呂　曼,楊　柯,王　傲,史雅凝,辛志宏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

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基于NRPS基因篩選與鑒定葡萄附生真菌

呂曼,楊柯,王傲,史雅凝,辛志宏*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

以非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)基因?yàn)楹Y選靶點(diǎn),從葡萄中篩選出含有NRPS基因的附生真菌,以期發(fā)現(xiàn)具有抗菌作用的環(huán)肽類化合物。采用平板劃線技術(shù)、斜面分離純化技術(shù)分離葡萄附生真菌,從中篩選出一株含有NRPS基因的附生真菌(編號(hào)PTLM-1)。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)合形態(tài)學(xué)方法,將該菌株鑒定為腐皮鐮刀菌Fusariumsolani。經(jīng)過NRPS系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)該菌株有產(chǎn)生抗菌環(huán)肽類化合物——環(huán)孢菌素的潛力。通過對(duì)該菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜分析,進(jìn)一步證實(shí)了該預(yù)測結(jié)果。該研究為定向篩選產(chǎn)生環(huán)肽類化合物的菌株提供了新的研究方法與理論依據(jù)。

葡萄,附生真菌,18S rDNA,ITS rDNA,分離鑒定,非核糖體多肽合成酶

食藥兩用植物能夠產(chǎn)生許多具有重要生理活性的物質(zhì),在醫(yī)藥、食品和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。然而,有些植物生長周期長且種類稀少,難以提供足夠的生產(chǎn)原料,而且大量采伐會(huì)破壞生態(tài)環(huán)境。幸運(yùn)的是,近幾十年的微生物與生態(tài)學(xué)研究表明,幾乎每一種植物都共附生有一種或多種微生物,這些微生物不僅能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物,而且有些微生物還能產(chǎn)生與其宿主相同或相似的物質(zhì),尤其是食藥兩用植物[1],如葡萄,作為一種廣泛種植、以食用為主、食藥兩用的作物,蘊(yùn)藏著豐富的共附生微生物資源,可通過發(fā)酵技術(shù)大批量培養(yǎng),經(jīng)過分離純化獲得目標(biāo)產(chǎn)物,這種策略既可保護(hù)生態(tài)環(huán)境,又能為可持續(xù)開發(fā)天然生物活性物質(zhì)提供一條新途徑,但目前對(duì)其附生真菌的研究主要集中在種類鑒定與葡萄病害防治上。所以,開展葡萄共附生真菌的篩選及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究具有重要意義。

在篩選有價(jià)值的共附生微生物過程中,有效的篩選方法是決定能否發(fā)現(xiàn)新型活性化合物的關(guān)鍵[2]。通常采用的篩選方法是基于活性篩選和化學(xué)篩選或者二者的組合[3],這些方法在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物研究的過程中,篩選到許多盛產(chǎn)活性物質(zhì)的菌株,但是隨著研究的深入,這些篩選方法的固有缺陷逐漸顯現(xiàn)出,一些已知菌株和已知化合物被不斷重復(fù)發(fā)現(xiàn),大大降低了發(fā)現(xiàn)新化合物的概率,造成了巨大的時(shí)間和資源浪費(fèi),已經(jīng)成為植物真菌研究過程中最主要的制約因素[4-5]。

隨著現(xiàn)代測序技術(shù)的發(fā)展,基因組測序、功能基因定位及其功能研究等相關(guān)技術(shù)逐漸成熟,一些微生物合成天然產(chǎn)物的生物合成途徑得到解密,為通過功能基因篩選來預(yù)測化合物的結(jié)構(gòu)類型提供了理論基礎(chǔ)[6]?；诜呛颂求w多肽合成酶(NRPS)功能基因定向篩選,目標(biāo)直接指向合成多肽類化合物的目標(biāo)基因,成為一種發(fā)現(xiàn)新型天然次級(jí)代謝產(chǎn)物的重要策略。許多新發(fā)現(xiàn)的抗菌、抗腫瘤和抗癌化合物都是由NRPS途徑合成的[7-8]。目前,通過依據(jù)NRPS基因篩選目標(biāo)菌株,大多數(shù)集中在細(xì)菌方面,而有關(guān)真菌NRPS基因的篩選罕見報(bào)道[9-10]。

