崔　玨,孫會剛,朱兆麗,婁雪蓮

(1.徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院,江蘇徐州 221111;2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇徐州 221111)

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酸菜中降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選、鑒定及其在發(fā)酵香腸中的應(yīng)用

崔玨1,2,孫會剛1,2,朱兆麗1,婁雪蓮1

(1.徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院,江蘇徐州 221111;2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇徐州 221111)

目的:依據(jù)多項(xiàng)評價指標(biāo)篩選亞硝酸鹽降解能力強(qiáng)且適用于肉制品發(fā)酵的乳酸菌。方法:首先采用添加0.3% CaCO3的MRS培養(yǎng)基從15份不同產(chǎn)地的農(nóng)家自制酸菜中篩選乳酸菌,其后以降解亞硝酸鹽能力和肉制品發(fā)酵劑所需要求為篩選指標(biāo)對初篩所得乳酸菌進(jìn)行復(fù)篩,并對其進(jìn)行菌種的分子鑒定。最后以篩選到的菌株為發(fā)酵劑制作單菌株發(fā)酵香腸,通過檢測香腸在發(fā)酵和貯藏期間的NaNO2含量來進(jìn)一步驗(yàn)證所得菌株的實(shí)際降解亞硝酸鹽能力。結(jié)果:篩選到1株降解亞硝酸鹽能力優(yōu)良(降解率為78.77%)且適于肉制品發(fā)酵的乳酸菌菌株,16S rDNA全序列分析鑒定為鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG,ATCC 53103)。香腸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在發(fā)酵結(jié)束時香腸的NaNO2含量為12.2 mg/kg,低于國家標(biāo)準(zhǔn)。同時,微生物指標(biāo)檢測結(jié)果證明了此條件下生產(chǎn)的發(fā)酵香腸的質(zhì)量是安全可靠的。結(jié)論:鼠李糖乳桿菌能有效降低發(fā)酵香腸中的NaNO2含量,可用于開發(fā)成用于生產(chǎn)低亞硝酸鹽的健康、安全的肉品發(fā)酵劑。

酸菜,乳酸菌,亞硝酸鹽,發(fā)酵香腸

食品中過量添加亞硝酸鹽的致癌風(fēng)險(xiǎn)已被多項(xiàng)研究證明,然而由于其在加工肉類制品中具有發(fā)色、抑菌、抗氧化、增加風(fēng)味等作用,目前還很難找到完美的替代物質(zhì),因此在肉制品生產(chǎn)中還在廣泛使用[1-2]。食品中亞硝酸鹽的危害主要是由于其可分解生成亞硝基,而亞硝基可與蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物仲胺類化合物結(jié)合生成亞硝胺,而亞硝胺是一種極強(qiáng)的致癌物質(zhì),長期攝入可誘發(fā)多種消化道癌癥[3-4]。2015年,加工類肉制品已被世衛(wèi)組織列為一級致癌物,主要就是因?yàn)閬喯跛猁}的添加。因此,尋找能有效降低肉制品中亞硝酸鹽的方法是近年來研究的熱點(diǎn)。目前降低肉制品中的亞硝酸鹽的方法主要有化學(xué)法和生物法兩類,化學(xué)法是通過添加由發(fā)色劑、抗氧化劑、多價鰲合劑和抑菌劑混合組成的添加劑來替代亞硝酸鹽在肉制品的添加。生物法則是利用微生物產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶來降解亞硝酸鹽或通過微生物產(chǎn)酸降低環(huán)境pH來促進(jìn)亞硝酸鹽分解為NO,從而達(dá)到降低肉制品中亞硝酸鹽含量的目的[5-6]。

