林素英,謝文燕,何松濤,蔡麗娜,謝曉梅,吳錦程,*

(1.莆田學院環(huán)境與生物工程學院,福建莆田 351100;2.福建省新型污染物生態(tài)毒理效應與控制重點實驗室,福建莆田 351100)

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不同品種枇杷果實酚類物質(zhì)及其抗氧化活性分析

林素英1,2,謝文燕1,何松濤1,蔡麗娜1,謝曉梅1,吳錦程1,2,*

(1.莆田學院環(huán)境與生物工程學院,福建莆田 351100;2.福建省新型污染物生態(tài)毒理效應與控制重點實驗室,福建莆田 351100)

以福建主產(chǎn)“早鐘6號”、“長紅3號”、“解放鐘”和“白梨”與引進的“寧海白”枇杷為試材,研究其酚類物質(zhì)組成與抗氧化能力,并進行相關性分析。結(jié)果表明,枇杷果實果肉總酚含量范圍為327.31～615.22 μg/g,高低順序為“解放鐘”>“早鐘6號”>“寧海白”>“白梨”>“長紅3號”;酚類物質(zhì)對DPPH自由基均有良好的清除效果,表明對鐵離子均有較強的還原能力,可以作為天然抗氧化材料進行開發(fā)應用,總抗氧化能力“寧海白”>“早鐘6號”>“解放鐘”>“長紅3號”>“白梨”。HPLC檢測5個品種枇杷均含有新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、鞣花酸、阿魏酸等7種酚單體,但含量差異較大,其中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸含量較高,且與抗氧化能力顯著正相關,綠原酸在5個品種中的含量差異達到顯著水平(p<0.05)。

枇杷,品種,抗氧化能力,酚類物質(zhì),綠原酸

酚類物質(zhì)是植物重要的次生代謝產(chǎn)物之一,廣泛存在于植物中,影響植物的品質(zhì)[1],由于酚類物質(zhì)結(jié)構中攜有一個或多個羥基,對自由基有良好的清除能力,表現(xiàn)出很強的抗氧化活性,因而植物酚類物質(zhì)及抗氧化活性研究成為近年農(nóng)業(yè)科研領域的熱點[2-3],在枇杷葉[4]、花[5-6]、核[7]、果[8-9]已有相關報道。研究表酚類具體的組成及各成分含量與抗氧化能力有很高的相關性[10],在枇杷花[11]、葉[12]中也得到相同結(jié)果,枇杷果實中酚類的組成研究較少,僅張文娜[13]、徐紅霞[10]等研究了浙江10個品種的枇杷果實酚類物質(zhì)組成,其他品種尚未見報道。福建是枇杷的主產(chǎn)區(qū)之一,2013年年產(chǎn)量達23.7萬噸[14],主栽的品種有紅肉系的“早鐘6號”、“長紅3號”、“解放鐘”和白肉系的“白梨”等[15-16],本實驗以這4種枇杷果實為試材,采用超聲波輔助乙醇提取法提取其中的酚類物質(zhì),用DPPH法(DPPH自由基清除法)和FRAP法(鐵還原比色法)來評價其抗氧化能力,并使用高效液相色譜法分析酚類組成,研究不同品種果實酚類組成與抗氧化性關系,并與已研究較多的“寧海白”比較,以期為枇杷深加工提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

5種枇杷果實莆田市果樹研究所提供,按成熟時間分為早熟的“早鐘6號”,中熟的“長紅3號”和“寧海白”,中晚熟的“白梨”及晚熟的“解放鐘”,果實于正常食用成熟度采收,當天運至實驗室,選取成熟度一致、無蟲害、無明顯損傷、果實飽滿的枇杷置于-70 ℃超低溫冰箱冷凍保存待用;表兒茶酸、鞣花酸、咖啡酸、阿魏酸、綠原酸美國Sigma公司;新綠原酸、隱綠原酸、TPTZ(2,4,6-反式2-吡啶基三嗪)、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈色譜純，國藥集團化學試劑有限公司;其他試劑分析純;實驗用水超純水。

