張　帥,邱　鵬,龍秀鋒,侯燕燕,魯鳳娟,張鶴銘,田永強(qiáng)

(四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,四川成都 610065)

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耐鹽芽孢桿菌B11抗菌活性物質(zhì)的分離純化及其特征分析

張帥,邱鵬,龍秀鋒,侯燕燕,魯鳳娟,張鶴銘,田永強(qiáng)*

(四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,四川成都 610065)

對耐鹽芽孢桿菌B11產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行了分離純化及特性研究。從鹽堿土壤中分離得到一株對金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)拮抗活性的耐鹽芽孢桿菌B11,其發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和紫外光照穩(wěn)定性,100 ℃加熱1 h,抑菌活性僅下降11.0%,且在pH為3和11環(huán)境下,抑菌活性也僅下降11.4%和10.9%,對酸堿環(huán)境具有耐受性。發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理、離心、陽離子陰離子交換層析,經(jīng)正丁醇抽提和半制備高效液相色譜得到活性物質(zhì)A1和A2,其中A1分子量為1423.8 u且?guī)в卸嚯姾?氨基酸分析儀鑒定A1為非核糖體多肽(NRPS),對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為8.0 μg/mL;A2活性很弱且含量較低,初步鑒定為小分子抗菌物質(zhì),分子量為373 u。耐鹽芽孢桿菌B11的抗菌代謝產(chǎn)物應(yīng)用于食品防腐具有很大的潛力。

耐鹽芽孢桿菌,金黃色葡萄球菌,分離純化,NRPS

金黃色葡萄球菌是食品主要污染菌之一,在我國多地食品檢測中均有報道[1-2],可引起許多嚴(yán)重感染,如偽膜性腸炎、肺炎和心包炎等多種疾病[3-4]。由于近幾十年抗生素的超量濫用所導(dǎo)致耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的出現(xiàn),使金黃色葡萄球菌所導(dǎo)致的發(fā)病率迅速增高[5],因此在研究有效的治療方案同時,積極尋找新型抗金黃色葡萄球菌的物質(zhì),從食品等傳播源頭進(jìn)行防治結(jié)合顯得尤為緊迫。

近年來,人們對極端環(huán)境的微生物開展了廣泛的研究,并在Bacillus、Photobacterium、Burkholderia、Aeromonas、Pseudomonas等耐鹽細(xì)菌的常見種群中都發(fā)現(xiàn)了具有抗菌活性菌株的存在[6-7],但對其次級代謝產(chǎn)物的報道卻較為有限。迄今為止,僅有少數(shù)耐鹽細(xì)菌的抗菌活性物質(zhì)被分離純化,其中包括B.licheniformisBAS50產(chǎn)生的具有表面活性劑作用的脂肽類化合物lichenysin A[8]、L.lactis69產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素[9],H.litoralisYS3106產(chǎn)生的三種具有抗真菌活性的環(huán)肽[10],B.subtilisSK.DU.4產(chǎn)生的兩種抗革蘭氏陽性菌的多肽[11]等肽類抗菌化合物和P.variabilis產(chǎn)生的一組具有抗腫瘤作用的吩嗪類化合物Pelagiomicins A-C[12],B.methylotrophicusMHC10產(chǎn)生的具有廣譜抑菌活性的氫醌類化合物[13]等非肽類抗菌活性物質(zhì),這與已報道的從其它普通環(huán)境中分離的天然產(chǎn)物相比,種類和數(shù)量都還太少,故將鹽堿環(huán)境中微生物的次級代謝產(chǎn)物應(yīng)用于食品防腐將具有很大的潛力。本課題組前期從鹽堿土壤中篩選到一株對金黃色葡萄球菌具有明顯抑制活性的耐鹽芽孢桿菌B11,并對其進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化(另文發(fā)表)。在此基礎(chǔ)上通過對B11抗菌活性物質(zhì)的分離純化和分析鑒定,旨在為將極端環(huán)境中的微生物資源應(yīng)用于食品防腐奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

芽孢桿菌B11由新疆莎車縣鹽堿土壤中分離篩選獲得；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)SIIA1005、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)SIIA1007、大腸桿菌(Escherichiacoli)SIIA1006、白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC90028、肺炎克雷氏菌(Klebsiellapneumoniae)SIIA725等均由四川抗菌素工業(yè)研究所微生物資源中心提供;Q-Sepharose FF、SP-Sepharose FF美國GE公司;Daisogel-C18-10 μm型制備色譜柱北京創(chuàng)新通恒科技有限公司;Amethyst C18-H色譜柱賽分科技有限公司;Tris base、甘氨酸上海生工生物技術(shù)有限公司;色譜級乙腈、色譜級甲酸成都市科龍化工試劑廠;其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

