吳慧昊，?！′h，陳珊珊，鐘　琦，肖俊川

（1.西北民族大學實驗中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；3.四川農(nóng)業(yè)大學生命科學與工程學院，四川 雅安 625014）

高效降亞硝酸鹽乳酸菌的馴化復篩及菌株鑒定

吳慧昊1，牛鋒2，陳珊珊3，鐘琦2，肖俊川2

（1.西北民族大學實驗中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；3.四川農(nóng)業(yè)大學生命科學與工程學院，四川 雅安 625014）

目的：篩選出高效降亞硝酸鹽乳酸菌，為今后益生乳酸菌的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。方法：從地方特有食品及動物腸道中分離純化出13 株乳酸菌，采用鹽酸萘乙二胺法對13 株乳酸菌的體外降亞硝酸鹽能力進行測定，并對降亞硝酸鹽效果最強菌株進行馴化培養(yǎng)和抑菌實驗，通過生理生化及16S rDNA法對所分離的降亞硝酸鹽能力最強菌株進行鑒定。結(jié)果：獲得1 株編號為JS3的乳酸菌，該菌對亞硝酸鹽降解率為83.39%，經(jīng)過馴化復篩及培養(yǎng)條件優(yōu)化得到：培養(yǎng)基中蛋白胨添加量15 g/L、接菌量5%、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時間48 h，其降解率達到93.47%，同時菌株對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌還具有抑制性能。經(jīng)鑒定菌株為玉米乳桿菌（Lactobacillus zeae），將其命名為L. zeaeJS3。結(jié)論：菌株JS3具有高效降解亞硝酸鹽能力，能夠成為今后降解亞硝酸鹽微生態(tài)活性菌的優(yōu)良菌種。

降亞硝酸鹽；乳酸菌；馴化；抑菌；鑒定

亞硝酸鹽是一種具有強氧化作用的食品添加劑，廣泛應用于食品工業(yè)中，例如腌肉、泡菜、火腿、酸菜、咸魚等中均含有亞硝酸鹽［1-2］。但亞硝酸鹽食用過量就會對人體造成一定的危害，一般人體攝入0.3～0.5 g的亞硝酸鹽可引起中毒，超過3 g則可致死［3-4］。亞硝酸鹽是食品添加劑中急性毒性最強的物質(zhì)之一。其原因一方面是大劑量的亞硝酸鹽進入人體內(nèi)會造成中毒，亞硝酸鹽進入血液后與人體中的血紅蛋白結(jié)合，使正常的血紅蛋白變形，失去攜氧能力，導致人體組織缺氧，還會對血管產(chǎn)生擴張作用，嚴重者出現(xiàn)意識喪失、昏迷、呼吸衰竭，甚至死亡［5-8］。另一方面，部分亞硝酸鹽在一定條件下會轉(zhuǎn)化為亞硝胺，而亞硝胺是一種致癌物質(zhì)，并能通過胎盤和乳汁引發(fā)后代腫瘤。同時，亞硝胺還有致畸和致突變作用。人群中流行病學調(diào)查表明，人類某些癌癥，如胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和膀胱癌等可能與亞硝胺有關(guān)［9-11］。

亞硝酸鹽和硝酸鹽廣泛存在于土壤、水域及植物中，目前廣泛采用的含氮農(nóng)藥和化學氮肥及含氮工業(yè)廢水、廢渣對環(huán)境土壤和水造成污染，使其中亞硝酸鹽含量不斷增加，而土壤是水體、植物性食品亞硝酸鹽的主要來源。亞硝酸鹽殘留過高對人有極大的危害，世界上因為亞硝酸鹽超標而引發(fā)的衛(wèi)生問題、安全事故時有發(fā)生。因此，世界上許多國家呼吁嚴格控制亞硝酸鹽的使用量，并積極地研究利用化學、生物的方法降低食品中亞硝酸鹽含量［12］。

