王建榮，劉丹妮，夏　雨，楊　玲，劉金山，唐　業(yè)，陳麗芝，黃佳樂，李陽源*

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東 珠海 519060）

密碼子優(yōu)化及透明顫菌血紅蛋白共表達(dá)提高耐熱脂肪酶在畢赤酵母的表達(dá)

王建榮，劉丹妮，夏雨，楊玲，劉金山，唐業(yè)，陳麗芝，黃佳樂，李陽源*

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東 珠海 519060）

根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性，通過在線軟件對Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tll）和透明顫菌血紅蛋白基因（vhb）進(jìn)行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后的脂肪酶基因（tll-opt）和透明顫菌血紅蛋白基因（vhb-opt）中堿基GC含量分別由原來的46%提高到49%和42%提高到51%，堿基A、T、C、G均勻分布，減少了AT和GC富集區(qū)，利于tll-opt和vhb-opt基因在畢赤酵母X33中的表達(dá)。將tll和tll-opt連接到表達(dá)載體pPICZαA并轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33中。搖瓶培養(yǎng)條件下，含有tll和tll-opt重組工程菌的最大酶活力分別為7 U/mL和16 U/mL。50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下，含有tll和tll-opt重組工程菌的最大酶活力分別為201 U/mL和430 U/mL。為了進(jìn)一步提高含tll-opt重組工程菌的表達(dá)酶活性，將vhb-opt轉(zhuǎn)入該重組工程菌得到工程菌VHb+（含有tll-opt和vhb-opt）。重組工程菌VHb+在搖瓶培養(yǎng)條件下最大酶活力為23 U/mL，分別是優(yōu)化后基因和原始基因最大表達(dá)酶活力的1.39 倍和3.28倍。重組工程菌VHb+在50 L發(fā)酵罐瓶培養(yǎng)條件下最大酶活力為610 U/mL，分別是優(yōu)化后基因和原始基因最大表達(dá)酶活力的1.41 倍和3.03 倍。

密碼子優(yōu)化；脂肪酶；透明顫菌血紅蛋白；高密度發(fā)酵

脂肪酶在油水界面上可催化天然底物油脂水解，在非水相體系中又可催化轉(zhuǎn)酯和酯合成等多種反應(yīng)，由于其特殊的酶學(xué)性質(zhì)使其廣泛地用于不同的工業(yè)領(lǐng)域［1-3］。隨著不同工業(yè)領(lǐng)域的發(fā)展，每個(gè)工業(yè)領(lǐng)域針對自身的特點(diǎn)對脂肪酶的需求也各不相同，其中脂肪酶的耐溫性是許多工業(yè)領(lǐng)域評價(jià)脂肪酶的一個(gè)重要指標(biāo)。迄今報(bào)道的脂肪酶大部分耐熱性較差，如來源于華根霉、米根霉、少根根霉、擴(kuò)展青霉和黑曲霉等微生物的脂肪酶在65 ℃水浴處理30 min后，剩余酶活力基本為零［4-8］。相對于上述微生物脂肪酶，嗜熱真菌Thermomyces lanuginosus分泌的脂肪酶均具有很好的耐熱性。研究表明Thermomyces lanuginosus分泌兩種耐熱脂肪酶分別命名為LN和LGY。相對于LGY，LN具有更好的耐熱性，在80 ℃和90 ℃分別水浴處理30 min和18 min后，剩余酶活力分別為52%和51%［9］。嗜熱真菌Thermomyces lanuginosus培養(yǎng)操作復(fù)雜并且產(chǎn)脂肪酶活力低，為了提高脂肪酶LN的產(chǎn)量，在之前的研究中將脂肪酶LN在畢赤酵母進(jìn)行異源表達(dá)［10］。

