楊麗芝,楊賢慶,黃　卉,李來好,鄧建朝,趙永強(qiáng),楊少玲

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

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響應(yīng)面法優(yōu)化南海鳶烏賊墨汁多糖提取工藝

楊麗芝1,2,楊賢慶1,*,黃卉1,李來好1,鄧建朝1,趙永強(qiáng)1,楊少玲1

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

目的:為探索南海鳶烏賊墨汁多糖的最佳提取工藝,利用響應(yīng)面分析法對南海鳶烏賊墨汁多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法:在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上選取因素與水平,根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法,以獲得多元二次線性回歸方程,以Y(多糖含量(%)×粗多糖得率(%)×104)為響應(yīng)值分析各因素的交互作用。結(jié)果:鳶烏賊墨汁多糖提取的最佳工藝條件:料液比1∶2、浸提液pH5.5、加酶量1.00%,此條件下,粗多糖得率為0.91%,多糖含量為9.8%,與理論預(yù)測值接近。結(jié)論:采用響應(yīng)面法優(yōu)化鳶烏賊墨多糖提取工藝,取得最佳提取工藝,且具有可行性。

鳶烏賊,墨汁多糖,提取,響應(yīng)面分析

鳶烏賊(Sthenoteuthisoualaniensis)柔魚科,鳶烏賊屬,體型與常見魷魚相似,廣泛分布于印度洋和太平洋的熱帶、亞熱帶海域,其中以南海海域數(shù)量較大[1-3]。馮波等人根據(jù)克里金插值法估算得,南海鳶烏賊資源量為204.94萬t,總可捕量為99.40萬t,是一種極具開發(fā)潛力的資源[4]。烏賊墨是當(dāng)烏賊遇到天敵時,噴出的一種用來防身的物質(zhì),主要由黑色素和蛋白多糖復(fù)合體組成,近年來,國內(nèi)外對烏賊加工副產(chǎn)物墨汁做了一系列研究,研究表明烏賊墨汁不僅具有抗腫瘤[5-7]、抗輻射[8]、止血[9]等多種生理功能,還可以抗衰老、抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫力[10]等。天然產(chǎn)物多糖具有諸多生物活性,在抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和降血糖等方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景,且來源廣泛無毒,近年來成為研究的熱點(diǎn)[11],國內(nèi)外研究者從烏賊墨中分離出墨多糖并對其活性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)墨多糖具有抗氧化[12]、抗菌、防腐保鮮、抑制腫瘤細(xì)胞生長繁殖等功能[13]。多糖提取方法很多,傳統(tǒng)提取法有水提醇沉法、酸堿法等,但得率較低,操作較復(fù)雜,隨著技術(shù)研究的深入,酶法微波輔助提取法、超聲提取法、超高壓提取法、膜分離技術(shù)逐漸代替了傳統(tǒng)的提取方法,樂小炎[14]等采用超聲波結(jié)合酶法提取烏賊墨多糖,超聲波處理與木瓜蛋白酶水解結(jié)合,乙醇沉淀后得到粗多糖,并進(jìn)一步分離純化得到一種含3%硫酸根的多糖。

響應(yīng)面法能夠通過建立多元二次回歸數(shù)學(xué)模型,從而達(dá)到優(yōu)化提取工藝參數(shù)的目的,具有周期短、精度高、且能夠研究幾種因素之間的交互作用等優(yōu)點(diǎn),是一種合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計方案。目前,雖然對糖的研究逐步深入,但是南海鳶烏賊加工副產(chǎn)物墨汁多糖的提取暫未見報道,為得到較佳的鳶烏賊墨汁多糖提取工藝,本實(shí)驗(yàn)利用水提醇沉結(jié)合木瓜蛋白酶酶解的方法,在單因素的基礎(chǔ)上,以Y(多糖含量(%)×粗多糖得率(%)×104)為測定指標(biāo),采用響應(yīng)面法優(yōu)化料液比、浸提pH及加酶量,進(jìn)而優(yōu)化提取條件,提高粗多糖得率,為南海鳶烏賊墨多糖的提取分離提供更經(jīng)濟(jì)、更簡單的技術(shù)方法,為進(jìn)一步充分開發(fā)利用鳶烏賊資源提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮鳶烏賊南海水產(chǎn)研究所科考船“南鋒號”于2014年7月份捕撈于南海海域,取墨囊,擠出墨汁,將墨汁混勻,凍藏冰箱,備用;木瓜蛋白酶6000 U·mg-1,上?？柹?無水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸、無水葡萄糖均為分析純。

