朱國(guó)飛,滕　騰,鄧　斌

(1.貴州理工學(xué)院制藥工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550003;2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川成都 610065)

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分子對(duì)接模擬與光譜法研究沒(méi)食子酸丙酯和牛血清白蛋白的相互作用

朱國(guó)飛1,滕騰2,鄧斌1

(1.貴州理工學(xué)院制藥工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550003;2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川成都 610065)

運(yùn)用熒光光譜法、紫外吸收光譜法等方法對(duì)沒(méi)食子酸丙酯(PG)與牛血清白蛋白(BSA)之間的相互作用進(jìn)行了研究。熒光猝滅計(jì)算結(jié)果表明PG與BSA間的結(jié)合作用較強(qiáng),猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅,測(cè)得其299 K時(shí)的結(jié)合常數(shù)KA為1.03×105L·mol-1,兩者的作用距離為1.71 nm。熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果表明PG與BSA相互作用力主要為范德華力與氫鍵作用力。通過(guò)探針?lè)肿尤〈磻?yīng)確定了PG在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)是亞級(jí)結(jié)構(gòu)域IIA。圓二色譜的測(cè)定結(jié)果表明PG的結(jié)合導(dǎo)致了蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)的減少以及無(wú)規(guī)則卷曲的增加。本文最后通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬分子Dock的方法模擬出了PG與BSA的結(jié)合構(gòu)象,所得到的結(jié)合參數(shù)與之前的計(jì)算結(jié)果相符。

沒(méi)食子酸丙酯,牛血清白蛋白,熒光光譜法,相互作用

沒(méi)食子酸丙酯[1](Propyl Gallate,PG),又稱(chēng)櫧酸丙酯,化學(xué)名為3,4,5-三羥基苯甲酸丙酯。PG是一種常見(jiàn)的抗氧化劑,它的抗氧化性來(lái)源于它能自身氧化,從而降低周?chē)h(huán)境的含氧量,它能與蛋白質(zhì)結(jié)合抑制某些氧化酶的活性[2],還能提供氫原子與脂肪自由基進(jìn)行結(jié)合,終止油脂的自動(dòng)氧化連鎖反應(yīng)[3-4]。由于其安全無(wú)毒性抗氧化,因此已被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè),以防止食品的變質(zhì)和腐敗。此外,一些研究發(fā)現(xiàn),PG對(duì)一些組織和細(xì)胞還具有生理活性,例如,PG可以作為抗氧化劑防止上皮細(xì)胞免除H2O2的損害[5],在小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)中PG具有典型的抗炎活性[6],最近一些實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),PG能抑制一些腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[7-9]。因此,PG在功能性保健食品開(kāi)發(fā)中具有廣泛的應(yīng)用前景。

在血液中,血清白蛋白(Serum Albumin,SA)是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì),起著貯存外源小分子和內(nèi)源代謝產(chǎn)物的重要作用,是最為重要的藥物結(jié)合蛋白。它可與多種陽(yáng)離子、陰離子和其他小分子物質(zhì)結(jié)合,作為它們的載體。研究PG與SA之間的相互作用,有助于了解PG在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布情況,對(duì)闡明PG的生理活性有著非常重要的意義。研究表明,PG可通過(guò)疏水作用與人血清蛋白HSA(Human Serum Albumin)發(fā)生靜態(tài)結(jié)合,結(jié)合位點(diǎn)位于HSA亞結(jié)構(gòu)域IIA(藥物結(jié)合位點(diǎn)I)處,同時(shí)研究表明,PG與HSA的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,主要表現(xiàn)為α螺旋結(jié)構(gòu)減少[10-11]。但是到目前為止,還沒(méi)有關(guān)于PG與牛血清蛋白BSA(Bovine Serum Albumin)相互作用的文獻(xiàn)報(bào)道。因此,作為PG與SA相互作用研究的補(bǔ)充,本文采用分子對(duì)接模擬以及光譜法等方法,詳細(xì)研究了PG與BSA的結(jié)合過(guò)程,希望能進(jìn)一步闡明PG在血液中的結(jié)合與運(yùn)輸,為PG作為食品抗氧化劑、功能性保健食品、新藥組分等的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牛血清蛋白純度≥98%,上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司;沒(méi)食子酸丙酯純度≥98.0%,HPLC,美國(guó)Sigma公司;膽紅素純度≥95.0%,UV,美國(guó)Sigma公司;撲爾敏純度≥99.0%,美國(guó)Sigma公司;其它化學(xué)試劑分析純。

PHS-4C+型pH計(jì)成都方舟科技有限責(zé)任公司;高壓滅菌鍋上海申安醫(yī)療有限責(zé)任公司;Hitachi-F4500型熒光分光光度計(jì)日本日立公司;Unico 2808型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)上海尤尼科儀器有限公司;AVIV Model 400型圓二色譜儀美國(guó)Aviv。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

用50×10-3mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)配制濃度為3.0×10-6mol/L的BSA溶液,備用。

