劉雨萌,金元寶,孟凡欣,于　浩

(1.吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,吉林長春 130062;2.吉林大學(xué)珠海學(xué)院,廣東珠海 519041)

?

枸杞子多糖通過改善氧化應(yīng)激延緩疲勞作用的研究

劉雨萌1,2,金元寶2,孟凡欣2,于浩1,*

(1.吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,吉林長春 130062;2.吉林大學(xué)珠海學(xué)院,廣東珠海 519041)

本文研究枸杞子多糖(LBP)對小鼠疲勞的延緩作用及機(jī)制。將昆明種小鼠分為空白對照組(給予生理鹽水)和高、中、低劑量枸杞子多糖處理組(劑量分別為100、50和25 mg/kg/day),灌胃給藥2周,通過跑步、疲勞轉(zhuǎn)棒和負(fù)重游泳實驗考察枸杞子多糖對小鼠的抗疲勞作用,并對運動后小鼠體內(nèi)肝糖原、肌糖原以及血清、肝臟和肌肉中抗氧化指標(biāo)進(jìn)行檢測。實驗結(jié)果表明,LBP可以明顯延長小鼠的運動時間,增加小鼠肝糖原和肌糖原含量,同時明顯提高血清、肝臟和肌肉中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性,顯著降低肝臟和肌肉中丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)含量及血清中MDA含量。LBP具有延緩疲勞的作用,其機(jī)制可能是減弱氧化應(yīng)激和提高糖原含量。

枸杞子多糖,抗疲勞,氧化應(yīng)激

隨著社會的進(jìn)步,人們生活節(jié)奏不斷加快,疲勞已成為一種普遍的社會現(xiàn)象。作為一種生理現(xiàn)象,疲勞是指身體機(jī)能不能持續(xù)在特定水平或者整體能維持預(yù)定的運動強(qiáng)度而出現(xiàn)的一種狀態(tài)[1],疲勞發(fā)生后如果得不到及時消除,將會逐漸積累,最終導(dǎo)致過勞,使機(jī)體發(fā)生內(nèi)分泌紊亂,免疫力下降,甚至出現(xiàn)器質(zhì)性病變[2],因而延緩疲勞發(fā)生和促進(jìn)疲勞恢復(fù)是當(dāng)今社會研究的熱點。

枸杞子是茄科植物寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)的干燥成熟果實。枸杞子作為一種傳統(tǒng)名貴中草藥,性甘平,中醫(yī)上其主要藥理作用為補(bǔ)腎養(yǎng)陰,治虛勞消渴[3]。在中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)中,枸杞子被用于多種補(bǔ)益方劑中。2002年,枸杞子被中國衛(wèi)生部收錄在藥食兩用中草藥名單中[4]。

枸杞子中含有多種活性成分,其中研究最多的有效成分為枸杞子多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides,LBP),LBP是一種酸性雜多糖和多肽或者蛋白質(zhì)復(fù)合而成的多糖。LBP具有多種生物活性,如緩解機(jī)體疲勞,降低血糖,抗缺氧,提高機(jī)體免疫力,延緩衰老等[5-6]。目前已有研究表明LBP具有緩解疲勞的作用,但由于疲勞發(fā)生機(jī)制的復(fù)雜性,LBP對其機(jī)制的研究并不全面詳細(xì)。氧化應(yīng)激是指生物體內(nèi)氧化-還原系統(tǒng)處于失衡狀態(tài),氧自由基產(chǎn)生過多,過多的氧自由基會對生物體內(nèi)的細(xì)胞和組織造成損傷,研究表明,氧化應(yīng)激對疲勞的發(fā)生起著非常重要的作用[7],本文將從氧化應(yīng)激方面著手進(jìn)行LBP抗疲勞的機(jī)制研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號:20150404)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號:20150404)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號:20150406)、ROS試劑盒(批號:20150406)、肝糖原測定試劑盒(批號:20150410)和肌糖原測定試劑盒(批號:20150402)購自南京建成生物工程研究所;枸杞子購買自寧夏省中寧縣,批號:20140503;健康成年昆明種小鼠160只,體重18～22 g,雄性,由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供,清潔級,實驗動物質(zhì)量合格證號:SCXK(吉)2014-0005,在22～25 ℃、相對濕度40%～60%的環(huán)境中飼養(yǎng),自由飲食,小鼠飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

RE52-05型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;XSC型小鼠恒溫游泳池淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司;YYAL204-IC型電子天平梅特勒-托利多儀器上海有限公司;DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司;TL-16R型臺式高速冷凍離心機(jī)上海市離心機(jī)機(jī)械研究所;756MC型紫外-可見分光光度計上海精密科學(xué)儀器有限公司;360型傅里葉紅外光譜儀美國Nicolet公司。