Agilent 1100高效液相色譜儀美國Agilent公司采用紫外檢測器ZORBAXSB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);722-型可見分光光度計上海光譜儀器有限公司;KQ-100DE型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;KDC-40低速離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司;Ultra pure超純水機上海和泰儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1枇杷果實酚類物質(zhì)提取果實從冰箱取出去皮去核后,果肉迅速切成碎末,準確稱取10.000 g,加入30 mL 70%乙醇溶液,浸泡1 h,超聲提取20 min(溫度30 ℃,功率200 W),再以5000×g的轉(zhuǎn)速離心20 min,減壓抽濾得到濾液,濾液用70%乙醇定容至50 mL,即為枇杷果實提取液,用于測定DPPH·的清除能力和鐵離子還原能力及濃縮后用于酚類物質(zhì)分析。

1.2.2總酚含量測定采用Folin-Ciocaileu比色法測多酚含量[17],取1 mL提取液加入20 mL水,2.5 mL FoLin-CiocaLteu試劑,反應5 min后加入2.5 mL飽和碳酸鈉溶液,最后加水定容至50 mL靜置2 h,于765 nm波長處測定其吸光度。以沒食子酸(GAE)為標樣繪制標準曲線,根據(jù)標準曲線計算樣品中總酚含量,結(jié)果以樣品中含有的沒食子酸當量(μg/g FW)表示。

1.2.3提取液枇杷果實抗氧化能力的測試

1.2.3.1清除DPPH·能力的測定參照文獻[18]加以修改,DPPH乙醇溶液濃度為2.13×10-4mol/L,取等體積的DPPH溶液和枇杷提取液混合,室溫避光反應30 min后于517 nm波長處測定其吸光度(Ai);等體積的DPPH溶液和乙醇混合,測溶液的吸光值(A0);等體積的提取液和乙醇混合,測溶液的吸光值(Aj)。記錄A0,Ai和Aj,按下列公式計算清除率IP:

IP(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100。

1.2.3.2鐵離子還原力測定參照文獻[19]方法測試提取液FRAP值。取1 mL提取液,稀釋至25 mL。取該稀釋液1 mL,加入2.7 mL FRAP工作液(20 mmol/L三氯化鐵溶液、300 mmol/L醋酸鹽緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液按1∶10∶1配制),加入6 mL水,37 ℃下反應10 min后測定593 nm處的吸光度。以硫酸亞鐵銨溶液為標樣繪制標準曲線,以達到相同吸光度所需硫酸亞鐵的量來計算樣品FRAP值,單位為mmol/L。

1.2.4枇杷果實提取液的HPLC分析

1.2.4.1HPLC檢測條件色譜柱:Kromasil C18(150 mm×4.6 mm);進樣量:20 μL;流速:0.8 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:280 nm;流動相A:5%乙酸水溶液;流動相B:100%乙腈。梯度洗脫程序[20]:0～25 min時A從90%降至70%,25～35 min時A從70%升回至90%。

1.2.4.2酚單體的HPLC分析分別準確稱取7種酚單體對照品,用色譜純的甲醇溶解,配制成0.1 mg/mL的溶液,測定其保留時間。再配制各酚單體濃度為0.1 mg/mL的混合對照品溶液并逐級稀釋,測定峰面積,計算得到濃度與峰面積的回歸方程,溶液測試前過0.45 μm的濾膜。

1.2.4.3樣品的處理與分析取25 mL的提取液減壓蒸餾除去乙醇,再用正己烷萃取3次,通過減壓蒸餾除去正己烷后,用甲醇定容到5 mL,用于HPLC分析,溶液測試前過0.45 μm的濾膜,采用外標法計算含量。

1.3綜合抗氧化能力指數(shù)(APC)的計算

參照文獻[21]計算綜合抗氧化能力指數(shù)(APC)來進行提取液中酚類物質(zhì)抗氧化活性的總體比較:

APC指數(shù)=∑[每種方法測定值/(每種方法測定最大值×測試方法總數(shù))]

1.4數(shù)據(jù)分析

所有測定重復3次,運用Origin 8.5軟件進行數(shù)據(jù)作圖,運用SPSS 20軟件進行數(shù)據(jù)分析:單因素顯著性分析(One-way analysis of variance,ANOVA),皮爾森相關性分析(Pearson’s correlation analysis)。所得結(jié)果采用平均數(shù)據(jù)±標準偏差表示。

