馮志彬，薛　鈺，陳國(guó)忠，張　娟，羅　樂，程仕偉

（1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025）

1 株產(chǎn)殼聚糖酶細(xì)菌的分離、鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化

馮志彬1，薛鈺1，陳國(guó)忠1，張娟2，羅樂1，程仕偉1

（1.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025）

從煙臺(tái)海岸帶沙質(zhì)土壤中分離篩選殼聚糖酶產(chǎn)生菌株，對(duì)其進(jìn)行分類鑒定，優(yōu)化其發(fā)酵條件，為酶法生產(chǎn)殼寡糖提供技術(shù)依據(jù)。通過透明圈法初步判斷產(chǎn)酶能力，液體發(fā)酵復(fù)篩測(cè)定酶活力，篩選到酶活力達(dá)36.20 U/mL的菌株amyP216。通過菌體形態(tài)、菌落特征、生理生化及16S rDNA序列分析鑒定菌株amyP216為莫哈韋芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）。通過單因素和正交試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵條件為：膠體殼聚糖添加量20 g/L、酵母浸粉添加量12.5 g/L、吐溫-80添加量1.0 g/L、初始發(fā)酵pH 6.0、發(fā)酵溫度30 ℃。在最優(yōu)條件下利用5 L自控發(fā)酵罐培養(yǎng)45 h殼聚糖酶活力可達(dá)到80.60 U/mL，較優(yōu)化前（36.20 U/mL）提高了1.2 倍。莫哈韋芽孢桿菌amyP216是一株殼聚糖酶活力較高的生產(chǎn)菌株，具有潛在的研究和應(yīng)用價(jià)值。

莫哈韋芽孢桿菌；殼聚糖酶；殼寡糖；分離鑒定；發(fā)酵條件優(yōu)化

殼聚糖是甲殼素脫乙酰基后的產(chǎn)物，為自然界中唯一存在的堿性多糖，儲(chǔ)量豐富，但溶解性較差，應(yīng)用受到極大限制，而其降解產(chǎn)物殼寡糖具有優(yōu)良的水溶性，且具有多種生物活性如抗菌、提高機(jī)體免疫力和抗腫瘤等，在保健食品、生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)工業(yè)、化妝品、農(nóng)業(yè)、飼料等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［1-3］。殼聚糖的水解工藝主要包括化學(xué)水解法和酶水解法，與傳統(tǒng)化學(xué)水解法相比，酶解法更易控制，底物特異性強(qiáng)，副產(chǎn)物少，環(huán)境無(wú)污染，是生產(chǎn)殼寡糖的首選方法［4］。殼聚糖酶（chitosanase）又稱殼聚糖-N-乙酰-氨基葡糖苷水解酶，專一性水解殼聚糖中的β-1，4-糖苷鍵，是制備殼寡糖理想的酶制劑［5-6］。除制備殼寡糖外殼聚糖酶還具有其他用途，如在農(nóng)業(yè)上可作為生物防治劑以及在生物技術(shù)中可用于原生質(zhì)分離、細(xì)胞化學(xué)定位和生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白等［7］。

