陳　晨,楊　革,李莉莉,秦　松

(1.曲阜師范大學生命科學學院,山東曲阜 273165;2.中國科學院煙臺海岸帶研究所,山東煙臺 264003)

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田口方法優(yōu)化菌株產(chǎn)菊粉酶的培養(yǎng)條件

陳晨1,楊革1,李莉莉2,*,秦松2,*

(1.曲阜師范大學生命科學學院,山東曲阜 273165;2.中國科學院煙臺海岸帶研究所,山東煙臺 264003)

鑒定一株從菊芋根際土壤中分離出的產(chǎn)外切型菊粉酶活力較高的菌株C-56。通過16S rDNA序列分析構建系統(tǒng)發(fā)育樹,初步確定菌株的分類地位,利用單因素實驗和田口方法優(yōu)化培養(yǎng)基配方。實驗發(fā)現(xiàn)菌株C-56屬于伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia),單因素實驗確定菌株產(chǎn)酶的最佳碳源、氮源、無機鹽分別為菊粉、酵母膏、MgSO4·7H2O。應用田口方法優(yōu)化菌株的培養(yǎng)基,統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)菊粉對菌株產(chǎn)酶的影響最大,最佳培養(yǎng)基配方為菊粉50 g/L,酵母浸粉20 g/L,MgSO4·7H2O 6 g/L,pH6.0。在最佳條件下獲得的菊粉酶活力為(29.34±1.95) U/mL,比初始菊粉酶酶活力(6.25±0.84) U/mL提高了3.69倍。

伯克霍爾德氏菌屬,菊粉酶,菊粉,優(yōu)化,田口方法

菊粉又稱菊糖,是一種高分子碳水化合物,主要存在于菊芋、菊苣和大麗花等多種植物的根和塊莖中[1]。其分子呈直鏈結構,由D-呋喃果糖殘基通過β-1,2糖苷鍵脫水縮合而成,末端連接一個葡萄糖殘基,聚合度為2～60[2]。菊粉作為一種相對廉價且豐富的生產(chǎn)果糖和低聚果糖的原材料,被廣泛應用于食品、藥品和保健品等領域[3]。

菊粉酶能夠水解菊粉,根據(jù)其作用方式分為兩種類型:外切型菊粉酶,主要產(chǎn)物為果糖;內切型菊粉酶,主要產(chǎn)物為低聚果糖[4]。果糖甜度比蔗糖高,水溶性好,粘度較低,這些特點使果糖作為一種甜味劑被廣泛應用于食品加工工業(yè)。近年來果糖的重要性不斷增加,與其他的糖類相比,食用果糖不容易引起齲齒。果糖所含熱量較低,并且果糖在人體中的新陳代謝不依賴胰島素,因此成為肥胖癥和糖尿病患者的一種理想食物[5]。低聚果糖是一種優(yōu)良的益生元,能選擇性地刺激腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌的生長[6]。由于微生物易于培養(yǎng),繁殖快,周期短,酶產(chǎn)量高,因此工業(yè)上多用微生物來進行菊粉酶的生產(chǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)的能合成菊粉酶的微生物有很多種,包括霉菌、細菌、酵母等均能生產(chǎn)菊粉酶[7]。但是目前已有的能夠分泌菊粉酶菌株的活性均較低,無法實現(xiàn)進一步產(chǎn)業(yè)化應用的需要。

田口方法(Taguchi method)是由田口玄一博士創(chuàng)立的一種優(yōu)化方法。通過適當?shù)脑O計使實驗結果對外界條件變化不敏感,將優(yōu)化的過程提前到實驗設計階段[8]。傳統(tǒng)的優(yōu)化方法,每次實驗只能研究一個因素的影響,實驗次數(shù)多,耗費時間長,只能確定因素自身的顯著性,而無法確定單個因素相對于其他所有因素對實驗結果影響程度的相對大小[9]。與傳統(tǒng)方法相比,田口方法體現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。田口方法可同時研究多個因素,以及各因素之間的相互影響,使實驗次數(shù)大大減少,節(jié)省了時間和材料,并且能夠通過方差貢獻率來確定各因素對實驗結果影響的相對程度,用最少的實驗次數(shù)找出影響最大的因素[10]。本實驗針對目前面臨的菊粉酶高活力生產(chǎn)菌株缺乏的問題,鑒定了一株菊粉酶生產(chǎn)菌株并且用田口方法對該菌株的產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種c-56是從山東煙臺種植菊芋多年的根際土壤中分離篩選獲得;菊粉青海威德特種糖業(yè)有限公司;3,5-二硝基水楊酸國藥集團化學試劑有限公司;實驗所用試劑均為分析純;初篩培養(yǎng)基菊粉10 g/L,蛋白胨5 g/L,(NH4)2SO45 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,瓊脂20 g/L,pH5.0;斜面培養(yǎng)基葡萄糖20 g/L,酵母浸粉5 g/L,蛋白胨5 g/L,瓊脂20 g/L,pH5.0;種子培養(yǎng)基葡萄糖20 g/L,酵母浸粉5 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,pH5.0;發(fā)酵培養(yǎng)基菊粉20 g/L,酵母浸粉10 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,pH5.0。