A300自動氨基酸分析儀曼莫博爾公司;Biotech-5L自動發(fā)酵罐上海寶興生物設(shè)備工程有限公司;LDZX-40BI型電熱蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;LC3000型高效液相色譜儀北京創(chuàng)新通恒科技有限公司;PHS-3C型酸度計上海精密科學(xué)儀器廠;蛋白層析柱美國Bio-Rad公司;HPS-160生化培養(yǎng)箱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司;TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī)湘儀離心機(jī)儀器有限公司;QYC2112旋轉(zhuǎn)式搖床上海福瑪公司;ZQ 4000型質(zhì)譜儀美國Waters公司。

1.2培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基:酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L,瓊脂粉15 g/L,pH7.0±0.2。

種子培養(yǎng)基:酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L,pH7.0±0.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基:可溶性淀粉15 g/L,黃豆粉15 g/L,NaCl 15 g/L,pH為未調(diào)節(jié)的自然pH。其中,發(fā)酵培養(yǎng)基為前期優(yōu)化實(shí)驗得到的抗菌活性最佳培養(yǎng)基。

1.3實(shí)驗方法

1.3.1菌種活化及發(fā)酵參照張麗姣等[14]的方法對菌株B11進(jìn)行活化并制備種子液,然后按2.5%的接種量將種子液接到4 L的發(fā)酵罐中,控制溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,發(fā)酵48 h,得到發(fā)酵液。將一定量的發(fā)酵液于8000 r/min離心10 min,得到的發(fā)酵液上清用于抗菌穩(wěn)定性研究。

1.3.2發(fā)酵上清液的穩(wěn)定性

1.3.2.1熱穩(wěn)定性將1 mL發(fā)酵上清分別置于20、40、60、80和100 ℃下處理1 h,以金黃色葡萄球菌為指示菌,未處理的20 ℃發(fā)酵上清為對照,采用杯碟法[15]測定其熱穩(wěn)定性。

1.3.2.2pH穩(wěn)定性取2 mL發(fā)酵上清液,將其pH分別調(diào)為3.0、5.0、7.0、9.0和11.0,室溫靜置1 h。以金黃色葡萄球菌為指示菌,未處理的pH7.0發(fā)酵上清為對照,采用杯碟法檢測其酸堿穩(wěn)定性。

1.3.2.3紫外光照穩(wěn)定性將5 mL發(fā)酵上清置于紫外燈下分別照射(照射距離10 cm)0、4、8、12和16 h取樣,以金黃色葡萄球菌為指示菌,未處理的發(fā)酵上清為對照,采用杯碟法檢測其紫外光照穩(wěn)定性。

1.3.3活性物質(zhì)的分離

1.3.3.1菌株發(fā)酵液預(yù)處理將收集到的發(fā)酵液用6 mol/L的濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0,冷藏于4 ℃靜置過夜,然后8000 r/min離心20 min,收集上清液備用。

1.3.3.2活性物質(zhì)的分離純化將收集的上清液上樣于用10 mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0)預(yù)平衡的SP-Sepharose FF柱,用1 mol/L氯化鈉的磷酸緩沖液(pH6.0、10 mmol/L)洗脫,分步收集具有抗菌活性的洗脫峰。將此洗脫峰調(diào)節(jié)pH到9.0,上樣于10 mmol/L磷酸緩沖液(pH8.0)預(yù)平衡Q-Sepharose FF柱,用1 mol/L氯化鈉的磷酸緩沖液(pH8.0、10 mol/L)洗脫,收集具有抗菌活性的洗脫峰。在收集的洗脫峰樣品中加入等體積的正丁醇抽提多次,直到溶液中的活性物質(zhì)被完全提取。正丁醇溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中于50 ℃減壓蒸干,得到固體樣品。

1.3.3.3高效液相色譜制備純品色譜柱為Daisogel-C18(30 mm×250 mm,10 μm),流動相為乙腈和0.15%甲酸水(v/v),梯度洗脫程序見表1,紫外檢測波長為254 nm,柱溫為25 ℃,流速為20 mL/min,收集抗菌活性峰樣品并進(jìn)行減壓濃縮。