1.2.1熒光發(fā)射光譜檢測(cè)PG與BSA的相互作用取2 mL濃度為3.0×10-6mol/L的BSA溶液加入石英比色杯中,用微量進(jìn)樣器每次加入定量的PG溶液并充分混勻(保證總體積幾乎不變的前提下使混合溶液中PG的終濃度分別為0、1、5、10、15、20、25×10-6mol/L),每次加入混勻靜置作用10 min后開(kāi)始進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)條件:激發(fā)狹縫5 nm,發(fā)射狹縫10 nm,激發(fā)電壓700 V,激發(fā)波長(zhǎng)分別為278 nm和295 nm,用熒光光譜儀掃描溶液在200～400 nm的熒光光譜數(shù)據(jù)。為了檢測(cè)PG與BSA的結(jié)合方式,分別在299 K和309 K兩個(gè)恒溫溫度條件下(299 K接近室溫,309 K接近體溫)測(cè)定其猝滅常數(shù)。每個(gè)濃度條件下測(cè)定5次,計(jì)算平均值,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。樣品光譜均扣除了緩沖液的背景光譜。

1.2.2PG與BSA結(jié)合距離的計(jì)算取2 mL濃度為3.0×10-6mol/L的BSA溶液加入石英比色杯中,用微量進(jìn)樣器加入PG溶液使混合溶液中PG的終濃度同樣為3.0×10-6mol/L,充分混勻。熒光發(fā)射光譜檢測(cè):激發(fā)狹縫5 nm,發(fā)射狹縫10 nm,激發(fā)電壓700 V,激發(fā)波長(zhǎng)為278 nm,波長(zhǎng)掃描范圍300～400 nm,299 K恒溫條件;紫外吸收光譜檢測(cè):波長(zhǎng)掃描范圍200～700 nm,299 K恒溫條件。掃描次數(shù)5次,計(jì)算平均值,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,樣品光譜均扣除緩沖液的背景光譜。

1.2.3PG與BSA結(jié)合位點(diǎn)的判定取2 mL濃度為3.0×10-6mol/L的BSA溶液加入石英比色杯中,用微量進(jìn)樣器加入PG溶液使混合溶液中PG的終濃度同樣為3.0×10-6mol/L,充分混勻。用微量進(jìn)樣器每次加入定量的膽紅素(保證總體積幾乎不變的前提下使混合溶液中膽紅素的終濃度分別為0、3、6、9、12、15、18×10-6mol/L)每次加入混勻之后靜置,299 K溫度下充分作用10 min后開(kāi)始進(jìn)行檢測(cè)。熒光發(fā)射光譜檢測(cè):激發(fā)狹縫5 nm,發(fā)射狹縫10 nm,激發(fā)電壓700 V,激發(fā)波長(zhǎng)為278 nm,波長(zhǎng)掃描范圍300～400 nm,299 K恒溫條件。每個(gè)濃度條件下測(cè)定5次,計(jì)算平均值,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,樣品光譜均扣除了緩沖液的背景光譜。同種方法,以撲爾敏為探針,重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。

1.2.4金屬離子對(duì)PG與BSA結(jié)合作用的影響取2 mL濃度為3.0×10-6mol/L的BSA溶液加入石英比色杯中,用微量進(jìn)樣器加入AlCl3溶液使混合溶液中Al3+的終濃度同樣為3.0×10-6mol/L,充分混勻。再用微量進(jìn)樣器每次加入定量的PG溶液并充分混勻(保證總體積幾乎不變的前提下使混合溶液中PG的終濃度分別為0、1、5、10、15、20、25×10-6mol/L),299 K溫度下靜置作用10 min后開(kāi)始進(jìn)行熒光發(fā)射光譜檢測(cè)。檢測(cè)條件:激發(fā)狹縫5 nm,發(fā)射狹縫10 nm,激發(fā)電壓700 V,激發(fā)波長(zhǎng)為278 nm,掃描波長(zhǎng)范圍200～400 nm。每個(gè)濃度條件下測(cè)定5次,計(jì)算平均值,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,樣品光譜均扣除了緩沖液的背景光譜。采用同種方法,重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ca2+、Co2+以及Cu2+對(duì)PG與BSA結(jié)合作用的影響。

1.2.5同步熒光光譜測(cè)定PG對(duì)BSA構(gòu)象的影響樣品處理方法與熒光發(fā)射光譜檢測(cè)(1.2.1)相同。檢測(cè)條件:激發(fā)狹縫5 nm,發(fā)射狹縫10 nm,激發(fā)電壓700 V,恒溫299 K,波長(zhǎng)掃描范圍250～350 nm,分別記錄Δλ=15 nm和Δλ=60 nm(Δλ=激發(fā)光波長(zhǎng)-發(fā)射光波長(zhǎng))時(shí)的熒光光譜數(shù)據(jù)。每個(gè)濃度條件下測(cè)定5次,計(jì)算平均值,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,樣品光譜均扣除了緩沖液的背景光譜。