1.2實驗方法

1.2.1枸杞子多糖的提取稱取一定量的枸杞子,加入10倍水量,于100 ℃加熱回流提取2 h,提取溫度,冷卻后于離心溫度 4000 r/min離心10 min,收集上清液低溫減壓濃縮。采用Sevag法對提取液進(jìn)行反復(fù)除蛋白,至無蛋白層產(chǎn)生為止[8]。減壓濃縮蒸發(fā)提取液中含有的有機(jī)溶劑,采用4倍體積乙醇對提取液4 ℃醇沉,收集沉淀,冷凍干燥得枸杞子多糖,備用。

1.2.2LBP傅里葉紅外光譜分析采用蒽酮硫酸法測定枸杞子提取多糖的含量,同時采用傅里葉紅外光譜儀對LBP進(jìn)行光譜掃描,掃描范圍為4000～500 cm-1,并對LBP進(jìn)行紫外區(qū)掃描,掃描波長為200～400 nm。

1.2.3小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒實驗40只昆明種小鼠,雄性,隨機(jī)分為4組,每組10只,分為空白組(給予相應(yīng)的生理鹽水)和LBP高、中、低劑量處理組(劑量分別為100、50和25 mg/kg/day),灌胃給藥2周,末次給藥1 h后,將各組小鼠分別放在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上,使肌肉處于靜力緊張狀態(tài),轉(zhuǎn)速設(shè)為20 r/min。各組小鼠進(jìn)行實驗前,對其進(jìn)行訓(xùn)練,在各小鼠從轉(zhuǎn)棒上跌落3次后,開始記錄小鼠由于肌肉疲勞從轉(zhuǎn)棒上跌下的時間。

1.2.4小鼠跑步實驗40只昆明種小鼠,雄性,隨機(jī)分為4組,每組10只,分為LBP高、中、低劑量灌胃組(劑量分別為100、50和25 mg/kg/day)和空白組(給予相應(yīng)的生理鹽水),灌胃給藥2周,末次給藥1 h后,將小鼠置于FT-200動物跑步機(jī)中。先放置好動物,對小鼠進(jìn)行訓(xùn)練,使其了解逃離帶電區(qū)域后,將轉(zhuǎn)速設(shè)為30 r/min,電流調(diào)到最高,以小鼠被連續(xù)電擊3次以上后,小鼠不能起身的時間記錄為小鼠跑步時間。

1.2.5小鼠負(fù)重游泳實驗40只昆明種小鼠,雄性,隨機(jī)分為4組,每組10只,分為LBP高、中、低劑量組(劑量分別為100、50和25 mg/kg/day)和空白組(給予相應(yīng)的生理鹽水),灌胃給藥2周,末次給藥1 h后,每組鼠尾部系以體重10%的負(fù)荷,放入水溫(27±1) ℃,水深為小鼠3倍體長的桶式游泳池中(d=50 cm),測定各組小鼠持續(xù)游泳力竭時間,以小鼠頭部沉入水中5 s而不能浮出水面的時間為持續(xù)游泳時間。

1.2.6血樣和組織樣本采集40只昆明種小鼠,雄性,隨機(jī)分為4組,每組10只,分為LBP高、中、低劑量組(劑量分別為100、50和25 mg/kg/day)和空白組(給予相應(yīng)的生理鹽水),灌胃給藥2周,末次給藥1 h后,每組進(jìn)行20 min被迫游泳,于游泳結(jié)束5 min后,眼眶靜脈取血,解剖取肝臟和肌肉,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7小鼠運動后肝糖原和肌糖原含量的測定按照相關(guān)試劑盒使用方法,對固定時間游泳后小鼠肝臟和肌肉中糖原的含量進(jìn)行檢測。

1.2.8血清、肝臟和肌肉抗氧化指標(biāo)檢測肌肉和肝臟組織加入生理鹽水研磨攪碎,之后4000 r/min 離心10 min,采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定上清液中的蛋白濃度,之后參照試劑盒的方法測定SOD、GSH-Px活性和MDA和ROS含量,其中,ROS為熒光檢測,激發(fā)波長500 nm,發(fā)射波長為525 nm,最后以單位蛋白內(nèi)熒光強(qiáng)度表示ROS含量。