乳酸菌是很多自然發(fā)酵傳統(tǒng)食品微生物區(qū)系的重要成員，是研究最深入的安全型微生物之一。乳酸菌廣泛存在于人體腸道中，具有幫助消化、抗腫瘤、預防癌癥、降血脂、降血壓、增強免疫力和抵抗力等保健和醫(yī)療作用［13-15］。在食品生產(chǎn)中，乳酸菌還具有改善食品品質(zhì)的功效，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，食品風味得以改善、食品安全和營養(yǎng)價值得以提高［16-18］。目前，大量研究表明乳酸菌具有降解亞硝酸鹽的能力，但是存在菌種及菌株間的差異［19-20］。本實驗研究從各種樣品中分離出乳酸菌菌株，并將初篩得到降亞硝酸鹽能力高的乳酸菌進行進一步的馴化培養(yǎng)，使其降解率得到提升，最終獲得強降解亞硝酸鹽的乳酸菌株，為乳酸菌在今后的食品、環(huán)境保護以及飼料生產(chǎn)方面提供菌種資源及參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌種與試劑

實驗所用的13 株乳酸菌菌種均分離自甘肅特有食物及動物腸道，并于低溫冰箱厭氧保存。

對氨基苯磺酸溶液、鹽酸萘乙二胺溶液、亞硝酸鈉標準溶液的配制參照文獻［21］。

1.2儀器與設(shè)備

MLS-3750 全自動高壓滅菌器 日本Sanyo公司；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；GL-21M 高速冷凍離心機 賽特湘儀離心機儀器有限公；PCR擴增儀 日本TaKaRa公司；核酸電泳儀 北京百晶生物科技有限責任公司；蛋白質(zhì)電泳儀 上海天能科技有限公司；電泳成像裝置 安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)（上海）有限公司；DNA測序儀 吉泰生物科技有限責任公司。

1.3培養(yǎng)基

乳酸細菌（MRS）液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10、牛肉膏10、酵母粉5、葡萄糖20、無水乙酸鈉5、檸檬酸二胺2、磷酸氫二鉀2、硫酸鎂0.58、硫酸錳0.25，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 L，pH 6.6～6.8，1×105Pa滅菌20 min。固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入17.5 g/L瓊脂。

1.4方法

1.4.1亞硝酸鹽含量的測定

采用鹽酸萘乙二胺法［21］進行標準曲線的繪制及亞硝酸鹽含量的測定。經(jīng)測定，標準曲線回歸方程為y=0.608 2x+0.008 97（R2=0.992 3），其中y為吸光度值；x為亞硝酸鹽含量/（mg/mL）。亞硝酸鹽含量在0～2 mg/mL NaNO2的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4.2菌株初篩

1.4.3菌株馴化與復篩

將初篩得到的高效降解菌株，按5%的接菌量接種到100 mL含1 000 μg/mL NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后，吸取5 mL至質(zhì)量濃度為2 000 μg/mL NaNO2溶液中，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)72 h。菌株在培養(yǎng)基中馴化72 h后，取5%菌液繼續(xù)接入含2 000 μg/mL NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代馴化培養(yǎng)30 d。

將馴化菌液離心得到菌體，與生理鹽水混合形成菌懸液。將此菌懸液按5%的接菌量接種到100 mL含400 μg/mL NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，離心（8 000 r/min）取上清液，測定其A538nm值，同時做平行與對照實驗。

1.4.4抑菌性能測定

將50 mL固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻到45 ℃與1 mL指示菌（枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌）混合均勻后倒平板，待平板凝固后放上滅菌的牛津杯。調(diào)整菌懸液濃度108CFU/mL，用移液槍分別量取100 μL的菌培養(yǎng)液，加入牛津杯中，蓋上皿蓋，將平皿置于4 ℃冰箱擴散，然后于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察小孔周圍抑菌圈直徑，每個指示菌做兩個重復，測抑菌圈直徑，求平均值。

1.4.5菌株最適降解條件選擇

1.4.5.1菌株單因素試驗

以含400 μg/mL NaNO2的MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過改變蛋白胨添加量（10、15、20 g/L）、接菌量（1%、2%、5%）、培養(yǎng)時間（24、48、72 h）、培養(yǎng)溫度（30、35、40 ℃）等因素，來測定各因素對菌株降解亞硝酸鹽含量的影響。

1.4.5.2正交試驗設(shè)計

這樹有毒 澳大利亞生長著一種名為“金皮樹”的毒樹。這種毒樹的葉子上布滿了含有劇毒化學物質(zhì)的毛刺，一旦有人不小心碰到此樹，毛刺就會劇烈刺激皮膚中的神經(jīng)纖維，引發(fā)嚴重的瘙癢和腫脹，令人痛不欲生。