殼聚糖酶在細(xì)菌、放線菌、真菌及病毒等微生物中均有存在，針對(duì)以上微生物產(chǎn)殼聚糖酶的應(yīng)用研究較為廣泛，主要集中在菌株篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化及工程菌構(gòu)建等多個(gè)方面，并取得了一定的成果［8-10］。2012年王艷君等［11］從福建潮間帶泥樣中篩選到1 株青霉菌，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件殼聚糖酶活力達(dá)到18 U/mL，同年Sinha等［12］分離到1株鏈霉菌，利用殼聚糖無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基在32 ℃條件下培養(yǎng)3 d，殼聚糖酶活力達(dá)到6 U/mL。2015年閻賀靜等［13］研究了碳源對(duì)煙曲霉WHSW-01菌株誘導(dǎo)產(chǎn)生殼聚糖酶活力的影響，最終酶活力達(dá)到6.78 U/mL，較優(yōu)化前提高了83.24%。2000年Rivas等［14］克隆Bacillus subtilis 168中殼聚糖酶基因又在該菌中高效表達(dá)，酶的比活力達(dá)到56.9 U/mg。2015年Sun Yuying等［15］克隆微小桿菌OU01殼聚糖酶基因，構(gòu)建pCT7-CHISP6H載體，在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)，殼聚糖酶活力達(dá)到67.56 U/mL。但由于產(chǎn)酶菌株產(chǎn)酶量及酶活性普遍較低，難以規(guī)?；a(chǎn)和廣泛應(yīng)用。因此繼續(xù)篩選產(chǎn)酶量高的其他微生物來(lái)源的殼聚糖酶，得到具工業(yè)化潛在應(yīng)用價(jià)值的新酶源，是充分發(fā)揮殼聚糖酶功能和殼寡糖工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)從煙臺(tái)海岸帶附近沙質(zhì)土壤中分離出1 株產(chǎn)殼聚糖酶活性較高的菌株，對(duì)其進(jìn)行種屬鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化，為工業(yè)化生產(chǎn)殼聚糖酶及酶法制備殼寡糖提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

分離樣品：煙臺(tái)海岸帶沙質(zhì)土壤。

細(xì)菌微量生化鑒定管 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒、Taq DNA聚合酶 生工生物工程（上海）股份有限公司；所用試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2培養(yǎng)基

斜面保藏培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉5、蛋白胨10、NaCl 5、瓊脂20，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基（g/L）：膠體殼聚糖10.0、NH4Cl 5.0、MgSO40.5、KH2PO42、酵母浸粉1、瓊脂20，pH 6.5，121 ℃滅菌20 min。

液體種子培養(yǎng)基（g/L）：膠體殼聚糖10、酵母浸粉5、MgSO40.5、NaCl 2.5、KH2PO42，pH 6.5，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：膠體殼聚糖20、酵母浸粉10、MgSO40.5、NaCl 2.5、KH2PO42、CaCl20.1，pH 6.5，121 ℃滅菌20 min。

1.3儀器與設(shè)備

SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；T100 PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司；ZWY-111G恒溫振蕩搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-75KB高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-16B高速離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；BGZ-5自控發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備公司。

1.4方法

1.4.1菌株篩選

將土樣用無(wú)菌水稀釋后，涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑選有明顯透明圈的菌落，劃線分離純化，將劃線后長(zhǎng)出的單菌落接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)酶復(fù)篩，30 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)60 h，離心后取發(fā)酵上清液測(cè)定酶活力，將酶活力高的菌株保存并鑒定。

1.4.2菌株鑒定

1.4.2.1菌株形態(tài)及生理生化鑒定

肉眼觀察細(xì)菌在分離培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、顏色等；經(jīng)過革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照。參照《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［16］和文獻(xiàn)［17］中的生理生化鑒定指標(biāo)，對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行V.P.實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、耐鹽性實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、淀粉水解和明膠液化等生理生化指標(biāo)測(cè)定。

1.4.2.2分子生物學(xué)鑒定

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，并以此為模板采用16S rDNA基因的通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；93 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 10 s，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min［17］。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定后，交由北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank上利用BLAST程序進(jìn)行相似性比對(duì)，運(yùn)用MEGA 5.0的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.3發(fā)酵方法

1.4.3.1種子培養(yǎng)

取甘油管保藏菌種劃線至LB斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h，保存至4 ℃冰箱備用；挑取單菌落接種至液體種子培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，即為種子液。

1.4.3.2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

按5%接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，500 mL三角瓶裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)60 h。

1.4.3.3發(fā)酵罐培養(yǎng)

按5%接種量將種子液接入裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L自控發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn)速600 r/min，通氣量2 L/min，溫度30 ℃。