AvantiJ26XP 高速離心機(jī)美國;UV2550紫外可見分光光度計、EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1南海鳶烏賊墨多糖提取工藝流程取50 g鳶烏賊墨汁,加一定量蒸餾水,調(diào)節(jié)pH,40 ℃熱水浸提4 h,4 ℃浸提12 h,10000 r/min離心40 min(重復(fù)2次),取上清液加2倍體積Tris-HCl,加一定量木瓜蛋白酶,酶解12 h(pH6.8,60 ℃水浴振蕩),煮沸10 min,滅酶,10000 r/min離心20 min除去蛋白,取上清加1/4體積氯仿、正丁醇(體積比4∶1),攪拌器劇烈攪拌30 min,重復(fù)操作,直至除去雜質(zhì)蛋白,離心,取上清,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至50 mL加4倍無水乙醇醇沉過夜。10000 r/min離心10 min,取沉淀抽濾,無水乙醇、丙酮洗沉淀,得粗多糖。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)根據(jù)研究者發(fā)現(xiàn),在多糖提取工藝中,料液比、浸提液pH和加酶量三因素是影響多糖得率的三個重要因素,因此本實(shí)驗(yàn)選取料液比、浸提液pH和加酶量為三因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)[15]。

1.2.2.1料液比對鳶烏賊墨多糖提取的影響調(diào)節(jié)浸提液pH為5.5、加酶量1%的條件下,選取料液比分別為:1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5,提取鳶烏賊墨多糖,并測定料液比對粗多糖中多糖含量、蛋白含量及粗多糖得率的影響。

1.2.2.2浸提液pH對鳶烏賊墨多糖提取的影響選取料液比1∶2、加酶量1%,調(diào)節(jié)浸提液pH為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5五個水平,測定浸提液pH對粗多糖中多糖含量、蛋白含量及粗多糖得率的影響。

1.2.2.3加酶量對鳶烏賊墨多糖提取的影響選取料液比為1∶2、浸提液pH5.5,調(diào)節(jié)加酶量分別為:0.5%、0.8%、1%、1.2%、1.5%五個水平,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),提取鳶烏賊墨汁粗多糖,并測定粗多糖中多糖含量、蛋白含量及粗多糖得率隨加酶量的變化。

1.2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以Y(多糖含量(%)×粗多糖得率(%)×104)為響應(yīng)值[16],進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),選出鳶烏賊墨多糖最佳提取工藝。因素與水平取值見表1。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計因素水平表

1.2.4多糖含量測定苯酚硫酸法[17-18];分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 0.04 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液于具塞比色管中,各以蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL,同時以2.0 mL蒸餾水作為空白,然后加6%苯酚1 mL及濃硫酸5 mL,搖勻,冷卻,室溫放置20 min后,于490 nm處測吸光值,橫坐標(biāo)為多糖含量,縱坐標(biāo)為吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取鳶烏賊墨多糖適量溶于水制成0.05 mg/mL,測吸光值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算多糖含量。

1.2.5蛋白含量的測定考馬斯亮藍(lán)法[19]。

1.2.6鳶烏賊墨汁多糖得率鳶烏賊墨汁多糖得率的計算式為[20]:

鳶烏賊墨汁粗多糖得率(%)=粗多糖質(zhì)量(g)/南海鳶烏賊墨汁質(zhì)量(g)×100。

1.2.7數(shù)據(jù)分析每組實(shí)驗(yàn)做三個平行,采用Design-Expert V8.0.6 軟件對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回歸分析[21-22]。

2　結(jié)果與分析

2.1多糖含量測定

根據(jù)苯酚硫酸法,于490 nm處測吸光值,橫坐標(biāo)為多糖含量,縱坐標(biāo)為吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。

圖1　葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of glucose

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1料液比對鳶烏賊墨多糖提取的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2　多糖含量、蛋白含量及粗多糖得率隨料液比的變化Fig.2　The change of the polysaccharide,protein content and crude polysaccharide extraction yield alongwith the change of material liquid ratio

由圖2可知,多糖含量及得率隨料液比的增加而增加,但是當(dāng)料液比達(dá)到1∶2時,隨著料液比的增加,多糖含量及得率變化不明顯,而蛋白含量隨料液比的變化無明顯變化,實(shí)驗(yàn)過程中,隨著料液比的增加,會增加操作困難,為方便實(shí)驗(yàn)操作,節(jié)約資源,因此,料液比選擇1∶2。