1.2.6圓二色譜測(cè)定PG對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響B(tài)SA樣品濃度3.0×10-6mol/L,PG處理終濃度分別為0、3、15×10-6mol/L。在AVIV Model 400型圓二色譜儀上記錄遠(yuǎn)紫外圓二色譜。掃描范圍為200～260 nm,激發(fā)光和發(fā)射光狹縫均設(shè)為1 nm,掃描速度設(shè)為中速,光譜校正設(shè)為開(kāi)啟以消除光柵和檢測(cè)器響應(yīng)的波長(zhǎng)依賴(lài)性。每個(gè)濃度條件下測(cè)定5次,計(jì)算平均值重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.7結(jié)合模擬(Docking)采用Autodock軟件(Scripps研究所),對(duì)PG和BSA的分子對(duì)接進(jìn)行模擬。Docking工具采用Autodock 4.2版本(MGL Tools for win)。配體與受體文件分別來(lái)源于Protein Data Bank(www.rcsb.org)與Pubchem(pubchem. ncbi. nlm.nih.gov)。后期使用Accelrys-Discovery Studio進(jìn)行分析和輸出。

1.3數(shù)據(jù)處理

1.3.1Stern-Volmer方程計(jì)算熒光猝滅機(jī)制

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

式(1)

其中:F0為未加猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度,F為加猝滅劑后的熒光強(qiáng)度,[Q]為猝滅劑濃度,Ksv為Stern-Volmer動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),Kq為動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù),τ0為生物大分子熒光平均壽命,大約為10-8s[10-11]。

1.3.2PG與BSA結(jié)合常數(shù)和結(jié)合數(shù)的計(jì)算

lg[(F0-F)/F]=lg KA+n·lg[Q]

式(2)

其中F0與[Q]同上,KA為結(jié)合常數(shù),n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)[12]。

1.3.3結(jié)合模式的判定范氏霍夫方程:

lnΔ(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

式(3)

ΔG=-RTlnK

式(4)

ΔS=-(ΔG-ΔH)/T

式(5)

其中T1、T2為不同溫度,K1、K2為不同溫度下藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合常數(shù),R為氣體分子常數(shù),ΔH為焓變,ΔG為吉布斯自由能變化值,ΔS為熵變。在藥物與生物大分子的反應(yīng)中,其主要作用類(lèi)型可根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)參數(shù)ΔH焓變和ΔS熵變的大小來(lái)判斷。

當(dāng)ΔH>0,ΔS>0時(shí)為疏水作用力;當(dāng)ΔH<0,ΔS<0時(shí)為氫鍵和范德華力;當(dāng)ΔH≈0,ΔS>0時(shí)為靜電引力[13]。

1.3.4結(jié)合距離的計(jì)算F?rster的偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論:

E=R06/(R06+r6)

式(6)

R06=8.8×10-25K2n-4ΦJ

式(7)

J=∑F(λ)ε(λ)λ4Δλ/∑F(λ)Δλ

式(8)

E是授體與受體間能量轉(zhuǎn)移效率,F和F0分別為存在和不存在能量接受體時(shí)能量給予體的熒光發(fā)射強(qiáng)度,R0是轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離,K2為偶極空間取向因子,n為介質(zhì)的折射指數(shù),Φ為授體的熒光量子產(chǎn)率,J為授體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜間的光譜重疊積分,F(λ)為熒光授體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度,ε(λ)為受體在波長(zhǎng)λ處的摩爾消光系數(shù),r為藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)結(jié)合位置處蛋白質(zhì)分子中熒光發(fā)射基團(tuán)之間的距離[14-15]。

1.3.5分子探針相關(guān)判定Sudlow等提出的探針取代計(jì)算方法[16]:

P(Probe displacement)(%)=F2/F1×100

式(9)

1.3.5結(jié)合模擬(Docking)相關(guān)軟件及說(shuō)明均來(lái)自http://autodock. scripps. edu/和http://accelrys. com/[10]。

2　結(jié)果與討論

2.1熒光發(fā)射光譜檢測(cè)PG與BSA的相互作用

不同的熒光基團(tuán)在有特定的熒光激發(fā)波長(zhǎng)的情況下能發(fā)出內(nèi)源性熒光。在BSA中含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基,均有內(nèi)源熒光現(xiàn)象,并且它們的內(nèi)源熒光對(duì)BSA的三級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象穩(wěn)定性的改變非常敏感,所以它們的光譜測(cè)定和分析可以作為研究BSA構(gòu)象改變的工具。