SW-CJ-2FD潔凈工作臺蘇州凈化設備有限公司;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;DHA-DA.大容量全溫振蕩器江蘇太倉市實驗設備廠;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌株的分子生物學鑒定提取菌株的基因組DNA,通過對16S rRNA基因PCR擴增和測序,然后進行序列比對和分析,利用MAGA5.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,初步確定菌株的分類地位。

1.2.2菊粉酶活力測定采用3.5-二硝基水楊酸法:取1 mL酶液加入4 mL 2%的菊粉溶液(pH5.0、0.l mol/L醋酸緩沖液配制),55 ℃水浴條件下反應10 min;取反應液1 mL加入1 mL DNS混勻,100 ℃沸水浴5 min終止反應,迅速冷卻并稀釋至25 mL(在相同的條件下,用100 ℃滅活的粗酶液作為對照)。在波長540 nm處測定其吸光值,根據(jù)葡萄糖標準曲線計算樣品中還原糖的含量[11]。

菊粉酶活力單位定義:在pH5.0,55 ℃條件下反應10 min,每分鐘轉化生成1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

1.2.3單因素實驗

1.2.3.1碳源對菌株產(chǎn)酶的影響在其他培養(yǎng)基成分(碳源除外)相同的情況下,選取6種不同的碳源:菊粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、玉米淀粉、麥芽糖進行產(chǎn)酶實驗,每種碳源的量均為20 g/L,測定菌株的產(chǎn)酶活力。

1.2.3.2氮源對菌株產(chǎn)酶的影響在其他培養(yǎng)基成分(氮源除外)相同的情況下,以菊粉為碳源,選取6種不同的氮源:蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、(NH4)2SO4、NH4H2PO4、NH4Cl進行產(chǎn)酶實驗,每種氮源的量為5 g/L,測定菌株的產(chǎn)酶活力。

1.2.3.3無機鹽對菌株產(chǎn)酶的影響在其他培養(yǎng)基成分(無機鹽除外)相同的情況下,以菊粉為碳源,酵母浸粉為氮源,其他條件不變的情況下,選取7種不同的無機鹽:NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O進行產(chǎn)酶實驗,每種無機鹽的量均為2 g/L,測定菌株的產(chǎn)酶活力。

1.2.4田口方法優(yōu)化實驗設計應用田口方法研究培養(yǎng)基中各組分之間的關系,并優(yōu)化培養(yǎng)基各組分的質量濃度以及初始pH,提高菌株C-56產(chǎn)生的菊粉酶活力。本實驗選取了四個因子進行優(yōu)化,每個因子取三個水平值(表1)。利用Qualitek-4軟件設計正交表,共進行九組實驗,實驗設計如表2所示。

表1　實驗設計的4個因子及3個水平

發(fā)酵產(chǎn)酶過程在250 mL三角瓶中進行,每瓶裝液量為50 mL,接種量10%。在溫度30 ℃,轉速200 r/min條件下,搖床培養(yǎng)48 h后測定菊粉酶活力。實驗經(jīng)過三次生物學重復。

1.2.5驗證實驗在優(yōu)化后的最佳條件下,進行產(chǎn)酶實驗,30 ℃,200 r/min,搖床培養(yǎng)48 h,測定菊粉酶活力值,將實驗測得的實際值與預測值進行對比,評價優(yōu)化方案。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用Qualitek-4軟件進行田口實驗設計,并進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2　結果與討論