表1　梯度洗脫程序

1.3.4抗菌物質(zhì)的分析檢測

1.3.4.1活性物質(zhì)的質(zhì)譜檢測半制備HPLC分離純化的抗菌活性物質(zhì),用氘代甲醇溶解后,使用ESI-MS檢測其分子量及純度。

1.3.4.2活性物質(zhì)氨基酸組成的分析分離純化得到的樣品用6 mol/L的HCl于110 ℃水解24 h,然后將水解液全部蒸干,加5 mL 0.02 mol/L的HCl溶解后,0.22 μm濾膜過濾,上A300型氨基酸自動分析儀進(jìn)行氨基酸組成分析。

1.3.4.3抗菌活性峰的抑菌譜測試取金黃色葡萄球菌SIIA1005、枯草芽孢桿菌SIIA1007、大腸桿菌SIIA1006、白色念珠菌ATCC90028、肺炎克雷氏菌SIIA725作為測試菌株,取經(jīng)過適當(dāng)稀釋的抗菌純品物質(zhì),采用雙層平板法[16]檢測其抑菌活性,每個測試菌株設(shè)3次重復(fù)。

1.3.4.4最小抑菌濃度(MIC)的測定實(shí)驗采用倍比稀釋法將純化后的抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行稀釋,使其終濃度為128～0.125 μg/mL,并分別加入50 μL到指示菌平板上,觀察抑菌圈的出現(xiàn)情況。陰性對照為無菌水,陽性對照為氨芐青霉素,每個處理3個平行。將指示菌平板置于37 ℃培養(yǎng)12 h,能抑制培養(yǎng)基內(nèi)指示菌生長的最低濃度即為MIC值[17]。

1.3.5統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理實(shí)驗數(shù)據(jù),單因素方差分析進(jìn)行顯著性實(shí)驗,并用LSD法進(jìn)行組間的差異性比較,p<0.05表示差異顯著而具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株B11發(fā)酵上清抗菌穩(wěn)定性研究

熱穩(wěn)定性結(jié)果見圖1(a)。經(jīng)SPSS 19.0分析,在溫度為20～100 ℃時,菌株B11發(fā)酵上清的抗菌活性無顯著性差異(p>0.05),表明其熱穩(wěn)定性良好,且抗菌物質(zhì)對100 ℃高溫有一定的耐受性,抗菌活性與對照(20 ℃)相比僅下降11.0%。pH為7.0時,上清液對金黃色葡萄球菌的抗菌活性最強(qiáng),在pH為3.0和11.0條件下,抗菌活性與對照(pH=7)相比下降11.4%和10.9%,在p<0.05水平上差異不顯著,說明菌株B11發(fā)酵液的抗菌活性具有良好的酸堿耐受性(圖1b)。此外,該菌發(fā)酵上清液經(jīng)紫外光照射,和原液進(jìn)行對比,其抑菌活性無明顯變化(圖1c)(p>0.05)。

圖1　菌株B11發(fā)酵上清液的抗菌穩(wěn)定性Fig.1　Antimicrobial stability of fermentation supernatant of Bacillus sp. B11

2.2活性物質(zhì)的分離純化

2.2.1陽離子交換層析從圖2可知,SP-Sepharose FF柱上洗脫出兩個吸收峰,通過分段收集并進(jìn)行抗菌活性檢測,可知抗菌活性峰主要集中在125～150 min之間。經(jīng)強(qiáng)陽離子層析交換,可初步達(dá)到抗菌活性物質(zhì)的富集和純化,使樣品的體積濃縮了3倍。

圖2　SP-Sepharose FF強(qiáng)陽離子交換層析譜圖Fig.2　The chromatogram of SP-Sepharose FF cation-exchange chromatography

2.2.2陰離子交換層析將從陽離子交換柱洗脫下來的活性物質(zhì)上Q-Sepharose FF離子交換柱,得到的洗脫曲線如圖3所示,分別在27 min和38 min處出現(xiàn)洗脫峰,收集兩個峰樣品進(jìn)行抗菌活性測試,得知抗菌活性物質(zhì)包含在38 min的吸收峰內(nèi)。通過陰離子交換,進(jìn)一步純化和濃縮了樣品。

圖3　Q-Sepharose FF 強(qiáng)陰離子交換層析譜圖Fig.3　The chromatogram of Q-Sepharose FF anion-exchange chromatography

2.2.3正丁醇抽提和旋蒸濃縮將陰離子交換層析收集的38 min吸收峰處樣品,用等體積正丁醇抽提多次,合并提取液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,得到淺黃色固體,總量約200 mg。正丁醇抽提去掉了不溶于正丁醇的雜質(zhì)和離子交換層析帶入的鹽分。