畢赤酵母作為一種成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有許多優(yōu)點(diǎn)：遺傳操作簡單、易于培養(yǎng)、具有完整的蛋白加工系統(tǒng)并且很少分泌自身內(nèi)源蛋白等［11-13］。為了進(jìn)一步提高異源蛋白在畢赤酵母的表達(dá)量，科研工作者發(fā)明了許多方法，如變表達(dá)載體的啟動(dòng)子及信號肽，提高基因在重組酵母的拷貝數(shù)，共表達(dá)輔助蛋白、密碼子優(yōu)化，優(yōu)化發(fā)酵條件等［14-17］。密碼子優(yōu)化能有效提高異源蛋白在畢赤酵母的表達(dá)量：編碼異源蛋白的基因中存在許多低頻密碼子，這些低頻密碼子大大降低了異源蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，通過優(yōu)化編碼異源蛋白基因的密碼子可提高其在畢赤酵母的表達(dá)水平［18-20］。共表達(dá)透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）也是一種有效提高異源蛋白在畢赤酵母表達(dá)量的方法。VHb可以提高細(xì)胞活性從而使菌體細(xì)胞生物量及酶活力得到提高［21-22］。

為了提高耐熱脂肪酶LN在畢赤酵母的表達(dá)，在本研究中結(jié)合了密碼子優(yōu)化和共表達(dá)VHb兩種方法，為耐熱脂肪酶LN在畢赤酵母的高效表達(dá)提供參考。

1　材料與方法

1.1試劑與培養(yǎng)基

博萊霉素（Zeocin） 美國Invitrogen公司；高保真Q5酶、T4 DNA連接酶 北京NEB公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI、克隆載體T-Vector pMD20 寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）純化試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；橄欖油 益海嘉里投資有限公司；引物由蘇州金維智公司合成；表達(dá)載體pPICZαA-tll、大腸桿菌top10 廣東省飼料添加劑生物工程技術(shù)研究開發(fā)中心；畢赤酵母X33以及表達(dá)載體pPICZαA 美國Invitrogen公司；蛋白測定試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

大腸桿菌用LB液體及LBZ固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。畢赤酵母轉(zhuǎn)化子用固體YPDZ、YPDG培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)化子篩選以及搖瓶培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基分別為BMGY和BMMY。酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)為BSM培養(yǎng)基。LB、LBZ、YPDZ、YPDG、BMMY、BMGY和BSM培養(yǎng)基分別參照Invitrogen公司的酵母指導(dǎo)手冊進(jìn)行配制。

1.2方法

1.2.1密碼子分析及優(yōu)化

通過在線軟件SignalP 4.0 server（http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）對Thermomyces lanuginosus脂肪酶進(jìn)行信號肽預(yù)測。針對畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，通過在線軟件Graphical Codon Usage Analyser（http://gcua.schoedl. de/）對不含信號肽的Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tll，GenBank登錄號EU004196）和透明顫菌血紅蛋白基因（vhb，GenBank登錄號AY278220）的密碼子進(jìn)行分析，找出低頻密碼子。根據(jù)找出的低頻密碼子通過軟件DNA2.0 software（http://www.dna20.com）對tll和vhb進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tll-opt）和透明顫菌血紅蛋白基因（vhb-opt）由蘇州金維智公司進(jìn)行合成。

1.2.2表達(dá)載體構(gòu)建

優(yōu)化后的Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tll-opt）用EcoRI和XbaI進(jìn)行酶切并和pPICZαA進(jìn)行連接，得到表達(dá)載體pPICZαA-tll-opt。將合成的透明顫菌血紅蛋白基因（vhb-opt）用EcoRI和NotI進(jìn)行酶切和pPIC3.5K進(jìn)行連接，得到表達(dá)載體pPIC3.5K-vhb-opt。

1.2.3密碼子優(yōu)化提高Thermomyces lanuginosus脂肪酶在畢赤酵母的表達(dá)

將表達(dá)載體pPICZαA-tll和pPICZαA-tll-opt線性化，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33。高酶活轉(zhuǎn)化子的篩選參照本實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道的方法并做一些改進(jìn)，將轉(zhuǎn)化子分別接入含有1.4 mL BMGY的24 孔板中，30 ℃培養(yǎng)36 h后，按1%的比例加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每24 h取樣進(jìn)行測定。脂肪酶活力測定以4-硝基苯基辛酸酯（p-nitrophenyl caprylate，pNPC）為底物，先加入100 μL pH 7.5的磷酸鹽緩沖液，然后分別加入10 μL底物和10 μL稀釋好的酶液，反應(yīng)5 min后加入100 μL 2%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液終止反應(yīng)，最后在405 nm波長處測定光密度（OD）值，根據(jù)OD405nm值計(jì)算酶活力?？瞻讓φ障燃?%的SDS溶液，其他反應(yīng)步驟相同。通過分析測定，篩選到4 個(gè)高酶活力轉(zhuǎn)化子，兩個(gè)含有tll-opt基因（命名為X33/tll-opt-1和X33/tll-opt-2），另外兩個(gè)含有tll基因（命名為X33/tll-1和X33/tll-2）。為了進(jìn)一步比較篩選出來的高酶活力轉(zhuǎn)化子，將培養(yǎng)條件擴(kuò)大到搖瓶培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)條件參照之前報(bào)道的方法進(jìn)行［23-24］。經(jīng)過篩選最終確定重組工程菌X33/tll-opt-2和X33/tll-1作為下一步實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株。