2　結(jié)果與分析

2.1枸杞子多糖成分分析和表征

采用蒽酮硫酸法測得枸杞子多糖含量為1.023%,同時分別對LBP進(jìn)行了紫外光譜和傅里葉紅外光譜掃描,其中傅里葉光譜掃描范圍為4000～500 cm-1,結(jié)果如圖1和圖2顯示。圖1顯示LBP在260 nm和280 nm處沒有明顯吸收峰,表明LBP中蛋白和核酸含量極低。并且已知不同的官能團(tuán)的紅外特征峰是不同的,通過對紅外光譜圖分析可以得到多糖中所具有的官能團(tuán)。LBP在3400 cm-1處有強(qiáng)烈的O-H鍵伸縮振動,在2930 cm-1為C-H鍵的伸縮振動,1650 cm-1為C=O鍵的伸縮振動,在950～1200 cm-1表示有C-O-C和C-O-H鍵的伸縮振動。

(mg/kg)處理前體重(g)灌胃1周后灌胃2周后空白組020.58±1.2224.02±2.3227.22±1.26LBP劑量組2520.65±0.8925.88±3.2228.78±5.205020.48±1.1626.22±3.0228.75±5.2210020.66±2.0126.93±2.1529.21±4.36

圖1　LBP的紫外吸收光譜圖Fig.1　UV-spectrometry of LBP

圖2　LBP傅里葉紅外光譜圖Fig.2　Fourier infrared spectrogram of LBP

2.2LBP對模型小鼠體重的影響

由表1可知,在給藥2周期間,LBP對小鼠的體重并無影響。

2.3LBP對小鼠轉(zhuǎn)棒時間的影響

如圖3所示,與空白組相比,連續(xù)對小鼠分別灌胃50 mg/kg和100 mg/kg劑量的LBP 2周可以顯著提高小鼠的轉(zhuǎn)棒時間(p<0.01),說明LBP可以延緩小鼠疲勞的發(fā)生。

圖3　LBP對小鼠轉(zhuǎn)棒時間的影響Fig.3　The effects of LBP on rotarod time注:與空白組相比,** p<0.01;圖5同。

2.4LBP對小鼠跑步時間的影響

結(jié)果如圖4所示。小鼠灌胃給予2周LBP后,高、中、低劑量組均可明顯提高小鼠的跑步時間,與空白組相比,中劑量和高劑量組分別將跑步時間延長113.5%(p<0.01)和116.3%(p<0.01),說明LBP可以延緩小鼠疲勞的發(fā)生。

圖4　LBP對小鼠跑步時間的影響Fig.4　The effects of LBP on running time注:與空白組相比,* p<0.05,** p<0.01。

2.5LBP對小鼠負(fù)重游泳時間的影響

小鼠灌胃給予LBP兩周后,通過負(fù)重游泳實驗考察LBP對小鼠疲勞的影響,結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示,50 mg/kg和100 mg/kg可以顯著提高小鼠的負(fù)重游泳時間,與空白組相比,分別提高了65.3%(p<0.01)和113.33%(p<0.01),說明LBP可以延長小鼠疲勞的發(fā)生。

圖5　LBP對小鼠負(fù)重游泳時間的影響Fig.5　The effects of LBP on swimming time

2.6LBP對小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響

在運動過程中,糖是肌肉組織的重要能量來源,糖原的儲量影響機(jī)體運動能力。由表2可知,與空白組相比,LBP低、中、高劑量組均能夠明顯增加小鼠肝糖原和肌糖原儲備能力。與空白組相比,LBP低、中、高劑量組小鼠中肝糖原的含量分別增加了38.12%、51.16%(p<0.05)和66.23%(p<0.01),而肌糖原分別增加了6.55%、15.69%(p<0.05)和26.13%(p<0.05),結(jié)果表明LBP可以顯著提高小鼠體內(nèi)肝糖原和肌糖原的儲備能力,進(jìn)而增強(qiáng)小鼠的運動能力,減緩疲勞的發(fā)生。

Table 3The effect of LBP on the activities of SOD and GSH-Px,and the levels of

空白組LBP劑量組(mg/kg)2550100血清MDA(nmol/mL)33.25±9.8725.78±11.0825.45±10.90*22.04±7.82**SOD(U/mL)155.52±36.22236.80±41.51*243.34±48.20*259.12±36.92**GSH-Px(μmol/mL)132.38±41.35247.19±42.11*280.06±34.96**256.04±59.25**肝臟MDA(nmol/mgprot)46.25±14.2539.00±16.24*32.12±18.24*28.95±10.25**ROS(FI/gprot)1987±2871628±3121251±219**1188±232**SOD(U/mgprot)122.15±32.10141.05±35.47*156.93±36.22*163.32±18.25**GSH-Px(μmol/gprot)28.38±7.1131.93±7.2839.14±4.84*37.24±10.09*肌肉MDA(nmol/mgprot)1.54±0.211.26±0.15*1.05±0.22*1.09±0.25*ROS(FI/gprot)18005±201215563±1954*13256±2149**10243±1385**SOD(U/mgprot)82.13±19.1296.89±10.48*110.43±12.78*116.36±17.29**GSH-Px(μmol/gprot)29.12±3.6934.34±5.7137.24±4.01**38.10±4.86**