2.1菌株的分子生物學鑒定

通過16S rRNA基因進行序列分析和比對,BLAST分析發(fā)現(xiàn)菌株C-56與棲土伯克霍爾德氏菌(BurkholderiaterricolaR 8118)最為相似,相似度為99%。利用MAGA5.1軟件,使用鄰接法構建菌株C-56的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。分支上標注的數(shù)值為1000次bootstrap后的置信度。從系統(tǒng)發(fā)育樹上可以發(fā)現(xiàn)菌株C-56與棲土伯克霍爾德氏菌(Burkholderiaterricola)聚為一枝,并且處在伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)進化枝中。初步確定菌株C-56屬于伯克霍爾德氏菌屬。

圖1　菌株C-56系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1　Neighbour-joining phylogenetic tree of strain C-56

2.2碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

碳源對微生物產(chǎn)酶具有非常重要的影響，其是構成酶蛋白碳骨架以及合成能量的主要來源,并且還能誘導或阻遏酶的產(chǎn)生[12]。實驗結果如圖2所示。

圖2　不同碳源對菌株產(chǎn)酶活力的影響Fig.2　Effect of different carbon sources on inulinase activity

從圖2中可以看出,當以菊粉作為碳源時,菌株的產(chǎn)酶活力明顯高于其他碳源。以果糖作為碳源時菌株的產(chǎn)酶活力最低,可能由于外切型菊粉酶的酶解產(chǎn)物多為果糖,而酶的合成是一個動態(tài)平衡的過程,當培養(yǎng)基中以果糖作為碳源時,會抑制酶的合成。而菊粉的存在卻可誘導酶的合成,因此選用菊粉作為菌株產(chǎn)酶的最佳碳源。

2.3氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

氮元素是構成細胞中核酸和蛋白質的重要元素,氮源是微生物生長必不可少的營養(yǎng)物質。氮源對菌株產(chǎn)酶影響的實驗結果如圖3所示。

圖3　不同氮源對菌株產(chǎn)酶活力的影響Fig.3　Effect of different nitrogen sources on inulinase activity

從圖3中可以看出,當以酵母浸粉作為氮源時,菌株產(chǎn)生的菊粉酶活力最高,酵母浸粉屬于有機氮源,且酵母浸粉本身就是促進微生物生長繁殖的優(yōu)質營養(yǎng)因子。因此選用酵母浸粉作為最佳氮源。

2.4無機鹽對菌株產(chǎn)酶的影響

無機鹽也是微生物生長不可缺少的物質,不同金屬離子對微生物產(chǎn)酶有不同的影響,實驗結果如圖4所示。

圖4　不同無機鹽對菌株產(chǎn)酶活力的影響Fig.4　Effect of different inorganic salt on inulinase activity

從圖4中可以看出,當培養(yǎng)基中添加MgSO4·7H2O時,菌株產(chǎn)生的菊粉酶活力最高,其次為ZnSO4·7H2O,而添加CaCl2時產(chǎn)酶活力最低。因此選用MgSO4·7H2O作為菌株產(chǎn)酶的最佳無機鹽。

2.5田口方法優(yōu)化培養(yǎng)基

通過前期實驗,選定A菊粉,B酵母浸粉,C MgSO4·7H2O,D初始pH作為進一步優(yōu)化的因子,并確定因子的三個水平,如表1所示。按照Qualitek-4軟件設計的方案進行實驗,并將實驗結果的響應值記錄于表2中。

表2　田口方法實驗結果

表3　方差分析表

圖5　四個因素的主效應圖Fig.5　Main effect plots of four factors

利用Qualitek-4軟件分析實驗結果,對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,結果發(fā)現(xiàn),四個因子的p值均小于0.001,即均為極顯著性因素(表3),而通過方差貢獻率的計算發(fā)現(xiàn),菊粉的方差貢獻率高達91.16%,與之相比,其他三個因子的方差貢獻率較小,酵母浸粉只占2.87%,這就表明,在四個因素中菊粉對菌株產(chǎn)酶的影響程度最大,酵母浸粉的影響程度最小,這意味著菊粉是菌株產(chǎn)菊粉酶最顯著最重要的影響因素。這與Pilanee Vaithanomsat等[13]的研究結果一致。

四個因子相關的均值主效應圖如圖5所示,主效應圖顯示了因子取不同的水平值對實驗結果的影響。在每個因子的三個水平中只有一個水平能使實驗的響應值達到最大。本實驗中使響應值最大的因子水平分別為菊粉:3水平,酵母浸粉:2水平,MgSO4·7H2O:3水平,初始pH:3水平,即最優(yōu)組合為A3B2C3D3。