1.2.4透明顫菌血紅蛋白共表達(dá)

以1.2.3節(jié)方法篩選出來的高酶活轉(zhuǎn)化子X33/tll-opt-2為感受態(tài)，將pPIC3.5K-vhb-opt和pPIC3.5K表達(dá)載體線性化后轉(zhuǎn)入X33/tll-opt-2，轉(zhuǎn)化子均勻涂布于YPDG平板，參照方法1.2.3節(jié)對YPDG平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，得到兩株工程菌命名為VHb+（X33/tll-opt-2含有vhb-opt基因）和VHb-（不含有vhb-opt基因）。為了進(jìn)一步比較篩選出來的高酶活力轉(zhuǎn)化子，將重組工程菌VHb+、VHb-和X33/tll-opt-2在搖瓶條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。每24 h取樣測定菌體濕質(zhì)量、酶活力。

1.2.5重組酵母工程菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)

將重組工程菌X33/tll-opt-2、X33/tll-1、VHb+和VHb-在50 L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)。重組菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)參照廣東省生物技術(shù)工程中心基因發(fā)酵工程研究部之前報(bào)道的方法進(jìn)行。將單菌落的重組酵母工程菌接入含有50 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、250 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。再將過夜培養(yǎng)的重組酵母工程菌按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接入含有100 mL YPD培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃、250 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，至OD600nm值大于10。將二次過夜培養(yǎng)的重組酵母工程菌按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入含有20 L BSM培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐。重組酵母工程菌在50 L發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件為：溫度30 ℃、pH 5.0、攪拌速率500 r/min、空氣流量40 L/min。培養(yǎng)初期，以甘油作為碳源供菌體生長。當(dāng)菌體濕質(zhì)量達(dá)到一定的量，停止流加甘油，待甘油被菌體吸收完后（溶氧迅速上升）開始用甲醇誘導(dǎo)。甲醇的添加量根據(jù)溶氧進(jìn)行調(diào)整。培養(yǎng)過程中，每24 h取樣測定菌體濕質(zhì)量、酶活力、總蛋白含量。

1.2.6指標(biāo)測定

搖瓶和50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下，脂肪酶活力測定參照GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》進(jìn)行。細(xì)胞生物量、總蛋白含量和細(xì)胞活性的測定參照之前報(bào)道的方法進(jìn)行［21-22］。細(xì)胞生物量的測定如下：量取10 mL發(fā)酵液至50 mL離心管，高速離心20 min，倒掉上清液，稱質(zhì)量，根據(jù)前后質(zhì)量差計(jì)算細(xì)胞生物量?？偟鞍缀繀⒄誃radford蛋白測定試劑盒說明書進(jìn)行。以亞甲藍(lán)方法測定重組酵母細(xì)胞活性，每隔24 h取樣進(jìn)行細(xì)胞活性測定。

2　結(jié)果與分析

2.1tll和vhb密碼子分析及優(yōu)化

圖1　1 tlltll原始基因與優(yōu)化后的tlltll-optopt基因序列比較Fig.1　Sequence comparison between the original （tll） and the optimized （tll-opt） gene

圖2　2 vhbvhb原始基因與優(yōu)化后的vhbvhb-optopt基因序列比較Fig.2　Sequence comparison between the original （vhb） and the optimized （vhb-opt） gene