由于微生物分離鑒定工作相對(duì)復(fù)雜且周期長,因此本文結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際選擇含水量較高、易腐敗且種植范圍廣的巨峰葡萄為篩選對(duì)象,以NRPS功能基因?yàn)榘悬c(diǎn),采用平板劃線分離、斜面分離純化技術(shù)篩選葡萄附生真菌,在此基礎(chǔ)上,提取真菌DNA,PCR擴(kuò)增18S rDNA、ITS rDNA、LSU rDNA和EF-1α目標(biāo)序列,在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索,下載與目的菌株有較高同源性的序列,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,并結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法,確定目的菌株的種屬地位,以期定向篩選到具有NRPS功能基因的附生真菌。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

巨峰葡萄購自江蘇省南京市蘇果超市;Omega真菌基因組試劑盒(Fungal DNA Kit 50)及引物上海捷瑞生物工程有限公司;DR001AM PCR試劑、Ver.3.0 D823A瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒日本TaKaRa公司;pMD19-T載體、solutionⅠ、2×Taq Master Mix、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞南京諾唯贊生物科技有限公司;其他分析純?cè)噭┠暇鄣聦?shí)驗(yàn)器材有限公司;PDA固體培養(yǎng)基土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、食鹽30 g/L,自來水配制;LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L,pH7.2;LB固體培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L,瓊脂5 g/L,pH7.2;真菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基土豆200 g/L,麥芽糖20 g/L,甘露醇20 g/L,葡萄糖10 g/L,味精5 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏3 g/L,pH6.0。

DYCP-31DN電泳儀北京市六一儀器廠;JS-380C全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀上海市培清科技有限公司;TP600型梯度PCR儀日本TaKaRa公司;Microfuge 22R臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)美國Beckman公司;Mariner API-TOF型質(zhì)譜儀美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株的分離培養(yǎng)將巨峰葡萄于無菌操作臺(tái)中破碎,梯度稀釋后接種于PDA平板培養(yǎng)基上,于28 ℃培養(yǎng)2～3 d。待培養(yǎng)基中長出菌絲后,挑取新鮮菌絲到另一PDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離,得到單菌落,并在PDA斜面試管中劃線接種,4 ℃保存。

1.2.2菌株的形態(tài)學(xué)觀察

1.2.2.1菌落形態(tài)特征從斜面培養(yǎng)基中挑取新鮮菌絲接種至另一PDA平板培養(yǎng)基上,于28 ℃恒溫培養(yǎng)4～5 d,觀察菌落的大小、顏色、質(zhì)地等形態(tài)特征并記錄。

1.2.2.2顯微形態(tài)特征挑取菌落邊緣菌絲,制作水浸片,然后在倒置顯微鏡下觀察其菌絲體、分生孢子、孢子梗等。

1.2.3基因組DNA的提取從斜面中挑取新鮮菌絲接種到PDA平板培養(yǎng)基上,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。真菌基因組DNA的提取采用Omega真菌基因組試劑盒(Fungal DNA Kit 50)進(jìn)行。將1%瓊脂糖煮沸至澄清透明,加幾滴EB并攪拌均勻進(jìn)行染色,待30 min冷卻成型后即可,將所提取的真菌基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(120 V,30 min)。4 ℃保存?zhèn)溆?或于-20 ℃中長期保存。

1.2.4NRPS功能基因片段的擴(kuò)增與基因克隆分別選用AUG003/AUG007、AUG003/AUG006、AUG005/AUG007 3對(duì)簡并引物對(duì)其NRPS基因序列進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min[11]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL的反應(yīng)體系,包括ddH2O 9.5 μL、2×Taq Master Mix 12.5 μL、Primer-F(10 μmol/L)1 μL、Primer-R(10 μmol/L)1 μL、DNA 1 μL。將1%瓊脂糖煮沸至澄清透明,加幾滴EB并攪拌均勻進(jìn)行染色,待30 min冷卻成型后將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(120 V,30 min),4 ℃保存。

1.2.518S rDNA基因片段的PCR擴(kuò)增選用真核生物18S rDNA的通用擴(kuò)增引物:NS1(5′-GTAG TCATATGCTTGTCTC-3′)/NS8(5′-TCCGCAGGTTCA CCTACGGA-3′)對(duì)18S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性45 s,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min 45 s,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min[12]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL的反應(yīng)體系,包括ddH2O 9.5 μL、2×Taq Master Mix 12.5 μL、Primer-F(10 μmol/L)1 μL、Primer-R(10 μmol/L)1 μL、DNA 1 μL。將1%瓊脂糖煮沸至澄清透明,加幾滴EB并攪拌均勻進(jìn)行染色,待30 min冷卻成型后將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(120 V,30 min),4 ℃保存。