乳酸菌是一類能夠進(jìn)行糖發(fā)酵,產(chǎn)生代謝產(chǎn)物乳酸的革蘭式陽性細(xì)菌,其作為發(fā)酵劑已經(jīng)在發(fā)酵香腸的生產(chǎn)過程中廣泛使用幾百年。乳酸菌在肉制品的加工過程中,由于其可將糖類物質(zhì)分解形成乳酸而降低肉制品中的pH,從而有效降解肉制品中的亞硝酸鹽,同時還可抑制腐敗菌和致病菌的生長[7-8]。目前多項(xiàng)研究已從自然發(fā)酵食品中篩選到多種具有降解亞硝酸能力的微生物,大多數(shù)為乳酸菌,主要包括植物乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、泡菜乳酸菌等,并將其作為發(fā)酵劑用于生產(chǎn)各式發(fā)酵香腸[9-10]。為了篩選到具有更高降解活性的乳酸菌,本研究以亞硝酸鹽降解能力為主要篩選指標(biāo)從不同產(chǎn)地的農(nóng)家自制的酸菜中篩選降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)同時適用于肉制品發(fā)酵的乳酸菌,并以其為發(fā)酵劑進(jìn)行單菌株發(fā)酵香腸的制作,通過測定香腸發(fā)酵期和貯藏期的亞硝酸鹽含量,對其降解亞硝酸鹽的能力進(jìn)行驗(yàn)證,以期為開發(fā)、生產(chǎn)健康、安全的加工肉制品提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

酸菜分別產(chǎn)自貴州、重慶、四川、云南、湖南、吉林的農(nóng)家自制酸菜;菌株篩選、培養(yǎng)、生化鑒定所采用的培養(yǎng)基均按文獻(xiàn)方法配制[11];豬后腿肉、肥膘、腸衣市售;胡椒粉、食鹽、蔗糖、葡萄糖、亞硝酸鈉均為食品級。

SHP-150型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海精宏設(shè)備有限公司;全自動立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;超凈工作臺上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;721G分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C酸度計(jì)上海雷磁。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1乳酸菌篩選分別稱取15份酸菜樣品各20 g,在無菌條件下加入180 mL無菌蛋白胨水制備成10倍稀釋液,4 ℃保存?zhèn)溆?。將上述稀釋液稀?05后,取0.1 mL涂布于添加0.3% CaCO3的固體MRS培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后,挑取具有較大溶鈣圈的單菌落。反復(fù)劃線進(jìn)行分離純化,直至顯微觀察下菌體一致。挑取純菌進(jìn)行革蘭氏染色,選取革蘭氏陽性和觸酶陰性菌株,于25～32 ℃厭氧培養(yǎng)48 h保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2具有降解亞硝酸鹽能力菌株篩選將上述分離到的乳酸菌菌株按10 mL/kg接種量取種齡為18 h的種子,接種于200 mL含125 μg/mL NaNO2,pH6.0的液體MRS培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)。24 h后,檢測培養(yǎng)基中的NaNO2含量,用亞硝酸鹽降解率來表示菌株降解亞硝酸鹽的能力。亞硝酸鹽含量測定方法參考國標(biāo)鹽酸萘乙二胺法[12]。亞硝酸鹽降解率根據(jù)以下公式計(jì)算:

亞硝酸鹽降解率(%)=最初亞硝酸鹽含量-殘留的亞硝酸鹽含量/最初亞硝酸鹽含量×100

1.2.3篩選菌株發(fā)酵特性測試以生產(chǎn)發(fā)酵香腸為目標(biāo),通過耐鹽性實(shí)驗(yàn)、耐硝性實(shí)驗(yàn)、24 h產(chǎn)酸能力實(shí)驗(yàn)、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)粘液實(shí)驗(yàn)、氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)胺實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步篩選符合肉品發(fā)酵要求的乳酸菌菌株,實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[9]。

1.2.4篩選菌株的16S rDNA全序列分析將按上述方法篩選獲得的菌株進(jìn)行培養(yǎng),提取菌株的DNA,采用16S rDNA細(xì)菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增、測序,測序工作由中美泰和生物技術(shù)有限公司完成。所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中利用BLAST進(jìn)行在線同源性比對,并將比對結(jié)果中最相似菌株序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.5乳酸菌菌株在發(fā)酵香腸中的應(yīng)用將原料肉去除不宜加工和影響產(chǎn)品質(zhì)量的部分后,絞碎并按比例(瘦肉∶肥肉=8∶2)混合,按肉重加入2.8%鹽、0.5%蔗糖、0.015% NaNO2、1%香辛料進(jìn)行充分混合后,置于4 ℃環(huán)境下,腌制24 h。然后按肉重2%進(jìn)行接種處于對數(shù)生長期的發(fā)酵劑,使接種量達(dá)到106CFU/g以上。接種后的肉料,充填于豬腸衣內(nèi)。經(jīng)灌腸后的濕香腸,在55 ℃短暫烘干腸衣外部水分后置于30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行24 h發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后,進(jìn)行14 d的干燥脫水(10 ℃、相對濕度70%)、成熟(15 d),待香腸成熟后即開始貯藏實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)是模擬在日常銷售的情況下,評價香腸的感官變化,因此貯藏溫度控制為20～30 ℃。