如圖1(A)所示,在298 K的溫度條件下,當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)λex=278 nm時(shí)(色氨酸為熒光的主要貢獻(xiàn)基團(tuán)),BSA所發(fā)出內(nèi)源性熒光的波峰位于342 nm左右,而PG本身在這附近沒(méi)有熒光發(fā)射峰,表明其色氨酸殘基處于一個(gè)相對(duì)疏水環(huán)境下[10-12]。固定BSA濃度,隨著PG作用濃度的增加,BSA的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度發(fā)生了規(guī)律性的減弱,這說(shuō)明PG與BSA發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用并導(dǎo)致了BSA內(nèi)源性熒光發(fā)生猝滅[10-12]。光譜學(xué)證明,熒光峰值的移動(dòng)表明發(fā)色基團(tuán)所處的微環(huán)境發(fā)生了空間構(gòu)象變化。研究結(jié)果顯示隨著PG作用濃度的增加,本身位于342 nm處的熒光峰值有輕微藍(lán)移(藍(lán)移0.5 nm),這暗示了色氨酸殘基周?chē)h(huán)境的疏水性有微弱增加[10-12],但是值得注意的是不管是波峰位置還是波形的變化都不是非常的明顯,造成這一現(xiàn)象的原因可能是其它的熒光基團(tuán)對(duì)色氨酸的熒光光譜產(chǎn)生了干擾,因此,在下文中將采用同步熒光光譜進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)λex=295 nm時(shí)(圖1B),與色氨酸的熒光光譜相似,隨著PG作用濃度的增加,酪氨酸殘基熒光強(qiáng)度也明顯發(fā)生淬滅,波峰幾乎沒(méi)有發(fā)生移動(dòng),暗示PG與BSA發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用,但是酪氨酸殘基的微環(huán)境并沒(méi)有發(fā)生明顯變化。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn),當(dāng)檢測(cè)溫度為308 K(略)時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與299 K條件下相似。因BSA包含了兩個(gè)色氨酸殘基,分別位于其氨基酸序列的134位和213位上,134位Trp殘基暴露于親水環(huán)境中,而213位Trp殘基則處于疏水腔中,并可與多種配體基團(tuán)結(jié)合[16],所以后文將重點(diǎn)對(duì)激發(fā)光λex=278 nm時(shí)情況進(jìn)行探討。

圖1　PG與BSA相互作用的熒光光譜圖Fig.1　BSA fluorescence spectra in the presence of PG注:圖A和圖B分別是激發(fā)光為278 nm和295 nm時(shí)PG與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜。檢測(cè)條件:pH=7.4,溫度為298 K,BSA的濃度為3×10-6 mol/L,曲線1～7分別代表PG的作用濃度為0、1、5、10、15、20、25×10-6 mol/L。

2.2PG對(duì)BSA猝滅方式的判定

眾所周知,根據(jù)熒光猝滅機(jī)制的不同,猝滅方式可分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。在不同溫度條件下檢測(cè)樣品體系的熒光特征,能夠有效的區(qū)分這兩種淬滅方式。簡(jiǎn)單的說(shuō),如果是動(dòng)態(tài)淬滅,隨著檢測(cè)溫度的升高,熒光物質(zhì)分子與猝滅劑之間的有效碰撞次數(shù)、能量轉(zhuǎn)移效率均會(huì)增加,從而導(dǎo)致淬滅常數(shù)升高;相反,假如是,靜態(tài)淬滅隨著檢測(cè)溫度的升高,會(huì)降低猝滅劑-熒光分子復(fù)合物的穩(wěn)定性,從而導(dǎo)致淬滅常數(shù)的降低[10-11]。根據(jù)Stern-Volmer方程[公式(1)],將F0/F對(duì)[Q]作圖,可求得Ksv與Kq。從圖2中可以看到,在兩個(gè)溫度條件下,按Stern-Volmer方程作圖分別得到一條直線,即斜率均是固定值,這表明在檢測(cè)體系中只存在一種熒光體,并且對(duì)于淬滅體都是可接近的。隨著溫度的增加,擬合曲線的斜率減小,即猝滅常數(shù)變小,這表明由于PG與BSA形成了復(fù)合物,復(fù)合物在溫度升高時(shí)穩(wěn)定性降低導(dǎo)致熒光猝滅效應(yīng)變?nèi)?這是靜態(tài)猝滅的標(biāo)志性特點(diǎn)[17]。并且通過(guò)計(jì)算,Kq的數(shù)量級(jí)為1012(表1),遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散控制的碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·mol-1·s-1,從另一個(gè)方面證實(shí)了PG對(duì)BSA的熒光猝滅方式為靜態(tài)猝滅[17]。

圖2　不同溫度下PG猝滅BSA的Stern-Volmer曲線Fig.2　The Stern-Volmer polts of BSA quenched by PG注:激發(fā)波長(zhǎng)λex=278 nm,pH=7.4,直線1和2分別為檢測(cè)溫度為299 K和309 K時(shí)的Stern-Volmer擬合曲線。

溫度(K)Ksv(×104L·mol-1)Kq(×1012L·mol-1·s-1)r2991.12501.12500.9873090.76300.76300.991

注:Ksv為Stern-Volmer動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),Kq為動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù),r是Stern-Volmer方程的相關(guān)系數(shù)。

2.3PG與BSA結(jié)合常數(shù)和結(jié)合數(shù)的計(jì)算

在蛋白和小分子相互作用的過(guò)程中,結(jié)合常數(shù)KA通常用來(lái)表示蛋白和小分子結(jié)合的強(qiáng)度,而結(jié)合數(shù)n表示小分子與蛋白結(jié)合作用時(shí)兩者數(shù)量之比。它們的測(cè)算對(duì)于后續(xù)研究藥物與蛋白的相互作用關(guān)系非常重要,而在靜態(tài)猝滅過(guò)程中,它們之間的關(guān)系滿足公式(2)[12]。以lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]作圖,可以求出n和KA。