1.2.6ITS rDNA基因片段的PCR擴(kuò)增選用真核生物ITS rDNA的通用擴(kuò)增引物:ITS1(5′-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTA TTGATAT GC-3′)對(duì)ITS rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min 30 s,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸7 min[13]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL的反應(yīng)體系,包括ddH2O 9.5 μL、2×Taq Master Mix 12.5 μL、Primer-F(10 μmol/L)1 μL、Primer-R(10 μmol/L)1 μL、DNA 1 μL。將1%瓊脂糖煮沸至澄清透明,加幾滴EB并攪拌均勻進(jìn)行染色,待30 min冷卻成型后將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(120 V,30 min),4 ℃保存。

1.2.7LSU rDNA基因片段的PCR擴(kuò)增選用真核生物L(fēng)SU rDNA的通用擴(kuò)增引物:NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)/LR3(5′-GGTCCGTGTTTCAAGAC-3′)對(duì)LSU rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min,53 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸7 min[14]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL的反應(yīng)體系,包括ddH2O 9.5 μL、2×Taq Master Mix 12.5 μL、Primer-F(10 μmol/L)1 μL、Primer-R(10 μmol/L)1 μL、DNA 1 μL。將1%瓊脂糖煮沸至澄清透明,加幾滴EB并攪拌均勻進(jìn)行染色,待30 min冷卻成型后將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(120 V,30 min),4 ℃保存。

1.2.8EF-1α片段的PCR擴(kuò)增選用真核生物EF-1α的擴(kuò)增引物:EF2T(5′-GGAAGTACCAGTGATC ATGTT-3′)/EF3(5′-GTAAGGAGGASAAGACTCACC-3′)對(duì)EF-1αrDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min[15]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL的反應(yīng)體系,包括ddH2O 9.5 μL、2×Taq Master Mix 12.5 μL、Primer-F(10 μmol/L)1 μL、Primer-R(10 μmol/L)1 μL、DNA 1 μL。將1%瓊脂糖煮沸至澄清透明,加幾滴EB并攪拌均勻進(jìn)行染色,待30 min冷卻成型后將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(120 V,30 min),4 ℃保存。

1.2.9PCR產(chǎn)物的回收及克隆采用瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒回收上述PCR產(chǎn)物,將新鮮制備的或-70 ℃保存的100 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞先置于冰上5 min后輕甩使細(xì)胞懸浮。再將純化的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接,然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中,冰中放置30 min,取出后42 ℃熱激90 s,冰中放置5～10 min后加入890 μL LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、90 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。將菌液均勻涂布于含AMP(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基平板上,正放15 min后倒置過夜培養(yǎng),挑取白色單菌落接到含有AMP的LB液體培養(yǎng)基中(1 mL LB加1 μL AMP),37 ℃,120 r/min振蕩培養(yǎng)10～12 h。吸取1 μL培養(yǎng)過的菌液進(jìn)行PCR,所用引物為M13-RV和M13-47,電泳檢測是否含有目的片段。

PCR采用25 μL的反應(yīng)體系,包括ddH2O 9.5 μL、2×Taq Master Mix 12.5 μL、Primer-F(10 μmol/L)1 μL、Primer-R(10 μmol/L)1 μL、DNA 1 μL。將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,4 ℃保存。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。

1.2.10目的DNA序列的測序和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析將NRPS、18S rDNA、ITS rDNA、LSU rDNA和EF-1α的單克隆PCR產(chǎn)物交由上海美吉生物有限公司進(jìn)行測序。獲得拼接序列后,將其轉(zhuǎn)化為蛋白序列后進(jìn)行同源性搜索,下載同源較高的蛋白序列;將18S rDNA、ITS rDNA、LSU rDNA和EF-1α序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì),從中下載與該序列相似性較高的核酸序列。使用MEGA 6.0軟件,進(jìn)行多重序列匹配排列和聚類分析,采用鄰接法(neighbor joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,并通過自舉分析(bootstrap)進(jìn)行置信度檢測,自舉數(shù)據(jù)集為1000次。