2　結(jié)果與分析

2.1不同品種枇杷果實總酚含量與抗氧化活性分析

表1　不同品種枇杷果實酚類物質(zhì)含量比較(μg/g FW)

注:同行不同字母表示差異顯著,p<0.05；表2同。

表2　不同品種枇杷果實提取物抗氧化能力比較

沒食子酸線性回歸方程為y=0.0078x+0.0026,R2=0.9986,線性范圍:4.10～28.67 mg/L。對照回歸方程可得5個品種枇杷果實的總酚含量介于327.31～615.22 μg/g之間(見表1),高低順序為“解放鐘”>“早鐘6號”>“寧海白”>“白梨”>“長紅3號”,其中“寧海白”的總酚含量與馮健君[22]的報道吻合,比徐紅霞[9]的結(jié)果低,可能是由生長環(huán)境及成熟度不同引起?！霸珑?號”與“解放鐘”果實的總酚含量接近于“長紅3號”與“白梨”含量的2倍,組間差異達到顯著水平。

由表2可知道,5個品種枇杷果實提取液均有抗氧化活性,其中DPPH法顯示清除能力排序為 “寧海白”>“早鐘6號”>“長紅3號”>“解放鐘”>“白梨”,“早鐘6號”與“解放鐘”、“白梨”的差異達到顯著水平;FRAP法(回歸方程為y=0.9686x-0.0333,R2=0.9982,線性范圍:0.2～2.0 mmol/L測定的結(jié)果顯示各品種抗氧化能力排序為“寧海白”>“早鐘6號”>“解放鐘”>“長紅3號”>“白梨”。DPPH法主要評價物質(zhì)的清除自由基能力,FRAP法評價物質(zhì)的還原能力[13],測試方法不同,響應物不同,2種評價結(jié)果不完全一致說明反應底物可能有區(qū)別,可進一步分析其組成。

綜合抗氧化能力指數(shù)APC顯示福建產(chǎn)的紅肉系的“早鐘6號”、“解放鐘”、“長紅3號”總抗氧化活性高于白肉系的“白梨”,“早鐘6號”正是福建主栽的枇杷品種,抗氧化能力較高說明其在營養(yǎng)保健方面有一定優(yōu)勢。

2.2不同品種枇杷果實酚類物質(zhì)組成分析

2.2.1不同品種枇杷果實的酚類物質(zhì)組成定性定量分析參考文獻報道[23-24],通過對比對照品、樣品及加標樣品的保留時間,用HPLC法共鑒定出7種酚類物質(zhì),按出峰時間排序為:新綠原酸,綠原酸,隱綠原酸,表兒茶素,咖啡酸,鞣花酸,阿魏酸(圖1)。各酚含量總體上為綠原酸>新綠原酸>隱綠原酸>表兒茶素>阿魏酸>咖啡酸>鞣花酸(表1),綠原酸含量明顯高于其他酚類物質(zhì),與報道相符[25],且其在5個品種中的含量差異達到顯著水平,其中“寧海白”中最高,“早鐘6號”次之;新綠原酸和隱綠原酸的含量大小順序均為“寧海白”>“早鐘6號”>“長紅3號”>“解放鐘”>“白梨”;表兒茶素、咖啡酸、鞣花酸和阿魏酸的含量較低,大小順序隨品種變化較大。整體上看“寧海白”和“早鐘6號”的各種酚單體含量均比較高,“白梨”最低;“長紅3號”與“解放鐘”中的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、表兒茶素等的含量差異均達到顯著水平,但總含量相近,這與其總抗氧化能力大小相符。

圖1　5種枇杷果實酚類組成HPLC圖Fig.1　HPLC chromatogram of phenolic compounds in loquat fruit of five cultivars注：1-新綠原酸，2-綠原酸，3-隱綠原酸，4-表兒茶素，5-咖啡酸，6-鞣花酸，7-阿魏酸。

表3　枇杷果實抗氧化物質(zhì)成分與抗氧化能力相關性分析

注:*,在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關;**,在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關。