1.4.4產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.4.4.1不同碳源對(duì)菌株amyP216產(chǎn)殼聚糖酶的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基其余組分和培養(yǎng)條件保持不變的情況下，分別添加20 g/L的膠體殼聚糖、淀粉、蔗糖、羧甲基纖維素、葡萄糖及膠體幾丁質(zhì)作為發(fā)酵產(chǎn)酶的碳源，30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)60 h，檢測(cè)殼聚糖酶活力，確定最佳碳源。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.4.4.2不同氮源對(duì)菌株amyP216產(chǎn)殼聚糖酶的影響

分別添加10 g/L的酵母浸粉、蛋白胨、玉米漿、NaNO3、NH4Cl及尿素作為發(fā)酵的氮源，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)60 h，檢測(cè)殼聚糖酶活力，確定最佳氮源。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.4.4.3表面活性劑對(duì)菌株amyP216產(chǎn)殼聚糖酶的影響

以最適碳氮源為基礎(chǔ)，分別添加1 g/L的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、吐溫-60、吐溫-80、司盤-80、曲拉通X-100表面活性劑，以不加表面活性劑的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照組，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)60 h，檢測(cè)殼聚糖酶活力，確定最佳表面活性劑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.4.4.4起始pH值對(duì)菌株amyP216產(chǎn)殼聚糖酶的影響

在其他培養(yǎng)條件一致的情況下，將培養(yǎng)基的起始pH值分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，接種后于30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)60 h，檢測(cè)殼聚糖酶活力，確定最適pH值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.4.4.5發(fā)酵溫度對(duì)菌株amyP216產(chǎn)殼聚糖酶的影響

在其他培養(yǎng)條件一致的條件下，分別在26、28、30、33、35、37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)60 h，檢測(cè)殼聚糖酶活力，確定最適發(fā)酵溫度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.4.4.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以膠體殼聚糖添加量、酵母浸粉添加量、吐溫-80添加量、起始pH值和發(fā)酵溫度為變量，以殼聚糖酶活力為指標(biāo)，進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件。

1.4.5指標(biāo)測(cè)定

1.4.5.1殼聚糖酶活力測(cè)定

發(fā)酵液離心取上清液（必要時(shí)作適當(dāng)稀釋）0.1 mL加入0.02 mol/L pH 5.6 的HAc-NaAc緩沖液1 mL，pH 5.6，10 g/L粉末殼聚糖的HAc溶液0.9 mL，50 ℃水浴15 min后加3，5-二硝基水楊酸試劑1.5 mL終止反應(yīng)，沸水浴5 min顯色，冷卻后定容至25 mL，離心，取上清液測(cè)520 nm波長(zhǎng)處的吸光度。等量煮沸滅活的發(fā)酵液作為空白對(duì)照。并繪制氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算反應(yīng)液中的還原糖含量，換算殼聚糖酶的酶活力。酶活力單位定義［18］：每毫升酶液每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.4.5.2菌體生物量和溶氧（dissolved oxygen，DO）測(cè)定

發(fā)酵液取樣10 mL，10 000 r/min離心10 min，取沉淀菌體105 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱量菌體干質(zhì)量，即為菌體生物量。

DO由發(fā)酵罐溶氧電極測(cè)定，可在發(fā)酵罐顯示屏直接讀出。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選

表1　產(chǎn)殼聚糖酶菌株水解圈直徑和菌落直徑的比值Table1　D/d （ratio of hydrolysis zone diameter to colony diameter）values of the chitosanase-producing strains

由表1可知，利用殼聚糖酶篩選培養(yǎng)基，從煙臺(tái)海岸帶沙質(zhì)土壤中分離到5 株水解圈較大的菌株，通過分離純化并進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)菌株amyP216的產(chǎn)殼聚糖酶能力較強(qiáng)，初始酶活力達(dá)到36.20 U/mL，且產(chǎn)酶穩(wěn)定，以此菌為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的菌株。