1.2.11菌株P(guān)TLM-1的發(fā)酵與質(zhì)譜分析將分離純化得到的菌株接種在真菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)7 d,用丙酮提取發(fā)酵產(chǎn)物,過濾后直接進(jìn)行進(jìn)樣分析。質(zhì)譜條件:離子源ESI負(fù)離子模式,毛細(xì)管電壓4000 V,霧化器壓力25 psig,干燥氣9 L/min,干燥氣溫度300 ℃,掃描范圍50～1100 m/z。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株形態(tài)學(xué)鑒定

2.1.1菌落形態(tài)特征由圖1可知,菌株P(guān)TLM-1在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)4～5 d后,觀察可見其氣生菌絲為白色至淺灰色,形如羊絨。

圖1　菌株P(guān)TLM-1的菌落形態(tài)圖Fig.1　The morphological characters of PTLM-1

2.1.2顯微形態(tài)特征由圖2可知,菌株P(guān)TLM-1的顯微形態(tài):分生孢子以孢尖或孢體附于菌絲上,形態(tài)各異。其中大型分生孢子分布較稀疏;小型分生孢子則呈串排列。大型分生孢子兩端較尖,呈鐮刀形或紡錘形,孢體稍彎曲;小分生孢子呈卵形、腎形、梨形或紡錘形等,常平鋪聚集與菌絲連接在一起。

圖2　菌株P(guān)TLM-1的顯微形態(tài)圖Fig.2　The microscopic morphological characters of PTLM-1注:A、B為菌株P(guān)TLM-1的倒置顯微鏡圖,放大倍數(shù)為100×;C、D為菌株P(guān)TLM-1的掃描電鏡圖,其中C圖放大倍數(shù)為8000×,D圖放大倍數(shù)為2000×。

2.2NRPS片段擴(kuò)增與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

圖4　基于PTLM-1 NRPS基因AUG系列引物構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4　Neighbor-Joining phylogenetic tree based on partial NRPS rDNA sequences

經(jīng)PCR擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)僅引物AUG003/AUG006獲得菌株P(guān)TLM-1的NRPS 750 bp的目的條帶,如圖3所示。測序后將核酸序列在NCBI上轉(zhuǎn)化為蛋白序列并進(jìn)行同源性搜索,從中下載同源性較高的蛋白序列,將PTLM-1對(duì)應(yīng)的蛋白序列與下載的蛋白序列經(jīng)MEGA 6.0軟件進(jìn)行比對(duì)后,以鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建基于NRPS功能基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,如圖4所示。不同種的綠僵菌菌株(Metarhiziumsp.)聚為一枝,都能產(chǎn)生腐敗菌素(destruxin);而不同屬的炭疽菌(Colletotrichumsp.)和青霉菌(Penicilliumsp.)都能產(chǎn)生金擔(dān)子素A1(aureobasidin A1)。這說明同屬真菌的不同種菌株或不同屬真菌都能夠產(chǎn)生相同類型的化合物。如菌株P(guān)TLM-1(登錄號(hào)為KX147648)與Tolypocladium inflatum(CAA82227)聚為一枝,自展值為100,表現(xiàn)出很近的親緣關(guān)系。說明菌株P(guān)TLM-1可能產(chǎn)生抗菌環(huán)肽類化合物——環(huán)孢菌素(cyclosporine)。

圖3　LM-1 NRPS基因片段擴(kuò)增圖譜Fig.3　PCR amplified products of 18S rDNA and ITS注:A:NRPS基因PCR擴(kuò)增結(jié)果;M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.318S rDNA和ITS rDNA擴(kuò)增與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

圖5　基于菌株P(guān)TLM-1 18S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育Fig.5　Neighbor-Joining phylogenetic tree based on partial 18S rDNA sequence

經(jīng)PCR擴(kuò)增分別獲得菌株P(guān)TLM-1的18S rDNA和ITS1-5.8S-ITS4 rDNA區(qū)域的序列,其中PTLM-1的18S rDNA序列全長為1700 bp,PTLM-1的rDNAITS1-5.8S-ITS4序列全長為500 bp左右。

將菌株P(guān)TLM-18S序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)(GenBank登錄號(hào)KX147646),發(fā)現(xiàn)該序列與

圖6　基于菌株P(guān)TLM-1 ITS rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.6　Neighbor-Joining phylogenetic tree based on partial ITS rDNA sequences

圖7　基于菌株P(guān)TLM-1 LSU rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.7　Neighbor-Joining phylogenetic tree based on partial LSU rDNA sequences