根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，通過在線軟件對tll和vhb基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在原始tll和vhb基因中存在多個(gè)低頻密碼子，如編碼Arg的CGA和CGT、編碼Gly的GGC、編碼Leu的CTC、編碼Ser的AGT以及編碼Pro的CCC。這些低頻密碼子影響tll和vhb在畢赤酵母的表達(dá)。根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性，通過密碼子優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)用高頻密碼子替換了這些低頻密碼子，如將編碼Arg的CGA和CGT替換為AGA、編碼Gly的GGC替換為GGT等。經(jīng)過優(yōu)化，tll基因的GC含量由原來55%降低到51%，而vhb基因則由42%提高到51%。堿基A、T、C和G均勻分布于優(yōu)化后的tll和vhb基因，減少了AT和GC富集區(qū)，利于tll和vhb基因在畢赤酵母的表達(dá)。通過對優(yōu)化后的tll-opt和vhb-opt基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：tll基因總共有202 個(gè)堿基進(jìn)行了優(yōu)化，vhb基因總共有58 個(gè)堿基進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的tll-opt和vhb-opt基因與原始基因的相似性分別為81%和88%（圖1和圖2）。

2.2密碼子優(yōu)化提高Thermomyces lanuginosus脂肪酶在畢赤酵母的表達(dá)

圖3　表達(dá)載體pPICZαAICZA-tlltll-optopt， pPICZαAICZA-tlltll線性化（A）和表達(dá)載體pPICZαAICZA-tlltll-optopt， pPIC3.5KC3.5K-vhbvhb-optopt酶切鑒定（B）BFig.3　Electrophoretogrom of linearized pPICZαA-tll-opt and pPICZαA-tll （A） and restriction enzyme digestion of pPICZαA-tll-opt and pPIC3.5K-vhb-opt （B）

優(yōu)化后的Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tllopt）用EcoRI和XbaI進(jìn)行酶切并和pPICZαA進(jìn)行連接，得到表達(dá)載體pPICZαA-tll-opt（圖3B）。分別將表達(dá)載體pPICZαA-tll-opt和pPICZαA-tll線性化（圖3A），轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33得到含有tll-opt基因和tll基因的重組轉(zhuǎn)化子。通過分析測定，篩選到4 個(gè)高酶活轉(zhuǎn)化子，兩個(gè)含有tll-opt基因（命名為X33/tll-opt-1和X33/tll-opt-2），另外兩個(gè)含有tll基因（命名為X33/tll-1和X33/tll-2）。為了進(jìn)一步比較這4 個(gè)轉(zhuǎn)化子的酶活力，分別在搖瓶培養(yǎng)條件下測定這4 個(gè)轉(zhuǎn)化子的酶活力及總蛋白質(zhì)含量。搖瓶培養(yǎng)96 h后，X33/tll-1、X33/tll-2、X33/tll-opt-1和X33/tll-opt-2的酶活力分別為6、7、15 U/mL和16 U/mL?？偟鞍踪|(zhì)含量分別為0.12、0.13、0.21 mg/mL和0.22 mg/mL。通過分析比較，選擇重組菌株X33/tll-2和X33/tll-opt-2做下一步實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株。

2.3VHb共表達(dá)提高Thermomyces lanuginosus脂肪酶在畢赤酵母的表達(dá)

將合成的透明顫菌血紅蛋白基因（vhb-opt）用EcoRI和NotI進(jìn)行酶切和pPIC3.5K進(jìn)行連接，得到表達(dá)載體pPIC3.5K-vhb-opt（圖3B）。以X33/tll-opt-2為宿主，將表達(dá)載體pPIC3.5K-vhb-opt和pPIC3.5K線性化轉(zhuǎn)入X33/tllopt-2。經(jīng)過篩選得到兩株高酶活轉(zhuǎn)化子分別命名為VHb+（X33/tll-opt-2含有vhb-opt基因）和VHb-（X33/tll-opt-2不含有vhb-opt基因）。將空白宿主酵母X33、重組工程菌X33/tll-opt-2以及VHb+和VHb-在搖瓶條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)96 h后X33、X33/tll-opt-2、VHb-和VHb+的酶活力分別為0、16、16.5 U/mL和23 U/mL；細(xì)胞生物量分別為28.5、28、29 g/L和38 g/L。由上述結(jié)果可知，VHb共表達(dá)可以提高重組工程菌的細(xì)胞生物量和脂肪酶酶活力，培養(yǎng)96 h后，VHb+的酶活力和細(xì)胞生物量分別是VHb-的1.39 倍和1.31 倍。