通過(guò)計(jì)算,在299 K條件下,PG與BSA的結(jié)合常數(shù)KA=1.0281×105L·mol-1(表2),明顯比一般配體-蛋白的結(jié)合常數(shù)要大[18-19],這表明PG同BSA具有較高的親和能力,發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用,暗示PG能夠通過(guò)BSA蛋白在體內(nèi)進(jìn)行儲(chǔ)存和運(yùn)輸,同時(shí)也意味著PG在功能性食品開(kāi)發(fā)中具有廣泛的潛在應(yīng)用前景。當(dāng)測(cè)試溫度升高到309 K時(shí),研究發(fā)現(xiàn)PG與BSA的結(jié)合常數(shù)降低了接近10倍,表明在較高溫度下,PG-BSA復(fù)合物發(fā)生了分解,進(jìn)一步暗示PG與BSA作用方式為靜態(tài)結(jié)合。同時(shí)通過(guò)計(jì)算還發(fā)現(xiàn),在299 K和309 K兩個(gè)溫度條件下,PG與BSA的結(jié)合數(shù)n分別為0.848和1.035,這兩個(gè)數(shù)值都非常接近于1,反映出PG與BSA可能采取1∶1分子比的方式進(jìn)行結(jié)合,暗示在BSA上可能只有一個(gè)PG的結(jié)合位點(diǎn)[10]。

圖3　利用雙對(duì)數(shù)作圖求得不同溫度下PG與BSA的結(jié)合常數(shù)Fig.3　Double-logarithm plot of PG quenching effect on BSA fluorescence at different temperature

溫度(K)KA(×105L·mol-1)結(jié)合數(shù)nr2991.02810.8480.9953090.11481.0350.992

注:檢測(cè)條件:pH=7.4;激發(fā)波長(zhǎng)λex=278 nm。KA為結(jié)合常數(shù),n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù),r是方程的相關(guān)系數(shù)。

2.4PG與BSA結(jié)合作用力的判定

通過(guò)考察蛋白與小分子之間結(jié)合作用力的判定,可以對(duì)其結(jié)合作用進(jìn)行更深入的闡釋,它們相互之間的結(jié)合力主要有疏水作用力、靜電作用力、范德華力及氫鍵作用等。Ross等[13]總結(jié)了一系列熱力學(xué)的規(guī)則,并提出了判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)和生物大分子自身結(jié)合力性質(zhì)的模型。當(dāng)反應(yīng)溫度變化在一個(gè)小范圍的時(shí)候,反應(yīng)的焓變?chǔ)可以視為一個(gè)固定的常數(shù)。因此根據(jù)熱力學(xué)模型利用方程(3)～(5)求解,即可確定分子間作用力的類(lèi)型與結(jié)合的模式.

計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3,可知ΔH<0且ΔS<0,這種情況通常是由氫鍵和范德華力引起[13],因此PG與BSA間的結(jié)合應(yīng)該主要由氫鍵與范德華力進(jìn)行維持。

表3　PG與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

注:檢測(cè)條件:pH=7.4;激發(fā)波長(zhǎng)λex=278 nm。ΔH為焓變,ΔG為吉布斯自由能變化值,ΔS為熵變。

2.5PG與BSA結(jié)合距離的計(jì)算

根據(jù)F?rster的偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論,當(dāng)給體與受體濃度相近時(shí),如給體熒光光譜與受體紫外吸收光譜存在疊加且兩者距離小于7 nm,那么有可能發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移[14]。圖4為299 K溫度條件下BSA的熒光光譜與PG的紫外吸收光譜(309 K的圖略),根據(jù)公式(6)～(8)可求出該P(yáng)G與BSA的結(jié)合距離(表4)。當(dāng)K2、n-4、Φ分別取2/3、1.36和0.15時(shí)[15],299 K溫度條件下求出PG與BSA間能量轉(zhuǎn)移效率為52.17%,轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離R0=1.74 nm,PG與BSA結(jié)合距離r=1.71 nm。當(dāng)溫度升高到309 K時(shí),PG與BSA間能量轉(zhuǎn)移效率下降到42.86%,同時(shí)結(jié)合距離r變大,造成這一現(xiàn)象的原因是在較高溫度下,PG-BSA復(fù)合物的穩(wěn)定性降低,結(jié)合常數(shù)下降。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn),不同溫度條件下所得r值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于7 nm,這表明供體BSA色氨酸殘基與受體PG在空間上靠的非常接近,暗示BSA與PG發(fā)生并形成了非輻射能量轉(zhuǎn)移。

圖4　BSA的熒光光譜與PG的紫外吸收光譜Fig.4　The overlap of the fluorescence spectrum of BSA and the absorbance spectrum of PG注:激發(fā)波長(zhǎng)為278 nm;pH=7.4;T=299 K;CBSA=CPG=3.0×10-6 mol L-1。

溫度(K)E(%)R0(nm)r(nm)29952.171.741.7130942.861.741.82

注:E是授體與受體間能量轉(zhuǎn)移效率,R0是轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離,r為PG與結(jié)合位置處BSA色氨酸熒光發(fā)射基團(tuán)之間的距離。