以蛋白胨添加量、接菌量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間為試驗因素，采用四因素三水平正交試驗對菌株降解亞硝酸鹽的最適生長條件進行選擇。

1.4.6亞硝酸鹽降解菌株鑒定

采用生理生化及16S rDNA法對所分離的降亞硝酸鹽最強菌株進行鑒定。生理生化特性鑒定：對分離的菌種分別進行過氧化氫酶、氧化還原酶、明膠液化、6.5% NaCl、15 ℃生長實驗和糖發(fā)酵產(chǎn)酸實驗。運動性檢查：采用半固體培養(yǎng)基穿刺法。

16S rDNA擴增及序列測定方法參照文獻［22］，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物測序由寶生物工程（大連）有限公司完成。

測序完成提交菌株JS3的16S rDNA序列在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中進行比對，選取與之相似性最高的10 株菌的16S rDNA序列，進行Clustal X比對，MEGA軟件分析，采用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 1 000 次進行穩(wěn)定性驗證。

2　結(jié)果與分析

2.1降亞硝酸鹽菌株的篩選及馴化

2.1.1降亞硝酸鹽乳酸菌初篩結(jié)果

表1　各乳酸菌菌株48 h內(nèi)對NaNO2的降解量Table1　The degradation percentage of NaNO2by LAB strains in 48 h

由表1可知，在13 株乳酸菌中，對初始質(zhì)量濃度為400 μg/mL的亞硝酸鹽降解率在80%～90%之間的菌株有2 株，降解率在50%以下的有4 株。這些菌株經(jīng)過48 h培養(yǎng)降解率最高的為JS3，其降解率為83.39%，說明JS3與其他菌株在相同的條件下更能適應高質(zhì)量濃度的亞硝酸鹽溶液，表現(xiàn)出較強的降解優(yōu)勢。而降解率最低的是菌株ZOA2，其降解率僅為20.01%。由此可見，不同的乳酸菌菌株均具有一定的亞硝酸鹽降解能力，但是降解能力大小不同。

2.1.2降解亞硝酸鹽乳酸菌的馴化復篩

從表1初篩結(jié)果中選出3 株降解率高的菌株，進行高質(zhì)量濃度亞硝酸鹽的馴化復篩，經(jīng)連續(xù)的馴化培養(yǎng)后，3 株菌降亞硝酸鹽能力見表2。

表2　菌株馴化后對NaNO2的降解能力Table2　The NaNO2degradation capacity of three selected strains

由表2可知，將菌株培養(yǎng)在含2 000 μg/mL NaNO2的MRS培養(yǎng)基中，JS3、JS4、ZL010這3 株菌的降亞硝酸鹽能力較初篩時都有了明顯提升，說明這3 株菌在亞硝酸鹽質(zhì)量濃度從400～2 000 μg/mL的增加過程中表現(xiàn)出了非常好的生長態(tài)勢，具有了一定的耐亞硝酸鹽能力，主要表現(xiàn)為當亞硝酸鹽質(zhì)量濃度升高時，其降解率亦增高，在此過程中株菌JS3的優(yōu)勢更為突出，表現(xiàn)出最高的降亞硝酸鹽的能力，其降解率為89.24%。

2.2抑菌效果

表3　各乳酸菌對指示菌的抑菌圈平均直徑Table3　Inhibition zone diameters of strains JS3 and JS4

圖1　菌株JS3對金黃色葡萄球菌（A）和枯草芽孢桿菌（B）的抑制效果Fig.1　Inhibitory effect of JS3 on Staphylococcus aureus （A） and Bacillus subtilis （B）

由表3、圖1可知，JS3和 JS4對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制效果，JS3、JS4對于枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑相同，均為11 mm，而對于金黃色葡萄球菌的抑制效果，JS3的抑菌圈直徑為17 mm高于JS4，因此后續(xù)實驗選取JS3菌株進行實驗。