1.2.6發(fā)酵香腸在發(fā)酵期乳酸菌活菌數(shù)、pH、NaNO2含量測定在香腸發(fā)酵過程中,分別于0、4、8、12、16、20、24 h取樣,測定其乳酸菌活菌數(shù)、pH、NaNO2含量。乳酸菌活菌數(shù)測定:樣品在無菌條件下除去腸衣,稱取25 g樣品,剪碎后加入225 mL滅菌生理鹽水中,劇烈震蕩30 min,混勻后梯度稀釋,選擇合適的稀釋度傾注平板,30 ℃于MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)[13]。pH測定:將樣品絞碎后,準(zhǔn)確稱取10.00 g加入90 mL蒸餾水中,將樣品分散乳化,靜置30 min后過濾,取濾液用酸度計(jì)進(jìn)行pH的測定。NaNO2含量測定方法參照1.2.2。

1.2.7發(fā)酵香腸貯藏過程中的感官評價選擇香腸的中間部位,將樣品切為5 mm左右的薄片,10位食品專業(yè)的人員組成感官評定小組,以色澤20分、外觀20分、組織狀態(tài)30分、風(fēng)味30分為標(biāo)準(zhǔn)對貯藏期間的發(fā)酵香腸進(jìn)行感官評價,分?jǐn)?shù)匯總后,取平均值作為發(fā)酵香腸的感官評分,評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1　發(fā)酵香腸感官評價標(biāo)準(zhǔn)

1.2.8發(fā)酵香腸貯藏過程中霉菌、酵母菌、肉毒梭狀芽孢桿菌的檢測分別檢測貯藏第0周(香腸成熟時)、1周(第7 d)、2周(第14 d)、3周(第21 d)的菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌及酵母菌、肉毒梭狀芽孢桿菌數(shù)量,具體檢測方法參照國標(biāo)[14-17]。

1.3數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel和SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1乳酸菌的初步篩選

從不同產(chǎn)地的農(nóng)家自制泡菜中,初步分離到12株能夠在添加了CaCO3的固體MRS培養(yǎng)基中生長并產(chǎn)生溶鈣圈的菌,對分離得到的各菌株用顯微鏡觀察其菌體形態(tài),同時進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2。

表2　初篩菌株鑒定結(jié)果

注:+表示陽性結(jié)果,-表示陰性結(jié)果;表3同。

如表2結(jié)果顯示,12株菌中除T3為革蘭氏陰性菌外,其他均為革蘭氏陽性菌且過氧化氫酶反應(yīng)陰性,初步確定11株菌均為乳酸菌。

2.2具有降解亞硝酸鹽能力菌株篩選

對11株分離到的乳酸菌菌株用含有亞硝酸鹽的MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng),進(jìn)一步篩選具有降解亞硝酸鹽能力的菌株,最終篩選到降解效果較好(降解率超過50%)的6株菌(圖1),其中編號為L1的菌株降解效果最好,亞硝酸鹽降解率達(dá)到78.77%。

圖1　菌株亞硝酸鹽降解率Fig.1　Nitrite degradation of lactic acid bacteria

2.3菌株發(fā)酵特性測試

以肉品發(fā)酵劑所需特性為篩選評價目標(biāo),篩選滿足能耐受6%NaCl和150 mg/kg NaNO2、24 h產(chǎn)酸能力較強(qiáng)、發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S、水解精氨酸不產(chǎn)氨、不具有氨基酸脫羧酶活性、不產(chǎn)粘液、不具有分解脂肪和蛋白質(zhì)的能力、不產(chǎn)H2O2、能夠抑制致病菌和腐敗菌的生長等條件的優(yōu)良菌株。結(jié)果見表3,綜合各項(xiàng)評價指標(biāo),菌株L1、W、T1符合篩選標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合降解亞硝酸鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最終選取菌株L1為最優(yōu)的肉品發(fā)酵劑,進(jìn)行菌株鑒定。