2.4重組酵母工程菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)

圖4　重組工程菌X33/tll-2和X33/tll opt-2 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)Fig.4　 Lipase activity and total protein content of X33/tll-2 and X33/tll-opt-2 during batch fermentation in 50 L bioreactor

重組工程菌株X33/tll-2和X33/tll-opt-2在50 L發(fā)酵罐的生長及產(chǎn)酶曲線如圖4所示。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為144 h，重組工程菌X33/tll-2和X33/tll-opt-2的發(fā)酵酶活力均達(dá)到最大分別為201 U/mL和430 U/mL，相對于原始基因，密碼子優(yōu)化后的tll-opt基因的表達(dá)酶活力提高了1.14 倍。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為168 h，重組工程菌X33/tll-opt-2總蛋白質(zhì)量濃度達(dá)到最大值為3.8 mg/mL，是重組工程菌X33/tll-2總蛋白質(zhì)量濃度的1.8 倍。重組工程菌株VHb+和VHb-在50 L發(fā)酵罐的生長及細(xì)胞生物量如圖5所示，VHb+的酶活力和細(xì)胞生物量均高于VHb-。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為144 h時(shí)，VHb+的酶活力和細(xì)胞生物量均達(dá)到最大值分別為610 U/mL和460 g/L；相同條件下，VHb-的酶活力和細(xì)胞生物量分別為431 U/mL和400 g/L。相對于VHb-，VHb+的酶活力和細(xì)胞生物量分別提高了42%和15%。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析發(fā)現(xiàn)（圖6），重組LN的分子質(zhì)量約為38 kD，與預(yù)測的大小相近。用Quantity One軟件對蛋白條帶進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)上清液中重組LN蛋白約占總蛋白含量的80%。

圖5　重組工程菌VHb+和VHbVHb- 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)Fig.5　Lipase activity and cell weight of VHb+and VHb-during batch fermentation in 50 L bioreactor

圖6　SDS-PAGE分析不同重組酵母工程菌在50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)144 h后的重組蛋白Fig.6　SDS-PAGE analysis of the recombinant lipase from different recombinant strains cultivated in 50 L bioreactor after 144 h cultivation

圖7　重組工程菌VHb+和VHbVHb-在50 L發(fā)酵罐不同誘導(dǎo)時(shí)間下的細(xì)胞活性Fig.7　Cell viability profile of VHb+and VHb-during batch fermentation in 50 L bioreactor under different induction time

重組工程菌VHb+和VHb-在不同誘導(dǎo)時(shí)間的細(xì)胞活性如圖7所示。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，VHb+和VHb-的細(xì)胞活性逐漸降低，在整個(gè)發(fā)酵過程中VHb+的細(xì)胞活性高于VHb-，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為168 h時(shí)，VHb+的細(xì)胞活性為86%，而VHb-的細(xì)胞活性為75%。

3　討 論

畢赤酵母作為一種成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)，在表達(dá)方面有著許多優(yōu)點(diǎn)：如易于操作、培養(yǎng)條件簡單、便于工業(yè)化生產(chǎn)等。密碼子優(yōu)化可以有效地提高異源基因在畢赤酵母的表達(dá)水平。研究表明，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性對米根霉脂肪酶基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化使其表達(dá)酶活力從28.7 U/mL提高到132.7 U/mL［25］。通過優(yōu)化地衣芽孢桿菌的耐高溫α-淀粉酶的密碼子，使其在畢赤酵母的表達(dá)酶活力提高了2.62 倍［26］。本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化tll的密碼子，提高了其在畢赤酵母X33的表達(dá)量。在搖瓶培養(yǎng)條件下，重組工程菌X33/tll-opt-2最高表達(dá)酶活力為16 U/mL，是原始基因表達(dá)酶活力的2.28 倍。在50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下，重組工程菌X33/tll-opt-2最高表達(dá)酶活力為430 U/mL，是原始基因表達(dá)酶活力的2.14 倍。溶氧是畢赤酵母高密度發(fā)酵的一個(gè)關(guān)鍵因素，溶氧的高低直接影響到異源蛋白在畢赤酵母的表達(dá)水平。VHb蛋白可以提高畢赤酵母在高密度發(fā)酵條件下的溶氧，從而提高畢赤酵母的細(xì)胞活性和能量代謝，最終使重組畢赤酵母高效的表達(dá)異源蛋白。在本研究中，將vhb-opt轉(zhuǎn)入X33/tll-opt-2得到重組工程菌VHb+。在50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下，重組工程菌VHb+的最大酶活力為610 U/mL，分別是優(yōu)化后基因和原始基因表達(dá)酶活力的1.41 倍和3.03 倍。