2.2菌株amyP216鑒定

2.2.1菌落形態(tài)及生理生化指標(biāo)鑒定

菌株amyP216在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h菌落呈乳白色、近圓形、菌落中央凸起、不透明、有褶皺、無(wú)光澤、邊緣不規(guī)則、易挑取，菌落直徑3～4 mm左右（圖1a）；通過顯微鏡觀察，桿狀、單個(gè)不成鏈、革蘭氏陽(yáng)性，培養(yǎng)48 h后觀察芽孢著生在菌體中間或側(cè)端位置，不膨大或個(gè)別細(xì)胞輕微膨大，橢圓形或柱形（圖1b）。

圖1　菌株amyP216菌落形態(tài)（a）和革蘭氏染色結(jié)果（b）（×1 000）Fig.1　Colony morphological characteristics （a） and gram staining （b）of strain amyP216 （× 1 000）

表2　菌株amyP216的生理生化特征Table2　Physiological and biochemical characteristics of strain amyP216

菌株amyP216進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，甲基紅實(shí)驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)呈陰性，不能同化利用山梨醇和甘露醇，在70 g/L NaCl的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，其他實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，初步將菌株amyP216鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

2.2.2菌株分子生物學(xué)鑒定

圖2　基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2　Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of selected strains

菌株amyP216經(jīng)DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序獲得的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度為1 466 bp，將其序列信息提交到GenBank，獲得登錄號(hào)KF496886，利用BLAST程序?qū)⑺没蛐蛄信cGenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行比對(duì)，選取與其相似度較高且已定名的菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）。相似度比較分析結(jié)果表明菌株amyP216與莫哈韋芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）的同源關(guān)系最近，相似度高達(dá)99%以上。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果，確定amyP216菌株為莫哈韋芽孢桿菌。保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為：CGMCC No. 7187。

2.3產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究

2.3.1碳源對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵的影響

碳源是供給微生物生命活動(dòng)所需能量、構(gòu)成菌體細(xì)胞以及合成代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)。添加不同碳源進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3。膠體殼聚糖作碳源最有利于產(chǎn)酶，殼聚糖酶活力達(dá)到40.20 U/mL，遠(yuǎn)高于其他碳源的發(fā)酵效果，說(shuō)明菌株amyP216產(chǎn)生的殼聚糖酶是誘導(dǎo)酶，在底物殼聚糖的誘導(dǎo)作用下方可大量產(chǎn)生，這和文獻(xiàn)［12-13，18］的報(bào)道也是一致的。蔗糖和葡萄糖雖然有利于菌體生長(zhǎng)（數(shù)據(jù)未顯示）卻不利于產(chǎn)酶，膠體幾丁質(zhì)基本無(wú)法被菌體同化利用，故產(chǎn)生的殼聚糖酶活力最低。因此選擇膠體殼聚糖為最佳產(chǎn)酶碳源。

圖3　碳源對(duì)菌株amyP216產(chǎn)殼聚糖酶的影響Fig.3　Effect of different carbon sources on chitosanase production by amyP216

圖4　氮源對(duì)菌株amyP216產(chǎn)殼聚糖酶的影響Fig.4　Effect of different nitrogen sources on chitosanase production by amyP216

2.3.2氮源對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵的影響如圖4所示，菌株利用不同氮源產(chǎn)殼聚糖酶效果有較大不同，其中以酵母浸粉作為氮源時(shí)酶活力最高，達(dá)到43.10U/mL，其他依次分別為NH4Cl、玉米漿、蛋白胨、尿素及NaNO3，總體來(lái)看，有機(jī)氮源的產(chǎn)酶效果略優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，但無(wú)機(jī)氮源中的銨鹽對(duì)殼聚糖酶合成也是有利的。根據(jù)發(fā)酵結(jié)果最終確定最佳產(chǎn)酶氮源為酵母浸粉。

2.3.3表面活性劑對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵的影響

圖5　不同表面活性劑對(duì)菌株amyP216發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的影響Fig.5　Effect of different surfactants on chitosanase production by amyP216