2.2.2浸提液pH對鳶烏賊墨多糖提取的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3　多糖含量、蛋白含量及粗多糖得率隨浸提液pH的變化Fig.3　The change of the polysaccharide,protein content and crude polysaccharide extractionyield along with the change of pH value

由圖3可知,粗多糖中多糖含量及蛋白含量均隨著浸提液pH的增加而增大,而多糖得率則隨著pH的增大而呈現(xiàn)先升后降的趨勢,當(dāng)pH為5.5時,粗多糖得率達(dá)到最大,這可能是由于pH在3.5～5.5之間,隨著pH的增大,酸性條件下沉淀的黑色素逐漸溶解,多糖也隨之被浸提出,多糖含量、蛋白含量和得率均隨之升高,在pH5.5時粗多糖得率達(dá)到最大,但當(dāng)pH繼續(xù)增加,大量黑色素溶解,蛋白含量隨著升高,增加了去除蛋白及黑色素的難度,而在去除蛋白及色素時會損失部分多糖,導(dǎo)致得率降低且粗多糖色素較深,影響后續(xù)實(shí)驗(yàn),因此,浸提液pH選擇pH5.5為最佳值,進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.2.3加酶量對鳶烏賊墨多糖提取的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4　多糖含量、蛋白含量及粗多糖得率隨加酶量的變化Fig.4　The change of the polysaccharide,protein content and crude polysaccharide extraction yield alongwith the change of enzyme concentration

由圖4可得,加酶量為0.5%～1.0%之間時,多糖含量隨著加酶量的增加而增大,而蛋白含量隨著加酶量的增加直線下降,但當(dāng)加酶量達(dá)到1%后,多糖及蛋白含量隨著加酶量的增加呈穩(wěn)定狀態(tài),幾乎無變化,粗多糖得率隨著加酶量的增加而略呈下降趨勢,這可能是由于隨著加酶量的增加,蛋白去除效果越好,但是隨著加酶量的繼續(xù)增加,需反復(fù)用氯仿、正丁醇除蛋白,會損失部分多糖,導(dǎo)致得率降低,因此,選取加酶量1%最宜實(shí)驗(yàn)。

2.3響應(yīng)面分析

2.3.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計及結(jié)果分析根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計原理,對料液比、浸提液pH和加酶量三因素以Y為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),共17個實(shí)驗(yàn)點(diǎn),其中5個中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn),中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見表2、表3。

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計及響應(yīng)值

利用Design Expert 8.0.5b對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,得到響應(yīng)值Y與料液比、浸提液pH、加酶量三個因素的三元二次模擬方程為:

Y=8.87+0.018A-0.033B-4.500E-003C-0.064AB+0.035BC-0.13A2-1.15B2-0.07C2

由表3回歸分析結(jié)果可知,回歸模型p<0.01,失擬項(xiàng)p>0.01，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999,說明這種方法具有統(tǒng)計學(xué)意義,純誤差小,與實(shí)際擬合較好,使用該方法優(yōu)化鳶烏賊墨多糖的提取條件是可行的。由p值可知,A、B、AB、BC、A2、B2、C2對Y值的影響極顯著。

表3　回歸模型方差分析結(jié)果

圖5　各因素之間的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.5　The response surface figure and contour map between the various factors

注:**表示極顯著(p<0.01)。

2.3.2響應(yīng)面曲面分析利用Design Expert 8.0.6對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,所得響應(yīng)面及等高圖見圖5,各因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響可通過響應(yīng)面圖直觀的反映出來,其中等高線的形狀及疏密程度可反應(yīng)兩因素交互作用的強(qiáng)弱,圓形表示兩因素的交互作用較弱,而橢圓形表示交互作用較強(qiáng)[18,23]。圖5反映各因素對響應(yīng)值Y的影響,圖中最小橢圓中心點(diǎn)為響應(yīng)值最高點(diǎn)。

圖5(a)為加酶量為中心點(diǎn)時,浸提液pH與料液比對響應(yīng)值Y的影響,由圖可看出,浸提液pH與料液比的交互作用較強(qiáng),隨著料液比的增大和浸提液pH的增加,Y值隨之而變化,但Y值沿料液比方向變化緩慢,而沿浸提液pH方向變化幅度較大,因此,浸提液pH對響應(yīng)值Y的影響較顯著,表現(xiàn)為曲線相對較陡,而料液比曲線較為平緩。