2.3菌株最適降解條件選擇

2.3.1單因素試驗結(jié)果

對菌株JS3采用單因素試驗研究其對NaNO2的降解效果。李春等［23］研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中蛋白類物質(zhì)也具有降解亞硝酸鹽的能力，因此選取蛋白胨添加量作為一個重要的試驗因素，由圖2A可知，蛋白胨添加量對NaNO2的降解效果有一定影響，蛋白胨添加量越高，降解率越高。由圖2B可知，高溫不利于菌株對NaNO2的降解，這主要是因為高溫抑制菌株JS3的生長，從而降低菌株對NaNO2的降解量。菌株的接菌量為5%時，NaNO2的降解率最高，主要是因為初始菌的數(shù)量增多，后續(xù)擴增繁殖中菌數(shù)增多，從而對NaNO2的降解率提高（圖2C）。由圖2D可知，培養(yǎng)時間為48 h時，菌株對NaNO2的降解率最高，時間過短過長都不利于NaNO2的降解，時間過短菌株生長周期不足，時間過長，菌體大量衰老死亡，因此使其對NaNO2的降解率降低。

圖2　蛋白胨添加量（A）、培養(yǎng)溫度（B）、接菌量（C）和培養(yǎng)時間（D）對JS3降解 NaNO2的影響Fig.2　Effect of inoculum quantity on the degradation rate of NaNO2

2.3.2正交試驗結(jié)果

JS3菌株正交試驗結(jié)果見表4。不同因素對亞硝酸鹽的降解影響程度依次為培養(yǎng)時間＞蛋白胨添加量＞接菌量＞培養(yǎng)溫度。由K值可以看出，菌株降亞硝酸鹽的最優(yōu)條件為A2B3C2D3，在此條件下測得平均降解率為90.850%。低于試驗4組與6組，說明各因素間存在交互作用，綜上比較得出菌株JS3的最適降解條件為試驗6組，即：培養(yǎng)基中蛋白胨添加量15 g/L、接菌量5%、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時間48 h，其降解率達93.47%。

表4　菌株JS3對NaNO2降解條件優(yōu)化的正交試驗方案及結(jié)果Table4　Orthogonal array design with experimental results for the optimization of culture conditions for NaNO2degradation by strain JS3

2.4菌株鑒定

2.4.1菌株形態(tài)特征

經(jīng)分離純化的菌株JS3在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，菌落呈乳白色，表面光滑，隆起，菌落邊緣整齊，如圖3A所示。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌株為革蘭氏陽性菌，橢球形，細胞大小形態(tài)均一，單細胞大小為（0.9～1.2） ?m×（1.3～2.1） ?m，大部分成對存在，部分呈單個或短鏈狀存在，見圖3B。

圖3　菌株JS3的平板菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色（B）結(jié)果Fig.3　Colony of strain JS3 and its Gram staining on plates

2.4.2菌株生理生化鑒定結(jié)果

將菌株JS3活化后接種于MRS液體培養(yǎng)基中，經(jīng)24 h恒溫培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，菌株貼試管壁并沿試管壁向底部生長，MRS液體培養(yǎng)基表層無菌生長，由此說明該菌為兼性厭氧菌。菌株于半固體培養(yǎng)基穿刺后，僅在穿刺線上生長，且邊緣十分清晰，表明菌株無運動性。接觸酶和氧化酶反應均為陰性。不能利用尿素，不能產(chǎn)生H2S，生理生化鑒定結(jié)果見表5。

表5　菌株生理生化鑒定結(jié)果Table5　Physiological and biochemical characterization

2.4.3菌株JS3分子生物學鑒定

在培養(yǎng)基中挑取菌體，變性后離心取上清作模板，使用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（Code No.RR176）進行PCR擴增目的片段，結(jié)果見圖4。將上述擴增產(chǎn)物進行測序，獲得JS3菌株16S rDNA部分基因序列（1 467 bp），在GenBank數(shù)據(jù)庫中通過在線序列BLAST比對檢索，結(jié)果顯示JS3菌株的16S rDNA序列與Lactobacillus zeae的16S rDNA序列具有100%同源性。

圖4　菌株JS3的16S rDNA PCR擴增結(jié)果Fig.4　Electrophoresis of PCR amplification products of bacterial 16S rDNA from JS3

圖5　依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的菌株JS3與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5　Phylogenetic tree of strain JS3 and related strains based on 16S rDNA