在優(yōu)化培養(yǎng)基碳氮源的基礎(chǔ)上，添加不同表面活性劑進(jìn)行產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)添加吐溫類表面活性劑及曲拉通 X-100對(duì)產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，其中吐溫-80的作用最為顯著，殼聚糖酶活力最高達(dá)到66.40 U/mL，添加司盤-80和SDS則會(huì)抑制殼聚糖酶的合成，尤以SDS作用強(qiáng)烈，殼聚糖酶活力遠(yuǎn)低于對(duì)照組。

2.3.4起始pH值對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵的影響

圖6　發(fā)酵起始pH值對(duì)菌株amyP216產(chǎn)殼聚糖酶的影響Fig.6　Effect of initial pH on chitosanase production by amyP216

將發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)節(jié)不同pH值，考察對(duì)殼聚糖酶產(chǎn)生的影響。由圖6可知，培養(yǎng)基起始pH值在5.5～6.5范圍內(nèi)最有利于殼聚糖酶的合成，尤以pH值為6.0時(shí)殼聚糖酶活力最高，達(dá)到76.30 U/mL。低于或高于此范圍均不利于酶的合成，當(dāng)pH值為5.0和7.5時(shí)，相應(yīng)的殼聚糖酶活力分別僅為最高酶活力時(shí)的56.6%和45.7%。

2.3.5發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵的影響

由圖7可知，不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株amyP216產(chǎn)殼聚糖酶影響較為顯著。發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力最高，為75.10 U/mL，降低或升高溫度酶活力均明顯下降，當(dāng)發(fā)酵溫度低至26 ℃時(shí)，殼聚糖酶活力僅為最高酶活力的68%，溫度升高到37 ℃時(shí)，殼聚糖酶活力尚不足最高酶活力的50%。

圖7　發(fā)酵溫度對(duì)菌株amyP216產(chǎn)殼聚糖酶的影響Fig.7　Effect of temperature on chitosanase production by amyP216

2.3.6正交試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以膠體殼聚糖添加量、酵母浸粉添加量、吐溫-80添加量、起始pH值、發(fā)酵溫度為因素，設(shè)計(jì)五因素四水平正交試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，極差R值大小順序?yàn)椋篟D＞RA＞RE＞RC＞RB，說(shuō)明起始pH值對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶活力影響最大，其次是膠體殼聚糖添加量、發(fā)酵溫度、吐溫-80添加量和酵母浸粉添加量。K值分析結(jié)果顯示，5 個(gè)因素的最優(yōu)組合為A3B4C2D3E3，即膠體殼聚糖添加量20 g/L、酵母浸粉添加量12.5 g/L、吐溫-80添加量 1.0 g/L、起始pH 6.0、發(fā)酵溫度30 ℃。依據(jù)此組合進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終酶活力為75.60 U/mL，高于正交試驗(yàn)中所有的組合，說(shuō)明該組合確實(shí)為最佳發(fā)酵條件。

表3　產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化方案及結(jié)果Table3　Orthogonal array design with experimental results of chitosanase activity for the optimization of fermentation conditions

2.4產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵過程曲線

圖8　菌株amyP216發(fā)酵過程中菌體生物量和殼聚糖酶活力曲線Fig.8　Growth curves of strain amyP216 showing biomass yield and chitosanase activity

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，用5 L罐進(jìn)行分批發(fā)酵，控制溫度為30 ℃，流加NaOH控制pH值在6.0，結(jié)果如圖8所示。菌體在10 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，30 h后生長(zhǎng)速率減慢，約在35 h進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，菌體呼吸強(qiáng)度減弱，培養(yǎng)系統(tǒng)DO逐步回升，菌體生物量在40 h達(dá)到最高值9.68 g/L；殼聚糖酶伴隨菌體生長(zhǎng)開始合成，在菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后仍可繼續(xù)合成一段時(shí)間，屬于延續(xù)合成型酶，在45 h殼聚糖酶活力達(dá)到最高值80.60 U/mL，比搖瓶發(fā)酵酶活力達(dá)到峰值時(shí)間提前（搖瓶發(fā)酵酶活力達(dá)到峰值大約在60 h左右），隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，菌體老化、酶活力下降，應(yīng)及時(shí)終止發(fā)酵。