表3　菌株發(fā)酵特性測定

2.4L1菌株的16S rDNA全序列分析

序列比對結(jié)果見圖2,在比對匹配度最高的結(jié)果中,所測得的菌株L1的16S rDNA序列部分與Lactobacillussp.乳酸桿菌屬的不同菌種的16S rDNA序列有很高的同源性。其中,在與已知菌種的匹配中,與鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG,LGG)的序列相似度最高,因此確定L1菌株為LGG。LGG是全球廣受關(guān)注的益生菌之一,該菌相對于其他種類的益生菌有更強(qiáng)的動物消化道環(huán)境耐受能力和腸道定植能力,具有調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防和治療腹瀉和提高機(jī)體免疫力等功能[18-20]。目前對于LGG的開發(fā)多見于發(fā)酵乳制品和益生菌制劑,而其在發(fā)酵肉質(zhì)品中的應(yīng)用的研究還較少。因此,接下來將以LGG為發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵香腸中,進(jìn)一步檢測其在肉制品中的亞硝酸鹽降解能力。

圖2　菌株16S rDNA序列比對結(jié)果Fig.2　Results of 16S rDNA sequence alignment

圖3　香腸在發(fā)酵過程中的pH和乳酸菌活菌數(shù)變化Fig.3　pH and colony-forming unit in fermentation period of fermented sausage

2.5發(fā)酵香腸發(fā)酵過程中pH與乳酸菌活菌數(shù)變化

由圖3可知,在發(fā)酵期間,香腸的pH隨著發(fā)酵時間延長和乳酸菌菌數(shù)增加而快速下降,尤其是發(fā)酵8～12 h內(nèi)降低速度最快,到24 h達(dá)到最低值4.91。乳酸菌的活菌數(shù)在香腸發(fā)酵過程中逐漸增加,在8～12 h這段時間里生長速度達(dá)到最大值,在發(fā)酵20 h時活菌數(shù)達(dá)到最大值,數(shù)量超過108CFU/g。

2.6發(fā)酵香腸發(fā)酵和貯藏過程中NaNO2含量變化

為驗(yàn)證LGG在發(fā)酵香腸中的降解亞硝酸鹽的作用,實(shí)驗(yàn)檢測了香腸在發(fā)酵過程中的NaNO2含量(圖4),結(jié)果顯示,NaNO2含量在發(fā)酵期的12～16 h期間快速降低,相對于pH的快速下降時期有一定的滯后,隨后NaNO2含量減少速度逐漸放緩,到發(fā)酵結(jié)束時含量為12.2 mg/kg。在貯藏期間,NaNO2的含量繼續(xù)降低,最終貯藏3周的發(fā)酵香腸的NaNO2含量為6.3 mg/kg,遠(yuǎn)低于國家規(guī)定的殘留量30 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)。在進(jìn)行肉制品加工過程中,亞硝酸鹽作為發(fā)色劑在改善肉制品顏色方面具有重要作用,但過量使用亞硝酸鹽會導(dǎo)致NO-大量殘留,NO-在pH2～4的條件下可與次級胺類物質(zhì)可形成亞硝胺這種強(qiáng)致癌物質(zhì),已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)亞硝胺能誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動物發(fā)生癌變,特別是消化系統(tǒng)癌癥,例如食道癌、胃癌、結(jié)腸癌等。隨著人們對食品安全意識的提高,多項(xiàng)研究致力于開發(fā)能取代亞硝酸鹽的安全且高效的添加劑,研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌通過產(chǎn)生乳酸使肉制品的pH降低,生成游離亞硝酸,隨后分解為NO,而NO可與肉中的肌紅蛋白結(jié)合形成對熱穩(wěn)定的玫瑰色的亞硝基肌紅蛋白(NO-Hb),從而賦予產(chǎn)品明亮的鮮紅色,同時亞硝酸鹽分解還有利于提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全性[21-22]。

圖4　發(fā)酵香腸在發(fā)酵和貯藏過程中的NaNO2含量Fig.4　Concentration of NaNO2 in fermentation period and storage period of fermented sausage

