)極顯著（P=0.000 5），因變量與自變量之間的線性關(guān)系顯著（，模型調(diào)整確定系數(shù)為說(shuō)明模型能模擬95.66%響應(yīng)值的變化，可信度高，與實(shí)際情況擬合良好，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明本試驗(yàn)的二次回歸方程能很好地對(duì)水解度進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。各因素中一次項(xiàng)X2及二次項(xiàng)X12和X22表現(xiàn)為極顯著；一次項(xiàng)X1和交互項(xiàng)X1X3表現(xiàn)為顯著，說(shuō)明它們對(duì)響應(yīng)值水解度影響極大。根據(jù)表3，各因素的影響順序?yàn)榻臃N量＞起始pH值＞發(fā)酵溫度。所得二次回歸方程為：Y2=-1.833 0+0.321 1X1+0.186 3X2-0.005 2X3-0.000 5X1X2+0.002 8X1X3-0.000 04X2X3-0.026 0X12-0.008 1X22-0.000 3X32。

2.5.2因素交互作用分析與最優(yōu)試驗(yàn)條件驗(yàn)證

通過(guò)軟件分析，將其中的一個(gè)因素固定在零水平，可以得到兩個(gè)因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的響應(yīng)面圖及等高線圖（圖8、9），其中等高線為圓形，表示交互作用較弱，等高線為橢圓形的，表示交互作用較強(qiáng)。

圖8　各兩因素交互作用對(duì)多肽質(zhì)量濃度影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig.8　Response surface and corresponding contour plots for the effects of fermentation parameters on polypeptide content

圖9 各兩因素交互作用對(duì)水解度影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig.9　Response surface and corresponding contour plots for the effects of fermentation parameters on DH

圖8a和9a都是起始pH值與接種量的交互作用，二者等高線圖相似，同樣，圖8b和9b、圖8c和9c分別對(duì)應(yīng)著起始pH值和發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵溫度的交互作用，且各自對(duì)應(yīng)的等高線圖相似。所以結(jié)合圖8、9可以看出，圖8a、9a的等高線接近圓形，說(shuō)明起始pH值和接種量交互作用對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響微弱；圖8b和9b、圖8c和9c的等高線均呈橢圓形，說(shuō)明起始pH值與發(fā)酵溫度交互及接種量與發(fā)酵溫度交互作用對(duì)多肽質(zhì)量濃度和水解度的影響顯著；圖8b、9b中，隨著起始pH值的增大，多肽質(zhì)量濃度和水解度迅速升高，在pH 8.0時(shí)達(dá)到最大值后迅速降低；圖8c、9c中，隨著接種量的增大，多肽質(zhì)量濃度和水解度迅速升高，在接種量為11%時(shí)達(dá)到最大值后迅速降低。因此，結(jié)合圖8、9可以看出，與起始pH值和接種量相比，發(fā)酵溫度對(duì)多肽質(zhì)量濃度的影響較弱，這與方差分析結(jié)果一致。

運(yùn)用Design-Expert 1.5軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，以多肽質(zhì)量濃度為響應(yīng)值優(yōu)化得到模型的最優(yōu)解為：起始pH值為8.63、接種量11.11%、發(fā)酵溫度34.93 ℃，該條件下多肽質(zhì)量濃度的預(yù)測(cè)值為2.646 8 mg/mL；以水解度為響應(yīng)值優(yōu)化得到模型的最優(yōu)解為：起始pH 7.82、接種量11.21%、發(fā)酵溫度32.41 ℃，該條件下水解度的預(yù)測(cè)值為38.33%。結(jié)合兩個(gè)最優(yōu)解，根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)條件，將制備工藝條件修正為：起始pH 8.0、接種量11%、發(fā)酵溫度33 ℃，以此條件對(duì)響應(yīng)面結(jié)果的可靠性進(jìn)行檢驗(yàn)，在該條件下進(jìn)行6 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵測(cè)得的多肽質(zhì)量濃度和水解度分別為2.58 mg/mL、37.5%，與理論預(yù)測(cè)值相比其相對(duì)誤差分別約為2.52%、2.17%。優(yōu)化后結(jié)果與之前研究對(duì)比，梁杏等［6］用枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵核桃粕后的水解度為35%，謝翠品等［7］用黑曲霉發(fā)酵核桃粕優(yōu)化后的多肽質(zhì)量濃度為22.33 μg/mL，可見(jiàn)納豆芽孢桿菌發(fā)酵效果優(yōu)良。因此認(rèn)為該響應(yīng)面優(yōu)化所得的工藝條件參數(shù)較為準(zhǔn)確，具有實(shí)用價(jià)值。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)初步研究了納豆芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵冷榨核桃粕制備核桃多肽的工藝條件。在發(fā)酵過(guò)程中，納豆芽孢桿菌主要產(chǎn)中性蛋白酶和堿性蛋白酶。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)：發(fā)酵時(shí)間84 h、底物質(zhì)量濃度8 g/100 mL、起始pH 8.0、接種量11%、發(fā)酵溫度33 ℃，在此發(fā)酵條件下所得發(fā)酵液核桃多肽質(zhì)量濃度為2.58 mg/mL、水解度為37.5%，且納豆芽孢桿菌的發(fā)酵效果優(yōu)于黑曲霉和枯草芽孢桿菌。此外，在核桃多肽制備過(guò)程中，影響核桃多肽產(chǎn)量的因素還有很多，如核桃粕粉碎粒度、生長(zhǎng)因子的種類(lèi)和添加量等。因此，在后續(xù)工作中需要深入研究，使發(fā)酵條件得到進(jìn)一步的改進(jìn)。

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Polypeptide Production from Cold-Pressed Walnut Meal by Liquid-State Fermentation

GAO Ruixiong， YAN Qiaozhen， YUE Zhenzhen， LEI Hongjie， XU Huaide*
（College of Food Science and Engineering， Northwest A&F University， Yangling 712100， China）

Walnut meal， a by-product left after pressing walnuts for oil， contains rich protein and its nutritional value is high. Polypeptide production from cold-pressed walnut meal by liquid-state fermentation of Bacillus subtils natto was investigated in this study. The effects of fermentation time， feed concentration， initial pH， inoculum amount， and fermentation temperature on the content of polypeptide and the degree of hydrolysis （DH） were studied， and these fermentation parameters were optimized by single-factor experiments and Box-Behnken response surface methodology. Results showed that the optimum fermentation parameters were determined as follows: fermentation time， 84 h； feed concentration， 8 g/100 mL； initial pH value， 8.0； inoculum amount， 11% and fermentation temperature， 33 ℃. The maximum content of polypeptide and DH of 2.58 mg/mL and 37.5%， respectively were simultaneously obtained under these optimized conditions.

walnut meal； Bacillus subtils natto； liquid-state fermentation； polypeptide； process optimization

10.7506/spkx1002-6630-201619032

S255.6

A

1002-6630（2016）19-0190-07

高瑞雄， 閆巧珍， 岳珍珍， 等. 冷榨核桃粕液態(tài)發(fā)酵制備核桃多肽［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）: 190-196.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201619032. http://www.spkx.net.cn

GAO Ruixiong， YAN Qiaozhen， YUE Zhenzhen， et al. Polypeptide production from cold-pressed walnut meal by liquidstate fermentation［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 190-196. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619032. http：//www.spkx.net.cn

2015-12-06

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目（2016KTCQ02-22）

高瑞雄（1990—），男，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：grx303303@sina.cn

徐懷德（1964—），男，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)楣肥卟速A藏與加工和天然產(chǎn)物提取。E-mail：xuhuaide@aliyun.com