隨著對畢赤酵母研究的深入，會(huì)有越來越多的優(yōu)化方法用來提高異源蛋白在畢赤酵母的表達(dá)量。但是每種優(yōu)化方法都有其本身的局限性，因此根據(jù)這些方法的特點(diǎn)，進(jìn)行兩兩結(jié)合或多種結(jié)合能夠進(jìn)一步提高畢赤酵母表達(dá)水平。在本研究中將密碼子優(yōu)化和VHb蛋白共表達(dá)這兩種方法進(jìn)行結(jié)合使重組耐熱脂肪酶LN在畢赤酵母的表達(dá)酶活力從201 U/mL提高到610 U/mL。本研究結(jié)果表明，將密碼子優(yōu)化和VHb蛋白共表達(dá)這兩種方法進(jìn)行結(jié)合可以有效提高重組蛋白在畢赤酵母的表達(dá)量。

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Enhanced Production of Thermomyces lanuginosus Lipase in Pichia pastoris by Codon Optimization and Co-expression of Vitreoscilla Hemoglobin

WANG Jianrong， LIU Danni， XIA Yu， YANG Ling， LIU Jinshan， TANG Ye， CHEN Lizhi， HUANG Jiale， LI Yangyuan*
（Guangdong VTR Bio-Tech Co. Ltd.， Zhuhai 519060， China）

The codon usage of Thermomyces lanuginosus lipase （tll） and Vitreoscilla hemoglobin （vhb） gene were optimized by online software according to P. pastoris preferred codon usage. The G + C contents of the codon-optimized genes tll-opt and vhb-opt were increased from 46% to 49% and 42% to 51%， respectively. The nucleotides A， T， C and G dispersed evenly in the optimized genes， thereby eliminating AT- or GC-rich motifs. The tll and tll-opt genes were ligated into pPICZαA and transformed into P. pastoris X33， respectively. The recombinant strains containing tll and tll-opt were cultivated in shaking flask and 50 L bioreactor， respectively. In shake-flask level， the maximum lipase activities of X33/tll and X33/tll-opt were 7 and 16 U/mL， respectively. In 50 L bioreactor， the maximum lipase activities produced by X33/tll and X33/tll-opt were 201 U/mL and 430 U/mL. To further increase the expression of tll-opt， the vhb-opt gene was transformed into the recombinant strain containing tll-opt to form recombinant strain VHb+. In shake-flask level， the maximum lipase activity of VHb+was 23 U/mL， which was 139% and 328% higher than that from the tll-opt gene and the wild-type gene （tll），respectively. The maximum lipase activity of VHb+in 50 L bioreactor was 610 U/mL， which was 141% and 303% higher than that from the tll-opt gene and the wild-type gene （tll）.

codon optimization； lipase； Vitreoscilla hemoglobin； high cell density fermentation

10.7506/spkx1002-6630-201619023

Q81

A

1002-6630（2016）19-0135-06

王建榮， 劉丹妮， 夏雨， 等. 密碼子優(yōu)化及透明顫菌血紅蛋白共表達(dá)提高耐熱脂肪酶在畢赤酵母的表達(dá)［J］. 食品科學(xué)，2016， 37（19）： 135-140. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619023. http：//www.spkx.net.cn

WANG Jianrong， LIU Danni， XIA Yu， et al. Enhanced production of Thermomyces lanuginosus lipase in Pichia pastoris by codon optimization and co-expression of Vitreoscilla hemoglobin［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 135-140. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619023. http：//www.spkx.net.cn

2015-11-19

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863 計(jì)劃）項(xiàng)目（2014AA093514）

王建榮（1985—），男，工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)與酶工程。E-mail：believe1234@126.com

李陽源（1983—），男，高級工程師，博士研究生，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)與酶工程。E-mail：liyangyuanvtr@163.com