2.2.4半制備高效液相收集旋蒸得到的固體經(jīng)去離子水溶解后,進(jìn)行半制備高液收集純品(圖4),可以看到在22 min左右有一個相當(dāng)高的峰出現(xiàn),其原因可能是含量太高導(dǎo)致出現(xiàn)了平頭峰。為了保證樣品的純度,實(shí)驗選擇在該峰的峰尖進(jìn)行收集(即收集在2000 mV吸收值以上的液體),并對主峰后面出現(xiàn)的小峰也分別收集和活性檢測。通過活性檢測知22 min處的峰具有很強(qiáng)的活性,而36 min處的小峰雖也具活性但活性很弱且收集的量很少。對收集到的活性峰樣品進(jìn)行蒸干濃縮后,可知約4 L的發(fā)酵液經(jīng)分離純化后共得到29 mg活性純品物質(zhì),其中22 min處的活性物質(zhì)A1約28 mg,36 min處活性物質(zhì)A2約1 mg。

圖4　抗菌物質(zhì)的制備液相色譜上的分離Fig.4　Purification of antimicrobial substances on preparative HPLC

2.3抗菌物質(zhì)的分析檢測

2.3.1抗菌活性物質(zhì)的分子質(zhì)量通過ESI-MS檢測(見圖5),在A1的質(zhì)譜圖中共出現(xiàn)兩組峰,分別選取其中最高的峰,質(zhì)荷比為712.9 和1424.8,由于存在兩倍關(guān)系可判斷其分別為[M+2H]2+和[M+H]+,所以得到A1的分子量為1423.8 u;又因其分子質(zhì)量較大,且?guī)в卸嚯姾?可初步判斷該抗菌組分可能為多肽。又測得A2的分子量為373 u,但由于其活性較小且含量太少,則還需進(jìn)行后續(xù)的純化和收集樣品分析。

圖5　抗菌物質(zhì)A1和A2的質(zhì)譜圖Fig.5　Mass spectra of antimicrobial substance A1 and A2

2.3.2抗菌多肽氨基酸組成的分析將抗菌肽A1的氨基酸組成譜圖與標(biāo)準(zhǔn)混合樣進(jìn)行對照,根據(jù)保留時間的一致性,可確定樣品中的氨基酸的組成(圖6)。標(biāo)準(zhǔn)混合樣品的上樣量為20 μL,其中每種游離氨基酸的含量為2 nmol,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)混合樣中每種氨基酸的峰面積及校正因子可計算樣品中各個氨基酸殘基量。

圖6　氨基酸分析譜圖Fig.6　The spectrogram of amino acid analysis注:圖A為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合樣圖譜,圖B為樣品A1的水解產(chǎn)物圖譜;1.Asp，2.Glu，3.Cys，4.Ile，5.Leu，6.Phe，7.His，8.Orn，9.Lys，10.。

表2　抗菌肽A1的氨基酸組成分析

由表2可知,抗菌肽A1經(jīng)過水解后,共得到天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、組氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸和賴氨酸9種氨基酸。由于酸水解會使天冬酰胺和谷氨酰胺脫?；?并分別氧化為天冬氨酸和谷氨酸,且測試結(jié)果中含有天冬氨酸和谷氨酸,所以樣品中也可能含有天冬酰胺和谷氨酰胺這兩種氨基酸。鑒定結(jié)果中出現(xiàn)了非天然氨基酸鳥氨酸,而在核糖體合成的多肽和蛋白質(zhì)中不具有鳥氨酸殘基[18],所以初步鑒定抗菌活性物質(zhì)可能為非核糖體合成的多肽。

2.3.3純化后抗菌肽的抑菌活性對分離得到的純品A1進(jìn)行抗菌活性譜的測試結(jié)果見表3。由測試結(jié)果可以看出,分離得到的非核糖體多肽A1對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性致病菌具有強(qiáng)的抑菌活性,對大腸桿菌、肺炎克雷氏菌等革蘭氏陰性致病菌和白色念珠菌等病源真菌無抑制活性。

表3　抗菌肽A1的抗菌譜

注:++表示抑菌圈直徑在15～20 mm,+++表示抑菌圈直徑在20～25 mm,-表示無抑菌活性。

2.3.4最小抑菌濃度的測定以金黃色葡萄球菌為指示菌檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)抗菌活性物質(zhì)濃度小于8.0 μg/mL時,指示菌平板上無抑菌圈產(chǎn)生;當(dāng)抗菌活性物質(zhì)濃度大于8.0 μg/mL時,平板上出現(xiàn)抑菌圈,且隨著抗菌活性物質(zhì)濃度的增大抑菌圈直徑逐漸增大。因此,純化的抗菌肽對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為8.0 μg/mL,稍弱于陽性對照氨芐青霉素(6.25 μg/mL)。