使用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖5所示。系統(tǒng)發(fā)育樹上與菌株JS3的16S rDNA同源性較高的菌株均為乳桿菌屬（Lactobacillus），與Lactobacillus zeae RIA 482菌株在發(fā)育樹上聚為一簇，具有較近的進化距離。

因此，根據(jù)以上形態(tài)特點和生理生化特征，結(jié)合《伯杰氏細菌鑒定手冊》［24］和《乳酸細菌：基礎(chǔ)、技術(shù)和應用》［25］，將分離的菌株JS3鑒定為乳桿菌屬、玉米乳桿菌，將其命名為L. zeaeJS3。

3　結(jié) 論

從分離純化的13 株乳酸菌中篩選出1 株降亞硝酸鹽能力非常好的菌株JS3，經(jīng)過馴化復篩及培養(yǎng)條件優(yōu)化，JS3的亞硝酸鹽的降解率達到93.47%，其最佳降解條件為培養(yǎng)基中蛋白胨添加量15 g/L、接菌量5%、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時間48 h。通過生理生化和分子生物學鑒定，將菌株鑒定為乳桿菌屬、玉米乳桿菌，將其命名為L. zeaeJS3。

乳酸菌對亞硝酸鹽具有降解能力，這是因為乳酸菌生長時產(chǎn)生的大量乳酸，會使pH值急劇下降，低的pH值環(huán)境可以抑制亞硝酸鹽的形成，乳酸也會使生成的亞硝酸鹽進行化學降解，同時乳酸菌在亞硝酸鹽的誘導下產(chǎn)生了亞硝酸鹽還原酶，即乳酸菌本身具有還原作用［26］。蔬菜、腌肉中存在的一些大腸桿菌、金黃色葡萄球菌能使硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，而JS3具有抑制其生長的作用，從另一源頭截斷亞硝酸鹽的形成，進一步證明菌株JS3潛在的應用價值。

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Screening and Identification of Nitrite-Degrading Lactic Acid Bacteria

WU Huihao1， NIU Feng2， CHEN Shanshan3， ZHONG Qi2， XIAO Junchuan2
（1. Centres of Experimentation， Northwest University for Nationalities， Lanzhou 730030， China；2. College of Life Science and Engineering， Northwest University for Nationalities， Lanzhou 730030， China；3. College of Life Science and Engineering， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China）

Objective： To screen nitrite-degrading lactic acid bacteria （LAB）， and thus to lay a theoretical foundation for the future development of probiotic lactic acid bacteria. Methods： Totally 13 LAB strains were isolated and purified from unique local foods and animal intestines， and their nitrite-degrading abilities were evaluated by the naphthyl ethylenediamine dihydrochloride spectrophotometric method. Biochemical assays and 16S rDNA sequencing were used to identify the lactic acid bacteria with the highest nitrite-degrading capacity. Results： A nitrite-degrading strain， JS3， was obtained， which was found to be able to degrade 83.39% nitrite. The optimized culture conditions for enhanced nitrite degradation by the selected strain were determined as peptone concentration in medium of 15 g/L， inoculum quantity of 5%， and culture at 30 ℃ for 48 h， resulting in a degradation rate as high as 93.47%. The strain had obvious antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis. It was identified as Lactobacillus zeae and named L. zeae. JS3. Conclusion： The strain JS3 has efficient nitrite-degrading capacity， and it is potentially an excellent species for the degradation of nitrite in the future.

nitrite degradation； lactic acid bacteria； domestication； antibacterial； identification

10.7506/spkx1002-6630-201619027

Q93.331

A

1002-6630（2016）19-0160-06

吳慧昊， 牛鋒， 陳珊珊， 等. 高效降亞硝酸鹽乳酸菌的馴化復篩及菌株鑒定［J］. 食品科學， 2016， 37（19）： 160-165. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619027. http：//www.spkx.net.cn

WU Huihao， NIU Feng， CHEN Shanshan， et al. Screening and identification of nitrite-degrading lactic acid bacteria［J］. Food Science，2016， 37（19）： 160-165. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619027. http：//www.spkx.net.cn

2015-10-09

2014年度國家民委科研項目（14XBZ015）；甘肅省農(nóng)牧廳攻關(guān)項目（GNSW-2007-09）

吳慧昊（1985—），女，實驗師，碩士，主要從事食品微生物研究。E-mail：wuhuihao99@163.com