因此,由田口方法確定的生產(chǎn)菊粉酶的最佳條件為菊粉50 g/L,酵母浸粉20 g/L,MgSO4·7H2O 6 g/L,pH6.0。進一步預測在最佳條件(A3B2C3D3)下進行菊粉酶的生產(chǎn)即可獲得最大菊粉酶活力,即菊粉酶活力的預測值(Yexpected),可根據(jù)以下公式計算:

式(1)

Yexpected=24.895+17.118+16.713+16.824-3×15.212=29.91

田口方法獲得的最大菊粉酶活力的預測值為29.91 U/mL。

2.6驗證實驗

按照田口方法優(yōu)化后獲得的最佳條件,對菊粉酶的酶活力進行了3次驗證實驗,獲得菊粉酶的活力值為(29.34±1.95) U/mL,這與預測值(29.91 U/mL)非常接近,且菊粉酶活力相對穩(wěn)定,比初始菊粉酶酶活力(6.25±0.84 U/mL)提高了約3.69倍,說明由田口方法獲得的優(yōu)化方案達到了預期的效果。曹洪澤等[14]利用響應面法將一株黑曲霉的菊粉酶活力由3.27 U/mL提高到了7.26 U/mL,酶活力提高了1.22倍。李潔等[15]通過正交實驗,在發(fā)酵96 h后將一株雅致放射毛霉的菊粉酶活力提高到了27.36 U/mL,酶活力提高了0.23倍。茍亞峰等[16]利用響應面法將一株霉菌的菊粉酶活力由15.88 U/mL提高到了24.62 U/mL,酶活力提高了1.55倍。

3　結論

通過16S rRNA基因進行序列分析和比對,確定所篩菌株C-56屬于伯克霍爾德氏菌屬。通過單因素實驗確定,菌株C-56生產(chǎn)菊粉酶的最佳碳源、氮源、無機鹽分別為菊粉,酵母浸粉,MgSO4·7H2O。

利用Qualitek-4軟件分析發(fā)現(xiàn),被優(yōu)化的四個因子中,菊粉對菌株產(chǎn)酶的影響最大,是菌株C-56生產(chǎn)菊粉酶的過程中最顯著最重要的影響因素,其方差貢獻率高達91.16%,而酵母浸粉只占2.87%,田口方法優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基配方為菊粉50 g/L,酵母浸粉20 g/L,MgSO4·7H2O 6 g/L,pH6.0。在此條件下獲得的菊粉酶活力為(29.34±1.95) U/mL,比初始菊粉酶活力提高了3.69倍。應用田口方法獲得的優(yōu)化方案達到了預期效果,具有較好的穩(wěn)定性,并且優(yōu)化后菊粉酶活力提高的倍數(shù)高于傳統(tǒng)優(yōu)化方法。

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Optimization of medium components for inulinase production of a strain using Taguchi method

CHEN Chen1,YANG Ge1,LI Li-li2,*,QIN Song2,*

(1.College of Life Science,Qufu Normal University,Qufu 273165,China;2.Yantai Institute of Coastal Zone Research,Chinese Academy of Sciences,Yantai 264003,China)

A strain with high inulinase productivity named C-56 which was isolated from Jerusalem artichoke rhizosphere soil was identified. Analysis of 16S rRNA gene sequence indicated that strain C-56 was belonged to genusBurkholderia. The optimal carbon sources,nitrogen sources,and inorganic salt were identified as inulin,yeast extract,MgSO4·7H2O through single factor test,respectively. The optimization of inulinase production from strain C-56 was studied by Taguchi method. Statistical analysis of the experimental data indicated that inulin was the most significant factor for inulinase production. The optimal medium compositions for maximizing the inulinase production were established as 50 g/L inulin,20 g/L yeast extract,6 g/L MgSO4·7H2O,initial pH6.0. Under optimum conditions,(29.34±1.95) U/mL of inulinase activity were obtained,which increased about 3.69 times compared with the initial enzyme activity(6.25±0.84) U/mL.

Burkholderiasp.;inulinase;inulin;optimization;Taguchi method

2016-02-17

陳晨(1988-),女,碩士研究生,研究方向:菊芋的綜合利用,E-mail:cfy1022@126.com。

李莉莉(1982-),女,助理研究員,研究方向:菊芋的綜合利用,E-mail:llli@yic.ac.cn。

秦松(1968-),男,研究員,研究方向:海岸帶植物,E-mail:sqin@yic.ac.cn。

國家自然科學基金(21306221);“十二五”國家科技支撐計劃(2013BAB01B00)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)18-0192-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.028