從圖5(b)看出,隨著料液比和加酶量的變化,Y值都有所變化,但相對于加酶量對Y值變化,Y值沿料液比方向變化幅度較大,等高線接近圓形,加酶量與料液比交互作用較弱,料液比等高線曲線較密集,而加酶量等高線曲線較稀疏,表現(xiàn)為相對于加酶量對Y值的影響,料液比對Y的影響較顯著。

從圖5(c)可看出,隨著浸提液pH的變化,Y值先增大后減小,變化幅度較大,曲線較為陡峭,而隨著加酶量的變化Y值也有所變化,但是變化幅度相比于浸提液pH較小,曲線較平緩,浸提液pH與加酶量的交互作用較強(qiáng),表現(xiàn)為浸提液pH對響應(yīng)值Y的影響較顯著,而加酶量對Y值影響相對較小。

2.3.3最優(yōu)工藝條件的預(yù)測及驗(yàn)證Design-Expert V8.0.6對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析預(yù)測得:因素影響大小順序?yàn)?浸提液pH>料液比>加酶量;響應(yīng)值Y的最佳工藝參數(shù)為:料液比1∶2.02、浸提液pH5.49、加酶量1.00%,此條件下預(yù)測Y值為8.8748,粗多糖得率為0.92%,多糖含量為9.75%。根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)的可操作性,將工藝參數(shù)修正為:料液比1∶2、浸提液pH5.5、加酶量1.00%,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到粗多糖得率為0.91%,多糖含量為9.8%,與理論值相比,相對誤差為0.4%,與模型值接近,優(yōu)化結(jié)果可靠。

3　結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計以料液比、浸提液pH、加酶量為三因素,Y為響應(yīng)值,對南海鳶烏賊墨汁多糖的提取進(jìn)行優(yōu)化,得出鳶烏賊墨多糖的最佳提取工藝參數(shù)為:料液比1∶2、浸提液pH5.5、加酶量1.00%,此條件下粗多糖得率為0.91%,多糖含量為9.8%,采用響應(yīng)面法優(yōu)化鳶烏賊墨多糖提取工藝,取得最佳提取工藝,且具有可行性。

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Optimization of extraction technology polysaccharide from the ink of theSthenoteuthisoualaniensisin South China Sea by response surface methodology

YANG Li-zhi1,2,YANG Xian-qing1,*,HUANG Hui1,LI Lai-hao1,DENG Jian-chao1,ZHAO Yong-qiang1,YANG Shao-ling1

(1.Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture,National R & D Center for Aquatic Product Processing,South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Science,Guangzhou 510300,China;2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Objective:To explore the optimum extraction process of polysaccharide from the ink of theSthenoteuthisoualaniensisin South China Sea,response surface methodology(RSM)was employed to optimize extraction process of polysaccharide from the ink of theSthenoteuthisoualaniensis. Methods:Experiment factors and levels were first selected on the ground of single factor experiment .Along with the center combination experiment design principle,three factors and three levels of response surface analysis were adopted to obtain a multiple quadratic linear regression equation and analyzed the interaction among factors chosen Y(polysaccharide content×total sugar quality,100 g ink extraction product of quality of crude polysaccharide and total sugar content%)as the response value. Results:The optimum extraction conditions of polysaccharide from the ink of theSthenoteuthisoualaniensisin South China Sea were concluded as follows:ratio of solid to liquid 1∶2,water extract pH5.5,enzyme concentration 1.00%. Under this condition,polysaccharide content and crude polysaccharide extraction yield value of polysaccharide from the ink of theSthenoteuthisoualaniensiswas 9.8% and 0.91% respectively. Conclusion:The RSM was employed to optimize extraction process of polysaccharide from the ink,which had feasibility and good effect.

Sthenoteuthisoualaniensis;ink polysaccharide;extraction;response surface methodology

2016-01-18

楊麗芝(1989-),女,碩士,研究方向:水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全,E-mail:yanglizhi926@126.com。

楊賢慶(1963-),男,研究員,研究方向:水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全,E-mail:yxqgd@163.com。

農(nóng)業(yè)部財政重大專項(xiàng)(NFZX2013);南海漁業(yè)資源調(diào)查與評估。

TS254.1

B

1002-0306(2016)18-0292-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.047