表2　LBP對小鼠肝糖原和肌糖原的影響

注:與空白組相比,*p<0.05,**p<0.01;表3同。

2.7LBP對運動后小鼠抗氧化能力的影響

研究表明,氧化應(yīng)激對疲勞的發(fā)生起著非常重要的影響,運動等應(yīng)激可導(dǎo)致機(jī)體自由基產(chǎn)生過多,自由基攻擊細(xì)胞膜及線粒體等細(xì)胞器使其損傷,從而引發(fā)細(xì)胞代謝和機(jī)能紊亂,使工作能力下降引發(fā)疲勞。表3結(jié)果表明,LBP可以提高抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性,并且降低過氧脂質(zhì)化物ROS和MDA的含量,與空白組相比,具有顯著差異性。與空白組相比,LBP高劑量組血清中SOD、GSH-Px活性分別提高了66.6%和93.4%(p<0.01),而血清中MDA含量降低了33.7%(p<0.01)。LBP可以顯著加強(qiáng)肝臟和肌肉中抗氧化酶 SOD和GSH-Px的活性,顯著降低肝臟和肌肉中MDA和ROS含量,與空白組相比,其中100 mg/kg LBP劑量組肝臟中的MDA和ROS含量分別降低了37.4%和40.2%,肌肉中的MDA和ROS含量分別降低了29.2%和43.1%。

3　討論

疲勞的最直接和最客觀的表現(xiàn)是運動耐力的下降,本文通過小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒、跑步和負(fù)重游泳實驗評價LBP抗疲勞作用。灌胃2周(劑量)LBP后,小鼠的運動耐力有明顯的提高,由于小鼠間的個體差異性比較大,導(dǎo)致各組數(shù)據(jù)的偏差較大,通過雙t-t檢驗顯著性水平,與空白組相比仍具有顯著性差異,表明LBP能夠延緩疲勞的發(fā)生。

在運動過程中,糖是肌肉組織的重要能量來源。在機(jī)體進(jìn)行短時間大強(qiáng)度運動時肌肉組織的能量絕大部分由糖代謝供給[9-10]。肌糖原的儲量和代謝能力是決定耐力的重要因素,大量的研究表明運動導(dǎo)致的體力衰竭總是和肌糖原的耗竭同時發(fā)生的。隨著肌糖原消耗的不斷增加,機(jī)體為維持血糖水平,將動用肝糖原而導(dǎo)致肝糖原減少[10]。因此,肝糖原和肌糖原含量是反映疲勞程度的敏感指標(biāo)。通過對小鼠耐力的考察實驗以及肌糖原和肝糖原的測定,結(jié)果表明,LBP具有延緩疲勞的效果。

在生物體內(nèi),ROS可以作為信號分子參與葡萄糖和脂質(zhì)的代謝[11],但是運動等應(yīng)激可導(dǎo)致機(jī)體自由基產(chǎn)生過多,造成機(jī)體氧化-還原系統(tǒng)的失衡,進(jìn)而影響肌肉對葡萄糖的攝取[12];同時,自由基會攻擊細(xì)胞膜和線粒體等細(xì)胞器,進(jìn)而導(dǎo)致其損傷,從而引發(fā)細(xì)胞代謝和機(jī)能紊亂,使工作能力下降引發(fā)疲勞[13]。通過對小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性和氧自由基等的檢測,表明LBP可以通過提高機(jī)體內(nèi)的抗氧化能力和減少氧自由基,進(jìn)而改善氧化應(yīng)激對機(jī)體的損傷和延長小鼠的運動時間。

4　結(jié)論

通過疲勞轉(zhuǎn)棒實驗、跑步實驗和負(fù)重游泳實驗,表明LBP可以延長小鼠的運動時間;同時LBP可以提高小鼠體內(nèi)肝糖原和肌糖原的儲備能力,進(jìn)一步表明LBP具有緩解疲勞的作用。在運動過程中,大量ROS產(chǎn)生,造成機(jī)體氧化-還原系統(tǒng)的失衡,對機(jī)體造成損傷,引發(fā)疲勞,LBP可以提高機(jī)體的抗氧化能力,減少氧自由基的產(chǎn)生,可以通過改善氧化應(yīng)激進(jìn)而緩解疲勞,但是由于疲勞產(chǎn)生的機(jī)制及其復(fù)雜,LBP具體緩解疲勞的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

[1]顏衛(wèi)東. 運動性疲勞產(chǎn)生的機(jī)制及其恢復(fù)[J]. 南京體育學(xué)院學(xué)報,2007,6(2):58-60.

