施東婧，杜洪印，喻文立，吳莉，盛明薇，翁亦齊，王永旺，劉文娜，王樹森（.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 00070；.天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津 009；.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 009）

缺血/再灌注損傷（IRI）是導(dǎo)致肝移植術(shù)后肝功能衰竭和移植肝原發(fā)性無功的重要因素之一[1]。肝臟IRI的發(fā)生機(jī)制包括氧化應(yīng)激、凋亡和炎癥反應(yīng)等。氫氣因其具有選擇性抗氧化作用等特性，對(duì)多臟器和細(xì)胞具有保護(hù)作用，可緩解肝臟IRI[2-5]。適度自噬是細(xì)胞代謝和更新的重要方式，但過度自噬可導(dǎo)致細(xì)胞過多死亡和組織器官病理損傷。研究發(fā)現(xiàn)[6]，自噬相關(guān)肝細(xì)胞死亡可導(dǎo)致移植肝功能衰竭，通過抑制劑來抑制自噬可緩解肝臟冷IRI。因此，本研究擬探討氫氣對(duì)大鼠原位肝移植IRI中肝細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：無特定病原體（SPF）級(jí)成年健康雄性SD大鼠24只，體重為200～250 g，購(gòu)于解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組（每組8只實(shí)驗(yàn)大鼠）：假手術(shù)組（Sham組）、原位肝移植組（OLT組）和飽和氫氣生理鹽水處理組（HS組）。Sham組僅進(jìn)行開關(guān)腹操作，OLT組和HS組建立原位肝移植模型。HS組在肝下下腔開放即刻，經(jīng)肝下下腔靜脈注射6 ml/kg 4℃飽和氫氣生理鹽水，OLT組則注射等量4℃生理鹽水。受鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，術(shù)后均恢復(fù)進(jìn)食。

肝移植模型建立：根據(jù)文獻(xiàn)所述[7]，① 供體手術(shù)：大鼠腹腔注射5%水合氯醛6 ml/kg麻醉后，經(jīng)上腹部行縱切口，暴露并游離第一肝門、肝上下腔靜脈及肝下下腔靜脈，分別結(jié)扎右腎上腺靜脈、左膈下靜脈和肝固有動(dòng)脈。游離膽管時(shí)盡量保留周圍組織。在膽總管遠(yuǎn)端的前臂剪一小口，向近端插入膽道支架管（由硬膜外導(dǎo)管制成，長(zhǎng)約4～5 mm），用絲線結(jié)扎固定。在下腔靜脈遠(yuǎn)端注射1 ml肝素生理鹽水（2.5×104U/L）使血液充分肝素化。在左右髂總動(dòng)脈分叉近端結(jié)扎腹主動(dòng)脈并在結(jié)扎線以上向肝側(cè)置管固定，用4℃肝素乳酸林格液（50 U/L）緩慢灌注（4 ml/min）。剪開肝下下腔靜脈和肝上下腔靜脈遠(yuǎn)端，使灌注液順利流出。待肝臟變?yōu)橥咙S色后，緊貼膈肌剪斷肝上下腔靜脈，在剪斷肝下下腔靜脈和門靜脈時(shí)殘端盡量留長(zhǎng)。② 供肝處理：將供肝置于4℃乳酸林格液中。選取管徑合適的套管分別對(duì)門靜脈及肝下下腔靜脈進(jìn)行套管，并用絲線固定。經(jīng)門靜脈緩慢注入4℃乳酸林格液再次進(jìn)行灌注至流出液清亮為止。在肝上下腔靜脈左右側(cè)角各縫吊7-0血管線，以備吻合時(shí)使用。肝臟修整完畢后置于4℃冰箱保存。③ 受體手術(shù)：術(shù)前處理同供體，開腹后游離肝周韌帶、血管及膽總管。阻斷肝下下腔靜脈、門靜脈及肝上下腔靜脈后剪斷血管并取出肝臟。原位放入供肝，連續(xù)外翻縫合肝上下腔靜脈，將供肝門脈套管套入受體門脈中，用絲線固定。開放門脈及肝上下腔靜脈，結(jié)束無肝期。完成肝下下腔套管后移除止血夾，將供肝膽管支架管套入受體膽管并固定。檢查無出血及異常后用溫生理鹽水反復(fù)沖洗腹腔，縫合腹壁切口。