2.2.2枇杷果實抗氧化物質(zhì)組成與抗氧化能力相關性分析從表3可見,總酚含量及HPLC法測定的總含量與DPPH清除能力、FRAP值都呈正相關關系,其中與總酚含量DPPH的相關性到達顯著水平,但酚單體與抗氧化能力DPPH、FRAP的關系不盡相同。其中新綠原酸、綠原酸含量與DPPH呈顯著的正相關(r分別為0.941、0.887,p均小于0.05),與FRAP存在正相關。隱綠原酸含量與DPPH存在極顯著的線性正相關關系(r=0.963,p小于0.01),與FRAP存在正相關但相關性不顯著。表兒茶素含量與DPPH、FRAP;咖啡酸含量與DPPH、FRAP;鞣花酸含量與DPPH均呈中等強度相關但影響效果不顯著。其它酚單體與抗氧化能力的相關性較弱,可能是因為含量較低或者本身抗氧化能力比較弱。

3　結(jié)論

運用2種方法來評價枇杷果實抗氧化能力,結(jié)果表明“寧海白”的抗氧化能力最高,“白梨”的抗氧化能力最低。福建產(chǎn)的枇杷抗氧化能力為:紅肉枇杷果實>白肉枇杷果實,“早鐘6號”最高。HPLC檢測表明在5種枇杷果實中均存在7種酚類物質(zhì),分別是新綠原酸,綠原酸,隱綠原酸,表兒茶素,咖啡酸,鞣花酸,阿魏酸。綠原酸含量最高,其次是新綠原酸、隱綠原酸,這三種酚含量與抗氧化能力顯著正相關,是主要的抗氧化性活性酚類物質(zhì)。

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Phenolic contents and antioxidant activity in the fruit of different loquat cultivars

LIN Su-ying1,2,XIE Wen-yan1,HE Song-tao1,CAI Li-na1,XIE Xiao-mei1,WU Jin-cheng1,2,*

(1.Environment & Biological Engineering of Putian University,Putian 351100,China;2.Fujian Provincial Key Laboratory of Ecology-toxicological Effects & Control for Emerging Contaminants,Putian 351100,China)

Five loquat cultivars were used as the experimental materials,including “Zaozhong No.6”,“Changhong”,“Jiefangzhong” and “Baili” in Fujian province and the introduced “Ninghaibai” loquat. The composition and contents of phenolic compounds in the fruit pulp were determined. Meanwhile,the antioxidant activities of phenolic extracts were evaluated,and the correlative analysis between antioxidant capacity and antioxidant composition was assessed. The results showed the total phenolic content was 327.31～615.22 μg/g,and the sequence of their contents was “Jiefangzhong”>“Zaozhong No.6”>“Ninghaibai”>“Baili”>“Changhong”. Phenols from 5 cultivars showed strong radical scavenging activity against DPPH and ferric reducing power,the antioxidant potency composite followed the order:“Ninghaibai”>“Zaozhong No.6”>“Jiefangzhong”>“Changhong”>“Baili”. Seven phenolic compounds,including 3-Caffeoylquinic acid,4-Caffeoylquinic acid,5-Caffeoylquinic acid,epicatechin,Caffeic acid,ellagic acid and ferulic acid were identified from loquat fruits. The content of phenolic in different cultivars varied significantly. Among those compounds,3-caffeoylquinic acid showed the highest content followed by 5-caffeoylquinic acid and 4-caffeoylquinic acid,which showed a marked positive correlation with antioxidant capacity. The content of 3-chlorogenic acid in the five varieties reached a significant level.

loquat;cultivars;antioxidant capacity;phenolic contents;3-Caffeoylquinic acid

2016-03-11

林素英(1979-),女,碩士,講師,研究方向:天然產(chǎn)物化學與化學生物學,E-mail:linsuying@ptu.edu.cn。

吳錦程(1965-),男,大學本科,教授,研究方向:果實采后生理生化,E-mail:wjc2384@163.com。

福建省教育廳資助項目(JA13282);莆田學院大學生創(chuàng)新項目(201511498030);福建省科技計劃重點項目(2011N0028)。

TS255.4

A

1002-0306(2016)18-0149-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.020