2.6PG與BSA結(jié)合位點(diǎn)的判定

BSA包含了兩個(gè)色氨酸殘基,分別位于其氨基酸序列的134位和213位上。134位Trp殘基暴露于親水環(huán)境中,而213位Trp殘基則處于疏水腔中,并可與多種配體基團(tuán)結(jié)合[16]。Klaus J Fehske[20]的研究表明,藥物在SA上的結(jié)合部位存在著以下三個(gè):吲哚及苯二氮卓結(jié)合部位;華法令及阿扎丙宗結(jié)合部位;洋地黃毒甙結(jié)合部位,每個(gè)結(jié)合部位都包含了兩個(gè)亞域。在控制藥物濃度的前提下,通過(guò)使用結(jié)合部位已知的熒光探針(即標(biāo)記配體),可以和對(duì)應(yīng)的藥物分子在蛋白的結(jié)合部位上進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,以此便可以確定藥物在蛋白質(zhì)上的結(jié)合部位。按Sudlow等提出的探針取代計(jì)算方法[公式(9)][16],選擇膽紅素(結(jié)合位點(diǎn)為亞結(jié)構(gòu)域IIA)和撲爾敏(結(jié)合位點(diǎn)為亞結(jié)構(gòu)域IIIA)作為熒光探針[10],對(duì)PG是否被取代進(jìn)行檢測(cè),從而判定PG在BSA上的結(jié)合位置。

由圖5可以看出,探針濃度不斷增大時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生以下變化:加入撲爾敏探針后,反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化;相反,在加入膽紅素后,反應(yīng)體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明膽紅素很可能取代了PG在BSA上的結(jié)合,因膽紅素在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)位于亞結(jié)構(gòu)域IIA上,這也就暗示PG在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)也位于亞結(jié)構(gòu)域IIA。

圖5　以膽紅素和撲爾敏為探針取代PG在BSA結(jié)合部位Fig.5　Probe displacement of PG-BSAby bilirubin and chlorpheniramine maleate注:激發(fā)光波長(zhǎng)278 nm;溫度298 K;pH=7.4;CBSA=CPG=3.0×10-6 mol/L;撲爾敏:C撲爾敏/CBSA=0、1、2、3、4、5、6;膽紅素:C膽紅素/CBSA=0、1、2、3、4、5、6。

2.7金屬離子對(duì)PG與BSA結(jié)合作用的影響

PG含多個(gè)酚羥基,有較強(qiáng)的金屬螯合能力,可與多種金屬離子形成配合物,而且所得配合物均為多個(gè)PG分子與單個(gè)金屬離子形成[12]。因此金屬離子的存在對(duì)PG的活性可能存在影響,以下對(duì)常見(jiàn)的幾種金屬離子存在時(shí)的結(jié)合過(guò)程進(jìn)行研究,得到的計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　不同金屬離子條件下PG與BSA的結(jié)合常數(shù)

注:激發(fā)波長(zhǎng)278 nm;pH7.4;溫度299 K;無(wú)金屬離子存在條件下KA=1.03×105L·mol-1。

從表5中可以看到金屬離子的存在對(duì)PG與BSA的結(jié)合存在一定程度影響,在有金屬離子存在的條件下,PG與BSA的結(jié)合常數(shù)明顯降低,表明PG與BSA的結(jié)合能力下降,其中,以Co2+降低最多,Cu2+降低最少。根據(jù)前面結(jié)合位點(diǎn)的判定,初步認(rèn)為可能是由于多個(gè)PG分子與金屬離子螯合形成配合物(其中以Co2+最易與PG形成配合物),使得PG分子結(jié)構(gòu)增大,對(duì)其進(jìn)入Trp213所在疏水腔產(chǎn)生一定阻礙作用,所以導(dǎo)致以上結(jié)合常數(shù)都有不同程度的降低。

表6　PG對(duì)BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變

注:采用CDNN軟件對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行估算,實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)次數(shù)為3次。

2.8同步熒光測(cè)定PG對(duì)BSA構(gòu)象的影響

在光譜學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),氨基酸殘基的最大熒光波長(zhǎng)與其所處環(huán)境的疏水性有關(guān)。如果氨基酸所處環(huán)境的疏水性降低,將對(duì)其熒光性質(zhì)產(chǎn)生影響,表現(xiàn)為其最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移,因此根據(jù)熒光波長(zhǎng)的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。蛋白質(zhì)內(nèi),多種內(nèi)源熒光生色基團(tuán)會(huì)產(chǎn)生不同熒光,而普通的熒光光譜中能檢測(cè)到的發(fā)射峰存在一定程度的重疊,不易區(qū)分,而采用同步熒光光譜則可以將其區(qū)分開(kāi)來(lái),因此采用同步熒光光譜對(duì)BSA構(gòu)象變化進(jìn)行研究。

當(dāng)BSA濃度一定,PG濃度不斷增加時(shí),采用同步熒光光譜記錄Δλ=15 nm和Δλ=60 nm條件下熒光光譜數(shù)據(jù),如圖6所示。