1.2 制備飽和氫氣生理鹽水：飽和氫氣生理鹽水根據(jù)文獻(xiàn)[3]所述方法制備，抽空裝有生理鹽水的容器內(nèi)氣體，并充入氫氣，在400 kPa的壓力下維持6 h，用氣相色譜分析儀測(cè)定生理鹽水中氫氣是否達(dá)到飽和，氫氣的濃度需大于0.6 mmol/L，制備完成后于4℃保存并于24 h內(nèi)使用。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 肝功能及氧化應(yīng)激檢測(cè)：各組大鼠于再灌注后6 h，經(jīng)下腔靜脈采集血液標(biāo)本，室溫下靜置后離心，收集血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。取肝臟組織制備組織勻漿，根據(jù)試劑盒操作說明書，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.3.2 病理學(xué)檢測(cè)：取大鼠新鮮肝臟組織，4℃生理鹽水沖洗干凈后用10%中性甲醛固定，經(jīng)脫水、包埋后制備切片（切片厚度為5 μm），蘇木精-伊紅（HE）染色后在顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.3.3 蛋白免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）：肝組織蛋白質(zhì)定量、變性后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺氨凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗滌后加入一抗〔兔抗鼠微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3Ⅱ）、自噬相關(guān)因子Beclin-1及磷酸甘油酸脫氫酶 （GAPDH）〕，于4℃孵育過夜，洗滌后用辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，最后洗滌干凈后加入顯色底物顯色曝光，采用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.3.4 RT-PCR 根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參對(duì)照，計(jì)算caspase-3和Cyt-c mRNA表達(dá)水平。引物購(gòu)買于北京奧科鼎盛生物工程有限公司，表1為引物序列。循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性30 s；再95℃變性5 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。隨后得融解曲線，使用軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)分析，計(jì)算達(dá)到閾值的最低循環(huán)數(shù)（Ct值）。目的基因的mRNA拷貝數(shù)以Ct值計(jì)算，每個(gè)基因均重復(fù)2次，取平均值，相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt計(jì)算。

表1 引物序列

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組受鼠血清ALT和AST水平的比較 （圖1）：與Sham組相比，OLT組和HS組血清ALT和AST水平均顯著升高（P＜0.05）；與OLT組相比，HS組血清中ALT和AST水平均明顯降低（P＜0.05）。

圖1 各組受鼠血清ALT和AST水平比較

2.2 各組受鼠肝組織病理改變（圖2）：與Sham組相比，移植術(shù)后6 h，OLT組受鼠肝組織出現(xiàn)明顯損傷，大量肝細(xì)胞水腫，肝竇間隙變窄，炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)明顯，大量紅細(xì)胞淤積，肝竇部分區(qū)域還出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死。與OLT組相比，HS組受鼠肝細(xì)胞水腫減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及紅細(xì)胞淤積減少。

2.3 MDA水平和SOD活性比較（表2）：與Sham組比較，OTL組和HS組受鼠，術(shù)后6 h肝組織MDA水平顯著升高而SOD活性明顯降低（P＜0.05）；HS組與OTL組比較肝組織氧化應(yīng)激損傷減輕，MDA水平降低，SOD活性升高（P＜0.05）。

圖2 各組受鼠肝臟組織病理學(xué)改變 （HE×200）

表2 氧化應(yīng)激水平及caspase-3 mRNA和Cyt-c mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 氧化應(yīng)激水平及caspase-3 mRNA和Cyt-c mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與Sham組相比，aP＜0.05；與OLT組相比，bP＜0.05

Cyt-c mRNA（2-ΔΔCt）Sham 組 8 0.64±0.07 204.13±17.75 1.09±0.18 0.99±0.17 OLT 組 8 1.25±0.13a135.78±10.92a 2.02±0.26a 1.96±0.19a HS 組 8 1.02±0.11ab158.81±12.09ab 1.67±0.17ab 1.64±0.18ab組別 動(dòng)物數(shù)（只）MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）caspase-3 mRNA（2-ΔΔCt）