[2]張曉抒,高祺. 慢性疲勞綜合征臨床研究進(jìn)展[J]. 遼寧中醫(yī)雜志,2006,33(7):57-60.

[3]燕憲濤,路新國. 枸杞多糖生物活性的研究進(jìn)展[J].中國食物與營養(yǎng),2011,17(11):73-75.

[4]Luo Q,Li Z,Yan J,et al. Lycium barbarum polysaccharides induce apoptosis in human prostate cancer cells and inhibits prostate cancer growth in axenograft mouse model of human prostate cancer[J]. Journal of Medicinal Food,2009,12(4):695-703.

[5]張雅莉,黃曉旭,蔡美琴. 枸杞多糖的抗氧化及緩解體力疲勞作用研究進(jìn)展[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報,2015,35(6):911-923.

[6]Yao LQ,Li FL. Lycium barbarum polysaccharides ameliorates physical fatigue[J]. African Journal of Agricultural Research,2010,5(16):2153.

[7]Huang SC,Lee FT,Kuo TY,et al. Attenuation of long-term Rhodiola rosea supplementation on exhaustive swimming-evoked oxidative stress in the rat[J]. Chinese Journal of Physiology,2009,52(5):316-324.

[8]Yan H,Zhu D,Xu D,et al. A study on Cordyceps militaris polysaccharide purification,composition and activity analysis[J]. African Journal of Biotechnology,2008,7(22):4004-4009.

[9]Choi SK,Baek SH,Choi SW. The effects of endurance training and thiamine supplementation on anti-fatigue during exercise[J]. Journal of Nutritional Biochemistry,2013,17(4):189-198.

[10]Campos-Ferraz PL,Bozza T,Nicastro H,et al. Distinct effects of leucine or a mixture of the branched-chain amino acids(leucine,isoleucine,and valine)supplementation on resistance to fatigue,and muscle and liver-glycogen degradation,in trained rats[J]. Nutrition,2013,29(11):1388-1394.

[11]Folli F,Saad M J,Backer J M,et al. Insulin stimulation of phosphatidylinositol 3-kinase activity and association with insulin receptor substrate 1 in liver and muscle of the intact rat[J]. The Journal of Biological Chemistry,1992,267(31):22171-22177.

[12]Martin I K,Katz A,Wahren J. Splanchnic and muscle metabolism during exercise in NIDDM patients[J]. The American Journal of Physiology,1995,269(3 Pt 1):E583-590.

[13]Kane DA. Lactate oxidation at the mitochondria:a lactate-malate-aspartate shuttle at work[J]. Frontiers in Neuroscience,2014,8.

Anti-fatigue activity ofLyciumbarbarumpolysaccharides in mice by attenuating oxidative stress

LIU Yu-meng1,2,JIN Yuan-bao2,MENG Fan-xin2,YU Hao1,*

(1.College of Animal Science,Jilin University,Changchun 130062,China 2.Zhuhai College of Jilin University,Zhuhai 519041,China)

The effect ofLyciumbarbarumpolysaccharide(LBP)on delaying fatigue via attenuating oxidative stress was studied in mice model. After 2-week LBP treatment with dose of 25,50 and 100 mg/kg,exercise time of the mice was detected via rotating rod test,forced swimming test,and forced running test. After 20 min swimming,the levels of hepatic glycogen,muscle glycogen,and some antioxidant indexes were detected in serum,liver,and muscle. LBP obviously prolonged exercise time,increased the levels of liver glycogen and muscle glycogen,enhanced the activities of SOD and GSH-Px,and decreased the levels of MDA and ROS in serum,liver and muscle. The anti-fatigue activity of LBP may be associated with attenuating oxidative,further increasing glycogen content in the mice.

Lyciumbarbarumpolysaccharides;anti-fatigue;oxidative stress

2016-01-06

劉雨萌(1986-)，女，碩士研究生，研究方向：生物制藥，E-mail:269506310@qq.com。

于浩(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：分子遺傳，E-mail:43032808@qq.com。

TS254.1

A

1002-0306(2016)18-0344-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.057