2.7發(fā)酵香腸的感官評定

分別于貯藏開始時、第1周、第2周、第3周時對發(fā)酵香腸進(jìn)行感官評定,感官評分為10位評定人員打分的平均分。由表4可知,在發(fā)酵香腸的貯藏期間,發(fā)酵香腸的感官評分隨貯藏時間延長而逐漸下降,當(dāng)發(fā)酵香腸貯藏進(jìn)行到第3周時,各組發(fā)酵香腸的顏色變?yōu)榛壹t,光澤變淡,切面光澤略微發(fā)暗,與貯藏初期相比彈性略微下降,但氣味正常,有淡淡的芳香,仍可食用。

表4　發(fā)酵香腸感官評定結(jié)果

2.8香腸貯藏期內(nèi)腐敗菌與致病菌檢測

由表5中數(shù)據(jù)可知,發(fā)酵香腸在貯藏期內(nèi)由于水活度較低和乳酸菌生成乳酸造成的pH較低的環(huán)境,使得大腸菌群、霉菌和酵母菌以及肉毒梭狀芽孢桿菌等微生物生長受到抑制,各項(xiàng)微生物指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)(菌落總數(shù)≤50000 CFU/g,大腸菌群≤30 CFU/100 g,致病菌不得檢出),由此可推測發(fā)酵香腸具有較高的安全性,不易受到外源性腐敗菌和致病菌的污染,但由于整個產(chǎn)品未經(jīng)高溫蒸煮滅菌,仍存在被污染的風(fēng)險(xiǎn),這需要對產(chǎn)品生產(chǎn)的原料的質(zhì)量和生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生要嚴(yán)格把關(guān),以減少微生物污染的發(fā)生。

表5　香腸中腐敗菌和致病菌檢測

3　結(jié)論

本研究從酸菜中分離到了1株具有較好的降解亞硝酸鹽能力,且適于肉品發(fā)酵的乳酸菌菌株,16S rDNA全序列分析鑒定為鼠李糖乳桿菌。以鼠李糖乳桿菌為發(fā)酵劑生產(chǎn)的發(fā)酵香腸在發(fā)酵期結(jié)束時的NaNO2含量為12.2 mg/kg。貯藏期間香腸的NaNO2含量繼續(xù)降低,最終貯藏3周的發(fā)酵香腸的NaNO2含量為6.3 mg/kg,遠(yuǎn)低于國家規(guī)定的殘留量30 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn),說明鼠李糖乳桿菌在發(fā)酵肉制品中具有較好的亞硝酸鹽降解能力,同時微生物指標(biāo)也證明了此條件生產(chǎn)的發(fā)酵香腸安全可靠。此研究為今后的鼠李糖乳桿菌在加工生產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)良、安全的發(fā)酵肉制品的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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Isolation and identification of nitrite-degrading lactic acid bacteria from pickles and application in fermented sausage

CUI Jue1,2,SUN Hui-gang1,2,ZHU Zhao-li1,LOU Xue-lian1

(1.College of Food Engineering,Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221111,China;2.Jiangsu Key Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe,Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221111,China)

Objective:To screen lactic acid bacteria from pickles,which could decompose nitrite in sausage. Methods:At first,lactic acid bacteria were screened from 15 different regional pickles,using MRS medium which add 0.3% CaCO3. Secondly,further experiments were executed according to nitrate degradation efficiency and standards of meat starter,and the bacterial strain which acquired from experiment was identified by using 16S rRNA encoding gene(16S rDNA)sequence.At last,fermented sausages were produced using the lactic acid bacteria asa starter,and concentrations of NaNO2in fermentation and storage period were detected. Results:One strain of lactic acid bacteria meetsthe standards,and it was identified to be 100% similar toLactobacillusrhamnosusGG. The nitrite concentration in fermented sausage was 12.2 mg/kg. At the same time,the results of microbiological detection demonstrated that with this condition,quality of the fermented sausage was safe.Conclusion:LactobacillusrhamnosusGG could significantly eliminate the nitrite in fermented sausage,and could be used as an efficient and healthy starter in fermented sausage production.

pickle;lactic acid bacteria;nitrite;fermented sausage

2015-12-25

崔玨(1980-)，女，博士，副教授，研究方向：食品功能因子開發(fā)與食品質(zhì)量控制，E-mail：cuijue1980@hotmail.com。

徐州工程學(xué)院自然科學(xué)培育項(xiàng)目(XKY2011111)。

TS201.6

A

1002-0306(2016)18-0251-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.039