2.4 肝細(xì)胞胞漿中LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白的表達(dá)量（圖3）：HS組大鼠肝細(xì)胞LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)均受到抑制，其表達(dá)量明顯低于OTL組（P＜0.05）；而與Sham組相比，OTL組和H組LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。

圖3 各組受鼠肝細(xì)胞LC3Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達(dá)

2.5 各組受鼠肝組織caspase-3和Cyt-c的mRNA表達(dá)量（表2）：再灌注后6 h，OLT組受鼠肝組織caspase-3和Cyt-c的mRNA表達(dá)量較Sham組顯著上調(diào)（P＜0.05）；與OLT組比較，HS組肝組織caspase-3和Cyt-c的mRNA表達(dá)水平下降（P ＜ 0.05）。

3 討 論

IRI是肝移植術(shù)后肝功能衰竭和原發(fā)性無功的重要因素之一[7]。本研究根據(jù)文獻(xiàn)[8]建立并改良了Kamada二袖套肝移植模型，結(jié)果表明，再灌注后6 h，與Sham組比較，OLT組ALT、AST、MDA水平和肝組織病理學(xué)損傷評(píng)分升高，SOD活性降低，提示肝移植模型制備成功。

氫氣是無色、無味的小分子氣體，可通過單純擴(kuò)散迅速進(jìn)入細(xì)胞器內(nèi)，可以直接作用于氧化應(yīng)激損傷最嚴(yán)重的細(xì)胞器——線粒體。實(shí)驗(yàn)表明，氫氣可選擇性清除氧化活性較強(qiáng)的羥自由基（·OH）及過氧亞硝酸陰離子（ONOO-），而不與其他具有生物活性的氧自由基（ROS）發(fā)生反應(yīng)，從而起到選擇性抗氧化作用[9-10]。Fukuda等[5]發(fā)現(xiàn)，吸入氫氣可通過減輕氧化應(yīng)激，抑制肝IRI。在本研究中，與OLT組比較，HS組ALT、AST、MDA水平和肝組織病理學(xué)損傷評(píng)分明顯減低，而SOD活性升高，同時(shí)caspase-3和Cyt-c mRNA表達(dá)量減低，提示靜脈注射飽和氫氣生理鹽水可減輕肝移植中肝IRI，減少肝細(xì)胞凋亡。

自噬在細(xì)胞生存及其穩(wěn)態(tài)的維持中具有重要作用。細(xì)胞可以通過自噬降解細(xì)胞內(nèi)損傷的細(xì)胞器和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的蛋白，分解得到的氨基酸等可為細(xì)胞代謝提供底物[11]。Gotoh等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，自噬引起的肝細(xì)胞死亡導(dǎo)致移植肝功能衰竭，抑制自噬可有效緩解肝臟冷IRI。最新研究顯示，在骨骼肌的IRI中，氫氣可以通過抑制自噬從而起到一定的保護(hù)作用[12]。在本研究中，OLT組移植肝再灌注6 h后，自噬被激活，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)上調(diào)，同時(shí)凋亡相關(guān)基因caspase-3、Cyt-c mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。開放肝下下腔靜脈后注射飽和氫氣生理鹽水可減輕大鼠肝組織病理損傷，MDA含量明顯降低而SOD活性顯著升高，同時(shí)LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白以及caspase-3和Cyt-c mRNA表達(dá)均下降。LC3與Beclin-1是自噬過程中的兩個(gè)重要蛋白，可反映細(xì)胞自噬活性。由此可見，肝移植IRI可上調(diào)肝細(xì)胞自噬，而靜脈注射飽和氫氣生理鹽水可通過抑制自噬減少IRI。

綜上所述，飽和氫氣生理鹽水可以通過抑制肝細(xì)胞自噬來緩解細(xì)胞凋亡，減輕移植肝的IRI，但氫氣對(duì)自噬的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步證實(shí)。