3　討論

通過對耐鹽芽孢桿菌B11的活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化,得到對革蘭氏陽性致病菌具有明顯抑制作用的A1,并經(jīng)鑒定為非核糖體多肽(NRPS),這與Biscola等[9]分離得到的核糖體多肽類抗菌化合物和Jeyanthi等[12]分離得到的非肽類抗菌化合物存在差異。對于耐鹽菌所產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的多樣性,可能是由于耐鹽細(xì)菌特殊的生存環(huán)境,使其形成了獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu)和代謝途徑,從而可產(chǎn)生肽類[8-9,11](核糖體肽和非核糖體肽)、芳烴類[12-13]和聚酮類[19-20]等多種類型的抗菌活性物質(zhì)。實(shí)驗?zāi)壳爸煌瓿闪四望}芽孢桿菌B11所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的分離純化和初步鑒定,下一步還需通過其它表征手段(碳譜、氫譜和二維譜等)明確抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu),同時探求其抑菌機(jī)制及在細(xì)胞內(nèi)的合成機(jī)理,從而使極端環(huán)境微生物的代謝物能更好的在食品防腐領(lǐng)域得到應(yīng)用。

4　結(jié)論

通過陽離子交換層析、陰離子交換層析、正丁醇抽提和旋蒸濃縮、半制備高效液相色譜從預(yù)處理后的耐鹽芽孢桿菌B11發(fā)酵液中分離純化得到2個具有抗菌活性組分A1和A2,并通過質(zhì)譜檢測得到其分子量分別為1423.8 u和373 u。A1分子量較大并帶有多電荷可判斷為多肽,氨基酸分析測得其含有9種氨基酸,因氨基酸組成中含有鳥氨酸,可初步鑒定A1為非核糖體多肽(NRPS)類抗菌物質(zhì),對革蘭氏陽性致病菌有強(qiáng)的抗菌活性,所表現(xiàn)的抗菌活性具有良好的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和紫外光照穩(wěn)定性?？咕腁1對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較高的抑菌活性,MIC為8.0 μg/mL。A2分子量為373 u,可初步鑒定為小分子抗菌物質(zhì)。

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Isolation and purification of antimicrobial substance fromBacillussp. B11 and analysis of its properties

ZHANG Shuai,QIU Peng,LONG Xiu-feng,HOU Yan-yan,LU Feng-juan,ZHANG He-ming,TIAN Yong-qiang*

(Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering,Ministry of Education and College of Light Industry,Textile & Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

Study the purification and characterization of antimicrobial substance fromBacillussp. B11. A halotolerant bacterium B11 isolated from saline-alkali soil showed strongly antagonistic againstStaphylococcusaureus,and its antimicrobial substance showed excellent stability towards pH,temperature and ultraviolet. The antimicrobial activity was not influenced disposing for 1 h under 100 ℃,and only 11.0% loss of activity was suffered. After treatment at pH3 and pH11,antimicrobial activities decreased 11.4% and 10.9%,respectively,which indicated the antimicrobial substance ofBacillussp. B11 was stable to acid and alkali. Fermentation broth was used to isolate antimicrobial substances with a procedure involving pretreatment of fermentation broth,cation-exchange chromatography,anion-exchange chromatography,rotary evaporation after butanol extraction,and preparative HPLC on C18 column. Two elution peaks,named A1 and A2,which possessed the antimicrobial activity were eluted with preparative HPLC,and the molecular weight of multi-charge A1 was 1423.8 u. The purified antimicrobial peptide A1 was determined as non-ribosomal synthetic peptide(NRPS)by amino acid analyzer,and its minimum inhibitory concentration againstStaphylococcusaureuswas 8.0 μg/mL. At the same time,the antimicrobial substance A2 was determined as low-molecular-weight antibiotic substance combined its antimicrobial activity and molecular mass,and its molecular mass was 373 u. Therefore,the antibacterial metabolites from halotolerant bacterium B11 may have potential application in food industry.

salt-tolerant bacillus;Staphylococcusaureus;isolation and purification;NRPS

2016-03-23

張帥(1991-)，男，碩士研究生，研究方向:微生物藥學(xué)，E-mail:zsscuu@163.com。

田永強(qiáng)(1971-)，男，副教授，研究方向:生物工程，E-mail:yqtian@scu.edu.cn。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金資助 (SCU2015D008)；四川應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目 (2014JY0199)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)18-0256-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.040