3　結(jié) 論

莫哈韋芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌近緣菌種，多具有產(chǎn)生抗真菌活性肽的能力，在農(nóng)業(yè)生物防治方面具有較好的應(yīng)用前景，已成為近年來(lái)研究較為熱點(diǎn)的菌屬［19-20］。本研究自煙臺(tái)海岸帶沙質(zhì)土壤中分離到1株高產(chǎn)殼聚糖酶細(xì)菌，經(jīng)生理生化及16S rDNA鑒定為莫哈韋芽孢桿菌，目前國(guó)內(nèi)外尚鮮見關(guān)于莫哈韋芽孢桿菌產(chǎn)殼聚糖酶的相關(guān)報(bào)道。

通過單因素試驗(yàn)確定了菌株amyP216產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基的合適碳、氮源和表面活性劑，同時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度和pH值對(duì)殼聚糖酶的合成有較大影響；通過正交試驗(yàn)確定了最佳發(fā)酵條件。采用最優(yōu)的發(fā)酵條件在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行分批發(fā)酵，酶活力最高可達(dá)80.60 U/mL，產(chǎn)酶性能較好，且在發(fā)酵第1天就檢測(cè)到殼聚糖酶活性，45 h達(dá)到產(chǎn)酶高峰，和以往報(bào)道產(chǎn)酶菌株［21-24］相比，產(chǎn)酶效率更高，發(fā)酵周期更短。后續(xù)研究將在此優(yōu)化基礎(chǔ)上，采用誘變育種及分子生物學(xué)等方法對(duì)產(chǎn)酶菌株進(jìn)行改造，并運(yùn)用發(fā)酵調(diào)控技術(shù)和補(bǔ)料手段，進(jìn)一步提高殼聚糖酶的活性。

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Isolation， Identification of Bacillus mojavensis amyP216 and Optimization of Its Fermentation Conditions for Enhanced Chitosanase Production

FENG Zhibin1， XUE Yu1， CHEN Guozhong1， ZHANG Juan2， LUO Le1， CHENG Shiwei1
（1. College of Life Science， Ludong University， Yantai 264025， China；2. College of Agriculture， Ludong University， Yantai 264025， China）

Bacterial strains were isolated from coastal sandy soil collected in Yantai， Shandong province， and were initially screened to obtain 5 chitosanase-producing strains by transparent circle method. Further secondary screening provided a strain producing the highest chitosanase activity named amyP216. The strain amyP216 was identifi ed as Bacillus mojavensis based on morphological， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis. The fermentation conditions of amyP216 for chitosanase production were optimized by one-factor-at-a-time and orthogonal array designs. The results showed that the maximum chitosanase activity of 80.60 U/mL， which was increased by 2.2 folds as compared to that before optimization （36.20 U/mL）， was obtained when the fermentation was carried out at 30 ℃ for 45 h in a 5-L auto-controlled fermentor using optimized culture medium containing 20 g/L colloid chitosan， 12.5 g/L yeast extract powder and 1.0 g/L Tween-80 at initial pH 6.0. Therefore， the strain amyP216 has potential application in the industrial production of chitosanase.

Bacillus mojavensis； chitosanase； chitosan oligosaccharide； isolation and identification； optimization of fermentation conditions

10.7506/spkx1002-6630-201619029

TS264.2

A

1002-6630（2016）19-0171-06

馮志彬， 薛鈺， 陳國(guó)忠， 等. 1 株產(chǎn)殼聚糖酶細(xì)菌的分離、鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 171-176.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619029. http：//www.spkx.net.cn

FENG Zhibin， XUE Yu， CHEN Guozhong， et al. Isolation， identification of Bacillus mojavensis amyP216 and optimization of its fermentation conditions for enhanced chitosanase production［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 171-176. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619029. http：//www.spkx.net.cn

2015-10-26

山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（魯財(cái)指2014-38）

馮志彬（1977—），男，講師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵與酶催化。E-mail：fengzhibin257@163.com