圖6　PG與BSA相互作用的同步熒光光譜Fig.6　Synchronous fluorescence spectra of PG-BSA注:測(cè)試溫度299 K,pH=7.4,BSA濃度為3.0×10-6 mol/L;圖A和圖B分別為Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時(shí)PG與BSA相互作用的同步熒光光譜;曲線1～7分別代表PG作用濃度為0、1、5、10、15、20、25×10-6 mol/L。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:當(dāng)Δλ=15 nm時(shí),隨著PG的濃度增加,同步熒光波峰強(qiáng)度略微降低,降低幅度為9.20%,而波峰位置幾乎沒(méi)有發(fā)生任何變化,這表明BSA中的酪氨酸殘基的疏水性和極性沒(méi)有發(fā)生明顯變化。而Δλ=60 nm時(shí),同步熒光波峰強(qiáng)度明顯降低,降幅為31.18%,并且最大發(fā)射波長(zhǎng)位置出現(xiàn)輕微的藍(lán)移(2 nm),這表明色氨酸殘基的環(huán)境極性減弱、疏水性逐漸增強(qiáng),肽鍵的伸展程度有所減弱,PG與BSA的作用改變了色氨酸殘基的微環(huán)境,色氨酸殘基“包埋”狀態(tài)增加[10-11],這與前文激發(fā)光為278 nm時(shí)發(fā)射光譜的結(jié)果吻合。這也證明PG分子是可以進(jìn)入BSA的立體結(jié)構(gòu)中的,不但使色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度發(fā)生淬滅,而且還能導(dǎo)致色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變,疏水性增加。

2.9圓二色譜分析PG對(duì)BSA構(gòu)象的影響

遠(yuǎn)紫外圓二色譜可以較為精確的測(cè)定蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,因此本文采用Far-UV CD光譜對(duì)PG和BSA的結(jié)合過(guò)程進(jìn)行了研究,以探討PG是否能夠誘導(dǎo)BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變換。如圖7所示,BSA在208 nm和222 nm處有兩個(gè)負(fù)峰,屬于典型的高比例α-螺旋結(jié)構(gòu)蛋白。

圖7　遠(yuǎn)紫外圓二色譜分析PG與BSA的結(jié)合作用Fig.7　The far-UV CD spectra of PG with BSA注:測(cè)試溫度299 K,pH=7.4,BSA濃度為3.0×10-6 mol/L;曲線1～3分別代表PG作用濃度為0、3、15×10-6 mol/L。

通過(guò)CDNN軟件對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的估算發(fā)現(xiàn),由于PG的結(jié)合導(dǎo)致了BSA中規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)的減少以及無(wú)規(guī)則卷曲的增加,其中主要是α-螺旋結(jié)構(gòu)的減少(表6)。天然狀態(tài)下的BSA含有54.3%α-螺旋,9.8%β-折疊,14.1%β-轉(zhuǎn)角以及21.8%無(wú)規(guī)則卷曲。而與PG進(jìn)行結(jié)合后,α-螺旋所占比例降低到52.9%,而無(wú)規(guī)則卷曲比例增加到22.6%,β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的比例在結(jié)合前后沒(méi)有顯著的變化,這說(shuō)明PG對(duì)其并未產(chǎn)生顯著的影響。

2.10分子結(jié)合模擬

為研究PG與BSA的結(jié)合位點(diǎn),還可以采用分子對(duì)接模擬的方法。配體與受體的相互作用是分子識(shí)別的過(guò)程,其中主要包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華作用等。通過(guò)分子模擬,可以預(yù)測(cè)兩者之間的結(jié)合模式、作用距離和作用力等,從而進(jìn)行藥物的虛擬篩選等研究工作[13]。Autodock是一套Scripps的Olson科研小組開(kāi)發(fā)的分子對(duì)接軟件包,采用模擬退火和遺傳算法來(lái)尋找受體和配體最佳的結(jié)合位置,用半經(jīng)驗(yàn)的自由能計(jì)算方法來(lái)評(píng)價(jià)受體和配體之間的匹配情況用來(lái)自動(dòng)分子對(duì)接的軟件,可以預(yù)測(cè)小分子是如何與已知三維結(jié)構(gòu)的受體結(jié)合的[14]。通過(guò)Autodock軟件,在之前研究的基礎(chǔ)上,對(duì)PG和BSA的分子對(duì)接實(shí)現(xiàn)了模擬(圖8)。

圖8　PG與BSA結(jié)合的分子對(duì)接Fig.8　The docking result of PG with BSA注:A、B和C分別為PG與BSA結(jié)合分子對(duì)接的表面、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及微環(huán)境示意圖。

在圖8A、B中,通過(guò)展示分子表面,可以發(fā)現(xiàn)PG結(jié)合點(diǎn)位于BSA的Trp213附近的疏水腔內(nèi)(即BSA的亞域結(jié)構(gòu)IIA中),此位置可結(jié)合大多數(shù)的小分子藥物。為進(jìn)一步查看PG與BSA作用的微環(huán)境,列出了結(jié)合位點(diǎn)附近對(duì)結(jié)合作用貢獻(xiàn)較大的氨基酸殘基(圖8C),分別是Aeg208、Ala209、Ala212、Trp213、Leu346、Ala349、Lys350和Glu353。其中PG與Trp213在空間上非?？拷?距離僅為1.84 nm,與之前計(jì)算得到PG-BSA的結(jié)合距離1.71 nm非常接近。這也解釋了為什么PG與BSA結(jié)合會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源熒光發(fā)生淬滅的原因:PG通過(guò)結(jié)合到Trp213附近的疏水腔,引起周?chē)被釟埢h(huán)境發(fā)生變化,導(dǎo)致Trp213周?chē)穸仍黾?空間結(jié)構(gòu)更加嚴(yán)密,從而表現(xiàn)出BSA內(nèi)源熒光的猝滅變化。