Fusariumsp.的18S rDNA序列同源性最高,相似性達(dá)100%。選取同源性較高菌株的18S rDNA基因序列,使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖5)。從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中可以看出,菌株P(guān)TLM-1與F.solani(EF397944)和F.solani(AB473810)聚為一枝,表現(xiàn)出相當(dāng)近的親緣關(guān)系,因此可將其初步鑒定為Fusariumsp.。再將該菌株rDNA ITS1-5.8S-ITS4序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的真菌rDNA的ITS1-5.8S-ITS4序列進(jìn)行BLAST比對(duì)(GenBank登錄號(hào)KX147647)。經(jīng)過比對(duì)發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)TLM-1的ITS1-5.8S-ITS4 rDNA序列與F.solani的ITS基因序列同源性最高,相似性可達(dá)99%。從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖6)中可以看出,菌株P(guān)TLM-1與F.solani(FJ345352)聚為一枝,自展值為70,表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。

2.4LSU rDNA和EF-1α的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

將該菌株LSU rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的真菌LSU rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)(GenBank登錄號(hào)KX147649)。經(jīng)過比對(duì)發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)TLM-1的LSU rDNA序列與F.solani的LSU rDNA序列同源性最高,相似性達(dá)99%。從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖7)中可以看出,菌株P(guān)TLM-1與F.solani(KF938479)和F.solani(EU214559)聚為一枝,自展值為94,表現(xiàn)出相當(dāng)近的親緣關(guān)系。再將該菌株EF-1α序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的真菌EF-1α序列進(jìn)行BLAST比對(duì)(GenBank登錄號(hào)KX147650)。經(jīng)過比對(duì)發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)TLM-1的EF-1α序列與F.solani的EF-1αrDNA序列相似性可達(dá)99%。

綜合菌落顯微形態(tài)特征、NRPS、18S rDNA、rDNA ITS1-5.8S-ITS4、LSUrDNA及EF-1α序列分析結(jié)果,且與真菌鑒定手冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)照后,將該菌株P(guān)TLM-1鑒定為半知菌類(Fungi Imperfecti)、叢梗孢目(Melanconiales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、腐皮鐮刀菌(F.solani)[16]。

2.5菌株P(guān)TLM-1的質(zhì)譜分析

將菌株P(guān)TLM-1發(fā)酵7 d后,用丙酮提取發(fā)酵產(chǎn)物濃縮蒸干,加適量水溶解后直接進(jìn)行進(jìn)樣分析。結(jié)果如圖8所示,菌株P(guān)TLM-1的粗提物在m/z 1020.8、1034.8、1035.8、1042.8處產(chǎn)生碎片離子峰,為環(huán)孢菌素類化合物的特征分子離子質(zhì)量,因此發(fā)酵產(chǎn)物中確實(shí)可能存在環(huán)孢菌素類化合物。另外,張梅等[17]從腐皮鐮刀菌固體發(fā)酵培養(yǎng)物中也分離得到1個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物,通過核磁共振、質(zhì)譜等波譜技術(shù)分析得知此化合物為酚類化合物,并且具有抑制酪氨酸酶活性,阻止黑色素的形成,為化妝品行業(yè)的發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)[18]。

圖8　菌株P(guān)TLM-1 發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)譜圖Fig.8　Mass spectrum diagram for PTLM-1

3　結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的真菌分類學(xué)鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化鑒定,然而真菌種類的多樣性及環(huán)境的不穩(wěn)定性等不可避免的因素大大限制了這些方法的發(fā)展。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,通過提取真菌基因組DNA,并對(duì)其18S、ITS、LSU及EF-1αrDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)而同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹來確定菌株的種屬地位,已成現(xiàn)代真菌鑒定最為有效的方法。

共附生微生物能否產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的生物活性物質(zhì),基于其是否含有編碼相應(yīng)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的基因簇。2005年,Miao課題組通過研究StreptomycesroseosporusNRRL 11379的NRPS合成途徑,首次從中克隆出達(dá)托霉素合成基因簇,這為從基因到新化合物的預(yù)測奠定了理論基礎(chǔ),并且也成為現(xiàn)代天然產(chǎn)物研究與開發(fā)的有效手段[19]。本研究基于NRPS基因篩選真菌菌株,目標(biāo)直接指向新化合物的合成途徑,減小已知化合物的發(fā)現(xiàn)概率,大大提高了工作效率。