3　結(jié)論

利用光譜法對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)改變進(jìn)行研究,是比較經(jīng)典的技術(shù)手段,本文通過(guò)應(yīng)用光譜法,對(duì)PG和BSA的相互作用進(jìn)行了較為詳細(xì)的考察和論述。研究發(fā)現(xiàn)PG對(duì)BSA的內(nèi)源熒光產(chǎn)生了猝滅作用,進(jìn)一步的光譜分析表明其猝滅機(jī)制是靜態(tài)猝滅,兩者通過(guò)形成藥物-蛋白復(fù)合物,使得BSA熒光峰值發(fā)生藍(lán)移。通過(guò)計(jì)算得到了其結(jié)合作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合數(shù)等基本參數(shù),在熱力學(xué)模型的指導(dǎo)下,還進(jìn)一步得出了其作用力類(lèi)型主要是氫鍵和范德華力,結(jié)合距離約為1.71 nm。根據(jù)Sudlow等[16]提出的探針取代方法,利用膽紅素和撲爾敏兩種結(jié)合在BSA不同位點(diǎn)的探針,對(duì)PG進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合后表明其結(jié)合部位與膽紅素一致,位于BSA上的亞域結(jié)構(gòu)IIA,這一位點(diǎn)還可結(jié)合華法令、p-ABE、DNSA等小分子藥物,位于Trp213附近的疏水腔內(nèi),這一結(jié)果,與先前PG與HSA相互作用的結(jié)果非常類(lèi)似[10]。經(jīng)過(guò)遠(yuǎn)紫外圓二色譜的測(cè)定發(fā)現(xiàn)PG對(duì)BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。BSA是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)為主的蛋白,氫鍵對(duì)其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性維持是非常重要的,而遠(yuǎn)紫外圓二色譜的結(jié)果表明BSA在PG存在的情況下,α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生減少,無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加。同步熒光光譜結(jié)果表明PG與BSA的結(jié)合導(dǎo)致BSA的構(gòu)象發(fā)生了一定程度的變化,表現(xiàn)為色氨酸殘基的環(huán)境極性減弱、疏水性逐漸增強(qiáng),色氨酸殘基“包埋”狀態(tài)增加。這證明PG分子的確可以進(jìn)入BSA的立體結(jié)構(gòu)中,使得BSA構(gòu)象發(fā)生變化。同時(shí),采用分子對(duì)接的方式模擬PG與BSA的結(jié)合,通過(guò)計(jì)算自由能,推算了最佳結(jié)合構(gòu)象,研究結(jié)果表明PG正是通過(guò)進(jìn)入Trp213附近的疏水腔,與周?chē)被釟埢嗷プ饔?從而引起了BSA的上述一系列變化。其結(jié)合距離與之前熱力學(xué)模型所得計(jì)算值較為相符,能夠相互印證。此外本文還考察了在常見(jiàn)金屬離子的存在情況下,PG與BSA結(jié)合作用受到的影響,提出了PG-金屬螯合物的出現(xiàn)影響PG-BSA結(jié)合作用這一初步解釋。

本文通過(guò)研究PG與BSA的結(jié)合過(guò)程,初步闡明了PG與BSA的相互作用的基本信息,為PG在血液中的結(jié)合與運(yùn)輸模式研究以及其作為食品抗氧化劑、藥物的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)工作提供了理論基礎(chǔ)。

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Study on the interaction between propyl gallate and bovine serum albumin using fluorescence spectroscopy and molecular docking

ZHU Guo-fei1,TENG Teng2,DENG Bin1

(1.Guizhou Institute of Technology,Guiyang 550003,China;2.College of Life Sciences,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

The interaction between propyl gallate(PG)and BSA was studied by the spectroscopy methodinvitro. The quenching mechanism was a static quenching procedure,and the binding constants KAbetween PG and BSA was obtained to be 1.03×105L·mol-1while the binding distance was calculated as 2.2 nm at 299 K. The thermodynamic calculations suggested the van der Waals interactions and the hydrogen bonds play a major part in the interaction between BSA and PG. The further study of binding site showed there was one PG-binding site in the subdomain IIA of BSA. CD spectroscopic further showed that drug complexation altered protein conformation by a major reduction ofα-helix inducing a partial protein destabilization. In addition,the result of autodocking for PG and BSA was simulated,and the parameters of the binding were accorded with the results of the calculation.

propyl gallate;bovine serum albumin;fluorescence spectroscopy;interaction

2016-04-11

朱國(guó)飛(1985-)，男，博士，副教授，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail:1966243910@qq.com。

貴州省教育廳自然科學(xué)研究招標(biāo)項(xiàng)目(黔教合KY字[2015]368)；貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合LH字[2015]7102)。

TS202.3

A

1002-0306(2016)18-0158-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.022