本研究以NRPS功能基因?yàn)榘悬c(diǎn),從含水量高且種植范圍廣的巨峰葡萄中分離得到菌株P(guān)TLM-1。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察,將該菌鑒定為腐皮鐮刀菌F.solani。根據(jù)NRPS系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析,猜測菌株P(guān)TLM-1可能產(chǎn)生環(huán)孢菌素類化合物,經(jīng)發(fā)酵后通過質(zhì)譜分析驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)腐皮鐮刀菌PTLM-1確實(shí)能產(chǎn)生環(huán)孢菌素。環(huán)孢菌素作為一種微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物,除了具有抗菌、抗腫瘤等生物活性外,臨床上還可將其應(yīng)用于抑制器官移植時(shí)的排斥反應(yīng)。除此之外,腐皮鐮刀菌還能產(chǎn)生其他結(jié)構(gòu)新穎、生理活性獨(dú)特的化合物,如酚類化合物、大黃素、腦苷脂等。大黃素除了具有抗菌抗炎、抗腫瘤等藥理作用外,還可抗氧化清除氧自由基[20];而腦苷脂除了具有抑菌活性、保肝活性及抗?jié)兊壬锘钚酝?還對(duì)作用于細(xì)胞壁的抗生素有增效作用。可見,腐皮鐮刀菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物不僅結(jié)構(gòu)多樣,而且生物活性極其顯著,具有明顯研究價(jià)值。

多孔木霉(T.inflatum)產(chǎn)生的環(huán)孢菌素H和其它二十多個(gè)同系物,是目前為止國內(nèi)外關(guān)于環(huán)孢菌素產(chǎn)生菌少有的報(bào)道[21]。福建省微生物研究所[22-25]從篩選到的腐皮鐮刀菌中也已分離出十余種環(huán)孢菌素,并證明它們與多孔木霉產(chǎn)生的環(huán)孢菌素組分相同,而且外源氨基酸對(duì)多孔木霉和腐皮鐮刀菌生物合成環(huán)孢菌素的影響不同,這為進(jìn)一步闡明環(huán)孢菌素的生物合成途徑,比較不同真菌來源環(huán)孢菌素合成酶的特性,指導(dǎo)環(huán)孢菌素的工業(yè)化生產(chǎn)有重要的意義,但國內(nèi)外如今對(duì)產(chǎn)環(huán)孢菌素真菌腐皮鐮刀菌遺傳特性研究較少,并且在發(fā)酵過程中環(huán)孢菌素可能會(huì)受到菌種種類、發(fā)酵條件等多方面影響以至于產(chǎn)量并不穩(wěn)定,倘若對(duì)腐皮鐮刀菌進(jìn)行基因改造,環(huán)孢菌素的產(chǎn)量將會(huì)大大提高。因此,研究腐皮鐮刀菌的NRPS基因片段,為進(jìn)一步選育高產(chǎn)環(huán)孢菌素菌株奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Isolation and identification based on NRPS functional gene of a fungal epiphytic strain from grapes

LV Man,YANG Ke,WANG Ao,SHI Ya-ning,XIN Zhi-hong*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

A fungal epiphytic with nonribosomal peptide synthetase(NRPS)gene was isolated from a root rot of grapes basing on nonribosomal peptide synthetase gene target-screening in order to find a cyclic peptide with antimicrobial activity. The fungal epiphytic with nonribosomal peptide synthetase(NRPS)gene named as PTLM-1 was isolated from grapes by streak plate and slant culture methods. On this basis,constructed a phylogenetic tree,then the species of the strain PTLM-1 was identified asF.solanicombined with morphological observation. It was found that the strain had the potential to produce a cyclic peptide named cyclosporine after NRPS sequence analysising,which was further confirmed by the electrospray ionizsation mass spectrum(ESI-MS)analysis. This study provided new research methods and theoretical basis for target-screening strains which produced cyclic peptide.

grapes;a epiphytic fungi;18S rDNA;ITS rDNA;identification;NRPS

2016-02-22

呂曼(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)與化學(xué)，E-mail：2014108057@njau.edu.cn。

辛志宏(1974-)，男，博士，教授，研究方向：食品營養(yǎng)與化學(xué)，E-mail：xzhfood@njau.edu.cn。

農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目(GJFP2015012)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)18-0229-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.035